Перспективы развития и использования микроигольных технологий в лабораторных медицинских исследованиях и лечебной практике

В России для диагностики 'заболеваний человека ежегодно выполняется порядка 60 млн. анализов крови [Лин, Соколова, 20I2J. Темп прироста анализов ежегодно составляет 15—18%. Существующие традиционные технологии предусматривают отбор биоматериала (крови) для исследований с помощью инъекционной типы что обусловливает травматичность, негативное психологическое воздействие риск инфицирования (до 30%), необходимость выполнения процедуры в лицензированных медицинских учреждениях обученным персоналом. значительные 'затраты на утилизацию расходных материалов (на I шприц ценой 4 руб. расходы составляют около 9 руб.) [Haqetal.,2(M)9J

Одним из способов решения данной проблемы является отбор подкожной интерстициальной жидкости (высокоинформативного биоматериала) с помощью микроигольных аппликаторов для по-

(С Зайцева Н. В., Устинова О. Ю., Звездин В. Н., Акафьева Т. И.; 2015

следующих аналитических исследований в целях диагностики заболеваний человека* в том числе ассоциированных с воздействием химических факторов среды обитания* Разработка и внедрение в практическое использование микроигольной технологии обеспечит: повышение эффективности ранней диагностики ряда заболеваний. контролируемых иммунной системой* повышение точности ряда методов лабораторной диагностики (- 45%) в связи с устранением традиционных ошибок при отборе крови и пробоподготовке* расширение спектра биохимических и иммунологических аналитических исследований в микроколичестве био-субстрата* частично заменить традиционный инструмент для отбора биоматериала (инъекционную иглу) на безопасный для человека* минимизировать затраты на утилизацию инструментов и на приобретение расходных материалов. В связи с этим разработка и апробация микроигольных аппликаторов представляет собой перспективное направление исследований в области биомедицинских технологий. ОТНОСЯЩИХСЯ К «ЖИВЫМ системам» в соответствии с приоритетными направлениями развития науки, техники И технологий* утвержденных президентом РФ [Приоритетные **. . 2006]*

В настоящее время в научной литературе представлена информация о различных способах изготовления и использования микроигольных аппликаторов* При всей разрозненности и широкой направленности предлагаемых подходов с использованием микроигл мировое научное сообщество все больше отмечает перспективность данного направления неоспоримый инновационный характер и востребованность для практического использования*

Изучение проблемы производства и использования различных вариантов микроигольных устройств для медицинских целей активно стало проводиться с 1998 г* в технологическом институте Джорджии, на факультете химической и биомолеку лярной технологии (Атланта. США)* Коллективом авторов был детально изучен вопрос преодоления биологических барьеров, в том числе при пенеграции кожного покрова с помощью микроигл [Prausnitz* Allen* Gujral* 1998]. Использование прочных игл высотой до 600 мкм обеспечивало пенетрацию кератинового слоя кожи, при этом за счет малой глубины проникновения иглы не достигали нервных окончаний капилляров дермы* что обусловливало безболезненность и низкую вероятность инфицирования [Prausnitz. Allen* Gujral. 1998]*

Активно проводились исследования по разработке микроигольных устройств на основе различных материалов* С 1998 по 2014 гт. зарегистрирован ряд патентов на изобретение, касающихся спо собов пенеграции кожных покровов при помощи микроигл* изготовленных из металлов и полимеров [Prausnitz* Allen. Gujral* 1999; Petersson* Weber* 2000; Dalton* 2004; Fleming et al* 2002].

В последующем по своему функциональному назначению м икроигольные аппликаторы были разделены на две группы; для трансдермальной доставки лекарственных веществ и для отбора подкожной интерстициальной жидкости. В связи с этим микроиглы могут различаться по особенностям конструкции (полые и цельные)* по форме (пирамидальные* конические)* по используемым материалам (металлические* полимерные, сочетание полимеров и металлов) [Зайцева и др * 2012].

К настоящему времени м икроигольные аппликаторы широко применяются как средство переноса молекул через ткани для доставки лекарственных препаратов. В первую очередь, эго касается доставки вакцин [Sullivan et aL 2010]. Доказана клиническая эффективность данного способа по сравнению с «классическими методами»* так как предлагаемый подход не только безболезнен, но и обусловливает формирование более стойкой иммунной реакции [Pearton el al * 2010; Sullivan et al** 2010]. На территории США зарегистрированы вакцины от гриппа и полиомиелита, доставляемые в организм с помощью микроигл [Edensa el al** 2013; Pearion et al . 2010; Sullivan el al*. 2010]. Применение микроигольных устройств для вакцинации в программах массовой иммунизации (например* При Гриппе) ПОЗВОЛИТ расширить охват населения* снизить общую стоимость программ за счет сокращения затрат на медицинский персонал и утилизацию отходов* Проведенные исследования свидетельствуют о потенциальной возможности и перспективности использования м икроигольных устройств Б биомедицинских И ветеринарных технологиях жизнеобеспечения и зашиты человека и животных [Aroraa* Prausnitz* Milragolr* 2008; Suh* Shin* Kim. 2014]. Микроиглы широко применяются для введения инсулина, разработки в этой области ведут у ченые из Швеции [Hullslrbm* Roxhed* Nordquist* 2014] и США [Davis el al * 2005]. В Ирландии ведутся активные разработки по созданию кроссполимерных микроигл* позволяющих осуществлять доставку не только инсулина, но и кофеина и метронидазола [Donnelly el at. 2012]. Микро-игольные аппликаторы используют для введения лидокаина [Kochharet al* 2013].

Следующим этапом расширения возможностей применения микроигл является транскутанное введение транспортных наночастиц для целей адресной доставки лекарственных препаратов [Pegoraro* MacNeilb, Battaglia, 2012].

Исследования ряда авторов доказывают, что подкожная интерстициальная жидкость как биологический материал может являться достойной аль- тернативой сыворотке венозной крови для решения задач диагностики заболеваний человека [Paliwal et al., 2013]. Обоснован спектр биомаркеров и их метаболитов, уровень которых в подкожной интерстициальной жидкости сопоставим с уровнем в сыворотке крови [Wang, Cornwell. Prausnitz, 2005], что делает м икроигольные устройства востребованными для систем самодетекции и широкомасштабного скрининга [Sakaguchi et al., 2012]. Исследования в этом направлении развития микро-игольных технологий несколько отстают по сравнению с развитием технологий по доставке лекарственных веществ [Prausnitz el al.. 1998; Prausnitz. Allen. GujraL 1998; Faiz. 2001]. Разработчики сталкиваются co следующими проблемами: микроиглы должны быть прочными для пенетрирова-ния кератинового Слоя кожи, при этом их конструкция должна обеспечивать диффузию из ткани в аппликатор ПОДКОЖНОЙ интерстициальной ЖИДКОСТИ за короткое время и в должном объеме (не менее 5 мкл); необходимо предотвратить испарение жидкой фазы отобранного биоматериала с поверхности микроигольного аппликатора; обеспечить максимально эффективную экстракцию биоматериала непосредственно из аппликатора без внесения дополнительных факторов, влияющих на тон-ность анализа [Романюк и др.. 2013].

Конструирование м икроигольных аппликаторов для извлечения биосу бстратов является технически более сложным процессом по сравнению с микроиглами для доставки лекарств и требует привлечения большого количества методов микропроизводства и химической инженерии [Park et al., 2007; Kim. Park. Prausnitz. 2012]. Необходимо учитывать изменение свойств материалов и полимеров в м икроразмерном состоянии, а также контролировать отбор материалов и составляющих их компонентов на биосовместимость и безопасность для человека. Первые разработки в этой области были направлены на создание полых металлических игл с использованием методов наклонной ультрафиолетовой литографии, микроштамповки И КИСЛОТНОГО травления [Davis et al.. 2005]. Негативный момент заключался в следующем: несмотря на то. что микроиглы эффективно проникали через кератиновый слой кожи, они частично забивались фрагментами ткани. Для ускорения процесса отбора подкожной интерстициальной жидкости на м икроигольный аппликатор накладывали дополнительные вакуумные аппликаторы, которые давали желаемый эффект, но делали всю систему отбора громоздкой и малопроизводительной [Prausnitz. Allen, GujraL 1998; Davis et al., 2005].

Помимо вакуумного отбора через полые металлические микроиглы используются полимерные водорастворимые материалы, одним из которых является карбоксиметилцеллюлоза [Lee. Park.

Prausnitz, 2008]. Такие иглы изготавливаются преимущественно методом микроштамповки. В экспериментах in vitro установлено, что данные микроиглы правильной пирамидальной формы обладают достаточной жесткостью и упругостью, чтобы надежно, с вероятностью 100%, проникать через кератиновый слой свиной кожи и входить в эпидермис. Через 3 сек. после введения на концах микроигл отмечается растворение, но процесс всасывания жидкости требует больших затрат времени, так же установлен эффект выдавливания микроигл из кожи [Романюк и др.. 2013]. В связи с Этим данный тип микроигл не позволяет их использовать для отбора подкожной интерстициальной жидкости, но имеет перспективные возможности применения б косметологии и эстетической медицине в качестве компонента имплантов и филлеров [Quan. 2007].

Для решения проблемы, связанной с медленной диффузией подкожной интерстициальной жидкости в микроигольный аппликатор, группа ЯПОНСКИХ исследователей, создавая систему малоинвазивной детекции глюкозы в интерстициальной подкожной жидкости, применила последовательно прокалывание КОЖИ нерастворимыми пластиковыми микроиглами с последующим наложением на это место гидрогеля, обеспечивающего адсорбцию биоматериала [Sakaguchi el al.. 2012]. Измерение уровня глюкозы при помощи м икроигольных технологий так же достигалось применением полых микроигл СО встроенными датчиками [Petersson, Weber, 2000]. Существенным недостатком данного метода является высокая стоимость по сравнению с «традиционными методиками». На данном этапе наиболее перспективным является применение цельных микроигольных аппликаторов на основе кроссполимеризированного гидрогеля [Романюк и др.. 2013], ранее апробированных в доклинических И клинических исследованиях, выполненных учеными из Ирландии и России [Donnelly el al., 2012. Землянова, Звездин. Праузнитц, 2014].

В России к настоящему времени выполнен ряд доклинических исследований эффективности прототипа м икроигольного аппликатора, позволяющего отбирать подкожную интерстициальную жидкость [Зайцева и др.. 2012; Романюк и др.. 2013]. По своим характеристикам прототип микроиголь-ного аппликатора представляет собой пластинку размером 1 * 1 см. на поверхности которой размещено 100^10 микроигл пирамидальной формы. Каждая микроигла размером 200-300 мкм в основании. с острием менее 3 0 мкм и длиной 500-1000 мкм. В качестве исходного материала для микроигл использован полиметилвиниловый эфир малеиновой кислоты и полиэтиленгликоль 10 кДа [Романюк и др.. 2013]. Способ применения заклю- чается в следующем; после нанесения микроголь-ного аппликатора на кожу предплечья человека в течение 15 мин. микроиглы путем осмодиффузии впитывают до 5 мкл подкожной интерстициальной жидкости. которая в дальнейшем извлекается с помощью буферного раствора, фильтруется и используется для анализа в целях диагностики заболеваний [Романюк и др.. 2013].

В рамках выполнения доклинических исследований in vitro и in vivo по обоснованию перечня биохимических показателей и методов исследования подкожной интерстициальной жидкости установлено. что уровень альбуминов в подкожной интерстициальной жидкости в среднем составил 13.3 г/дм³ и достоверно отличался от уровня данного показателя в сыворотке крови в 2.3 раза (р<0.05). При этом установлена корреляционная связь содержания данного показателя в подкожной интерстициальной жидкости и б сыворотке крови (г=0.64). Уровень содержания глюкозы и натрия в подкожной интерстициальной жидкости имел достоверную зависимость от уровня содержания в сыворотке крови (г=0.83-0.89). Полученные данные подтверждают результаты, представленные в работе японских авторов К. Sakaguchi el all [2012]. Уровень глюкозы в подкожной интерстициальной жидкости имел большую вариабельность по сравнению с аналогичным показателем в сыворотке крови. Полученные данные свидетельствуют о перспективности применения данной технологии для мониторинга уровня глюкозы пациентами с сахарным диабетом. Установлено, что уровень содержания мочевины в подкожной интерстициальной жидкости и сыворотке крови не отличается и имеет достоверную линейную корреляционную зависимость (г=0.88). Уровень хлоридов в подкожной интерстициальной жидкости в 2.7 раз превышал содержание в сыворотке крови, но имел достоверную корреляционную зависимость от содержания в сыворотке крови [Землянова. Звездин. Праузнитц. 2014]. Обоснованный перечень биохимических показателей использован при апробации в клинических исследованиях по оценке эффективности применения м ИКрОИГОЛЬНЫХ аппликаторов для задач диагностики заболеваний человека.

На данном этапе развитие технологии микро-игольных аппликаторов, используемых для исследования биохимических показателей, направлено на повышение скорости и объема подкожной отбираемой интерстициальной жидкости. По результатам собственных исследований существующие аналоги, содержащие 100 микроигл высотой 300 нм диаметром 0.1 мм, позволяют отбирать 1.2±0.2 мкл подкожной интерстициальной жидкости.

Существующие прототипы МИКрОИГОЛЬНЫХ аппликаторов позволяют осуществлять транскутанную доставку лекарственных препаратов, широко масштабную вакцинацию населения. Развитие микроигольных технологий для решения задач исследования биохимических маркеров в перспективе может позволить частично заменить традиционно используемую для диагностики сыворотку крови на подкожную интерстициальную жидкость, что может обеспечить более эффективный мониторинг состояния пациентов с такими заболеваниями как сахарный диабет и аллергический дерматит. Позволит повысить эффективность выполнения обязательных и дополнительных диагностических исследований при реализации профилактических программ и проведении диспансеризации населения и работающих. Возможно применение данной технологии для определения уровня содержания в ПОДКОЖНОЙ жидкости металлов, в том числе при ИХ экзогенном поступлении в организм. Это поможет расширить популяционную выборку обследуемых при выполнении процедуры опенки риска для здоровья. обусловленного внешнесредовой экспозицией химических факторов, на этапе установления зависимости «экспозиция - маркер экспозиции», «маркер экспозиции - маркер эффекта». Использование микроигольных технологий может расширить спектр лабораторных биологических маркеров за счет исследования компонентов подкожной интерстициальной жидкости. Микроигольные технологии могут сделать более доступным внедрение в профилактическую медицину современных методов аналитической лабораторной диагностики, в том числе для решения проблем в области экологии человека; позволят реализовать инновационные подходы в рамках развития биотехнологий для целей оказания специализированной помощи населению, что декларируется в программе развития научных направлений исследований в здравоохранении России до 2025 г. [Прогноз .... 2007].

Работа выполнена при финансовой поддержке министерства образования Пермского края проекта международной исследовательской группы «Микроигольные технологии - будущее диагностики».