Перспективы развития проростковой селекции люпина

поколений – от гибридного до конкурсного сортоиспытания в полевых условиях по комплексу биологических и хозяйственно полезных признаков в зависимости от критериев модели создаваемого сорта. Полевые испытания дополняются результатами биохимических, технологических, фитопатологии-ческих и других оценок. Но объективность полевых испытаний, а, следовательно, и других оценок нередко искажается из-за направленности и напряжённости действия экологических стрессоров -метеорологических аномалий, масштабов распространения возбудителей грибных, бактериальных, микоплазменных, вирусных болезней, численности и степени вредоносности энтомофауны и многих других факторов. Поэтому для повышения корректности таких оценок применяют наряду с прямыми различные косвенные испытания. Косвенные испытания, особенно с использованием экспресс-методов позволяют оценивать значительно больший, чем в поле, объём материала на ранних этапах селекционного процесса и тем самым сократить напряжённость трудоёмких работ в вегетационный период, и в итоге ускорить процесс создания нового сорта. К таковым относится и выявление ответных реакций прорастающих семян на дозированное действие неблагоприятных факторов.

Суть « проростковой » селекции заключается в оценке селекционного материала по степени развития проростков , формирующихся в водной культуре с различной концентрацией ограничивающих факторов .

Наиболее эффективно проращивание семян в бумажно - полиэтиленовых рулонах . Впервые рулонный способ проращивания семян предложил H. Germ в 1949 году в Германии – стране , где и зародился семенной контроль [1,2]. Вскоре этот метод был прочно забыт , но в начале 70- х годов прошлого столетия он был реанимирован отечественными семеноведами [3,4,5,6]. Вскоре популярность этого способа стала стремительно расти и в современных Международных правилах испытания семян проращивание между бумагой (between paper), а также и в российских стандартах на методы определения посевных качеств семян он распространён на многие культуры .

Вначале подготовка рулонов была несколько громоздкой , для обеспечения аэрации семян использовалась коррексовая лента , применяемая в прежние годы в фотографии . Ныне – новые технологии и коррекс забыт и не выпускается . Возникли новые модификации [7]. Современная его пропись имеет следующий вид :

На полосу полиэтиленовой плёнки размером 16 х 100 см ( после дезинфекции её можно использовать многократно ) накладывают полосу фильтровальной бумаги таких же размеров и увлажняют её . Вдоль стартовой линии , заранее проведённой на расстоянии 5 см от верхнего края полосы , раскладывают 100 семян ( или 50 для крупносемянных культур ), ориентируя зародышем или микропиле вниз . Сверху семена накрывают вдвое сложенной неширокой (4-5 см ) предварительно увлажнённой фильтровальной бумагой . Затем , придерживая верхний слой бумаги , легко , без нажима сворачивают рулон , который нижним концом устанавливают в сосуд с водой , налитой слоем 2-2,5 см .

Преимущество рулонного способа проращивания семян перед другими (на и в песке, на бумаге, использование сложного ложа) заключается в обеспечении оптимального и стабильного на протяжении всего периода прорастания режима увлажнения ложа, поскольку фильтровальная бумага впитывает воду только в пределах своей влагоёмкости. Постоянный приток воды исключает необходимость постоянного контроля за увлажнением ложа, который обязателен при проращивании семян на других ложе. Благоприятные условия прорастания способствуют ускоренному развитию проростков – все их существенные структуры полностью формируются у люпина жёлтого на пятые сутки, узколистного – на четвёртые. По стандартным методикам продолжительность проращивания семян при определении их всхожести составляет 10 и 7 суток соответственно. Кроме того, росток и главный корень развиваются в соответствии с генетически детерминированными тропизмами - корень углубляется вниз по профилю рулона, росток, наоборот, устремляется вверх. Проростки не соприкасаются друг с другом, а, следовательно, исключается возможность контактного перезаражения болезнями.

Кроме совершенствования технических условий проращивания семян существенное значение имеет уточнение критериев оценки проростков . Диапазон морфологических и физиологических различий у развивающихся проростков очень широк . Степень развития проростков следует рассматривать как интегральный , легко регистрируемый показатель , отражающий особенности физиолого - биохимических процессов , вызывающих и сопровождающих прорастание семян . В дифференциации по степени развития проростков отражаются не только их внешние различия , но и скрываются внутренние особенности органообразовательных процессов . Многократная тщательная оценка проростков большого генетического разнообразия люпина позволила разработать пятибалльную шкалу оценки степени развития нормальных проростков этой культуры [8].

• 5 баллов – длина гипокотиля равна или превышает 5 см , зародышевого корня – не менее 7 см ;

• 4 балла – длина гипокотиля не менее 2,5 см , зародышевого корня – 5 см и более ;

• 3 балла – длина гипокотиля от 1 до 2,5 см , зародышевого корня – не менее 2,5 см ;

• 2 балла – длина гипокотиля не менее 1 см , зародышевого корня – больше двух диаметров семени ;

• 1    балл – длина гипокотиля не менее половины диаметра семени , зародышевого корня – не менее диаметра семени .

Нижние критерии оценки проростков ( первого балла ) соответствуют стандартным требованиям к нормально проросшим семенам при определении их всхожести . Ещё ранее такой же принцип был положен в основу морфофизиологической оценки проростков по степени развития их существенных структур для пшеницы , ржи , тритикале , ячменя , овса , кукурузы , сорго , суданской травы , гороха , нута , чины , сои , подсолнечника в целях совершенствования методов определения посевных качеств их семян . При этом для каждой культуры была уточнена технология проращивания семян в рулонах [9].

Позже рулонный способ проращивания семян стал применяться и для оценки селекционного материала, прежде всего по его устойчивости к грибным болезням [10]. К люпину этот способ был адаптирован во ВНИИ люпина [11]. В настоящее время он широко применяется в институте для масштабной лабораторной оценки селекционного материала по степени устойчивости к антракнозу в условиях определённого титра возбудителя болезни Colletotrichum lupini [12].

Экспресс - оценка устойчивости селекционного материала люпина к антракнозу состоит из следующих этапов : выделение возбудителя в чистую культуру – размножение его на питательной среде – приготовление рабочего инокулюма – подготовка и заражение семян – оценка проростков по степени поражения болезнью .

Возбудитель антракноза люпина выделяется из поражённых органов и их частей ( стеблей , створок бобов , семян ), с характерными для этой болезни признаками . Небольшие кусочки поражённого органа поверхностно стерилизуются в пламени спиртовки и переносятся во влажную камеру – чашку Петри . На дно нижней чашки , выстланное увлажнённой фильтровальной бумагой , помещается предметное стекло , на котором раскладываются кусочки поражённых тканей ( соблюдая все условия стерильности ). Чашки помещаются в термостат при оптимальной для развития возбудителя температуре +22 ^оС . Спустя трое суток налёт конидий переносится ( методом штриховой разводки ) на агаризованную картофеле - глюкозную среду ( КГА ) и выращивается при температуре +22-23 ^оС . В течение двух недель гриб полностью покрывает внутреннюю поверхность чашки Петри . Суспензия рабочего инокулюма готовится на дистиллированной воде – для инокуляции семян жёлтого и белого люпина из 2- х недельной культуры , а для узколистного – 3- х недельной ( не менее ). Рабочий инокулюм , концентрация которого для всех видов люпина составляет 60-70 конидий ( в поле зрения микроскопа х 125), используется сразу же после его приготовления .

Подготовка семян ( не менее 30 шт .), испытуемых на антракнозоустойчивость образцов , заключается в их стерилизации в 90-96 % спирте в течении 3 минут , после чего они тщательно промываются (3- х кратно ) в дистиллированной воде , а затем погружаются в рабочий инокулюм . Расход инокулюма 5 мл для жёлтого и узколистного люпинов , и 7 мл для белого люпина на 30 штук семян ( семена должны быть полностью покрыты ). Время выдерживания – 1,5 минуты . После чего инокулюм сливается , а семена закладываются в бумажно - полиэтиленовые рулоны . Рулоны устанавливаются в стерильные сосуды с дистиллированной водой слоем 2-3 см . Сосуды с рулонами помещаются в термостат с постоянной температурой +23 ^оС на 4 дня , после чего они переносятся на стеллажи под люминесцентные лампы , где выдерживаются при температуре +18-20 ^оС – 4 дня узколистный , 6 дней жёлтый и белый люпин .

По истечении указанных сроков проводится учёт развития болезни на проростках. Поочерёдно разворачиваются рулоны , осматривается каждый проросток и определяется степень поражения его антракнозом по пятибалльной шкале:

0 – поражение отсутствует ;

• 1    – на ростке светло - коричневые в виде штрихов некрозы ;

• 2    – на ростке : а ) язва без разрыва , охватывающая до ½ его окружности ; б ) на семядоле маслянисто бурое пятно ; в ) увядание развивающихся листьев ;

• 3    – на ростке язва с разрывом , охватывающая 2/3 его окружности ;

• 4    – а ) язва охватывает всю окружность ростка ; б ) мацерация тканей стебля ; в ) гибель проростка .

Развитие болезни определяется по формуле :

∑ ( ab )*100

R = NK где R – интенсивность развития болезни (%), ∑(ab) – сумма произведений числа растений на соответствующий им балл поражения, N – общее количество учётных растений, К – наивысший балл поражения шкалы учёта.

В зависимости от балла поражения и вычисленной на его основе интенсивности развития болезни определяется степень устойчивости , и согласно унифицированному классификатору сортообразцы подразделяются на 5 групп :

Таблица – Ш кала устойчивости люпина к антракнозу (на стадии проростков)

Развитие болезни, %	Степень устойчивости	Группа
до 10	очень высокая	1
10-30	высокая	2
31-50	средняя	3
51-75	низкая	4
76-100	очень низкая	5

Наиболее востребованным и самым перспективным в настоящее время направлением селекции люпина , да и не только , а наверное , и всех других возделываемых культур , является экологическая селекция [13]. Это направление селекции многогранно , в т . ч . и упомянутое выше . Во многих других его аспектах для лабораторной экспресс - оценки селекционного материала может оказаться пригодной « проростковая селекция ».

Некоторые примеры :

• -    Эдафическая селекция . Полевые культуры в России , да и не только в нашей стране , размещаются на малопригодных , несоответствующих их биологии , землях . К таким относятся кислотные , засолённые почвы , а также с высоким содержанием тяжёлых металлов , других полютантов и прочих . Люпин – активный фитомелиорант , но и для этого необходимы специфические сорта . Поэтому для предварительного отбора из современного генофонда будет полезен морфофизиологический метод оценки проростков . В этих целях семена разных генотипов следует проращивать при определённой ( а лучше при разной ) концентрации солей , кислот , полютантов в водном растворе .

• -    Морфофизиологическая оценка проростков может быть вполне применима для определения действия химических мутагенов и их доз . К тому же морфологически изменённые проростки могут использоваться как импланты для каллусогенеза . Многократным пассированием и последующей регенерацией может быть получен принципиально новый исходный материал для селекции .

К возможностям морфофизиологической оценки проростков можно добавить и выявление реакции на почвенные гербициды , протравители семян в разных дозах этих пестицидов .

• -    Фитоценотическая селекция . В современном кормопроизводстве , а в будущем можно предположить и в растениеводстве в целом , вновь обосновывается целесообразность не только расширения смешанных посевов , но и возврата к поликультуре . Для конструирования сложных агрофитоценозов необходимы не только совместимые культуры , но и наиболее комплементарные их сорта . Одним из механизмов такой комплементарности служит явление аллелопатии . Выявить взаимовлияние корневых выделений на начальный период развития культур - компонентов также можно морфофизиоло гической оценкой проростков . Для этого семена разных культур перемежаются при их закладке в рулоны . Степень взаимовлияния выявляется в сравнении с развитием проростков одновидовых культур при проращивании их семян в аналогичных условиях .

Перечисленным вряд ли ограничиваются возможности морфофизиологической оценки проростков . Расширение использования этого метода позволит значительно сократить объёмы полевых испытаний , повысить эффективность селекции , приблизить её к созданию сортов разных направлений хозяйственного использования .