Первое сообщение о листовой пятнистости томата, вызванной видом Cladosporium sphaerospermum

Для выделения гриба собирали не менее пяти растений каждого из десяти сортообразцов с начальными симптомами кладоспориоза. Пораженные ткани листа на границе пораженного и здорового участков разрезали на несколько сегментов размером 2x3 мм, подвергали поверхностной стерилизации в 70 % этаноле, трижды промывали в стерильной воде, высушивали в ламинаре, помещали на картофельно-декстрозный агар (PDA) («Jinan Babio Biotechnology Co., Ltd.», Китай) и инкубировали при 25 ° C.

Если на растительном материале начиналось спороношение, споры переносили стерильной микробиологической петлей на чашки Петри с PDA. Каждую выросшую изолированную колонию гриба переносили на новую чашку для выделения чистой культуры изолята, а затем получали мо-носпоровые колонии по стандартной методике (15, 21).

Микро- и макроморфологические характеристики оценивали при культивировании гриба на питательных агаризованных средах Чапека-Докса («HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.», Индия), PDA, PDA с добавлением отвара листьев крапивы двудомной Urtica dioica L. (PDA net ) и PDA с добавлением отвара листьев томата Sol a num lycop e rsicum L. (PDA tom ). Культуру гриба первые 3 сут культивировали при 25 ° C в темноте, далее 8-10 сут — при световом дне 16 ч и темной фазе 8 ч.

Морфологию колоний, появление пигментации и скорость роста колоний гриба оценивали ежедневно, фиксируя время изменения признаков. Диаметр колоний измеряли в двух поперечных направлениях для трех одновременных посевов до разрастания колоний по всей поверхности питательной среды в чашке Петри.

По результатам всех измерений рассчитывали средние значения ( М) , стандартное отклонение (±SD), среднюю скорость роста Vr (мм/сут) по формуле: Vr = (R 1 - R 0)/( t 1 - t 0) , где R 1 — радиус колонии в конце роста, мм; R 0 — радиус колонии в начале фазы линейного роста, мм; t 1 - t 0 — продолжительность линейной фазы роста, сут.

Микроизображения гриба были получены с помощью микроскопа Axio Lab A1 («Zeiss», Германия) и программного обеспечения ADF Image Capture («ADF Optics Co. Ltd.», Китай).

Тотальную ДНК выделяли из мицелия гриба возрастом 7-12 сут с помощью набора К-Сорб (НПК «Синтол», Россия) согласно протоколу фирмы-производителя. Концентрацию ДНК определяли при X = 260 нм с помощью UV/Vis NanoPhotometer P300 («Implen GmbH», Германия). Чистоту выделенной ДНК оценивали по отношению OD 260 / 280 .

Для видовой идентификации использовали последовательность внутреннего транскрибируемого спейсера, амплифицированную праймерами ITS5 (5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3') и ITS4 (5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'). Реакционная смесь для амплификации содержала 2,5 мкл 10x ПЦР-буфера, 5-10 нг тотальной ДНК, 2,5 мкл 2,5 мкМ dNTP, по 10 пмоль каждого праймера, 1 ед. Taq ДНК-полимеразы (ОАО «Евроген», Россия), до 25 мкл стерильной воды. Амплификацию ДНК проводили в термоциклере MJ Research PTC-200 («Bio-Rad», США). Программа амплификации была следующей: 3 мин при 94 ° С; 30 с при 94 ° С, 30 с при

56 ° C, 1 мин при 72 ° C (33 цикла); 5 мин при 72 ° C (заключительная элонгация).

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 1,5 % агарозном геле с 1х ТАЕ (Tris-acetate-EDTA) в присутствии бромистого этидия (10 мг/мл) в камере для горизонтального электрофореза Sub Cell GT («Bio-Rad», США). Длину амплифицированных фрагментов ДНК определяли с помощью маркера молекулярной массы М-100 (НПК «Син-тол», Россия). Результаты визуализировали с помощью трансиллюминатора ECX-M («Vilber Lourmat Deutschland GmbH», Германия) и документировали, используя систему «Взгляд» («Хеликон», Россия). Для определения нуклеотидной последовательности ПЦР-продукт очищали от реакционной смеси с помощью набора ColGen (НПК «Синтол», Россия) и секвенировали на анализаторе ABI PRIZM 3130xl («Applied Biosystems», США) в двух повторностях.

Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями из баз данных GenBank NCBI и Mycobank . Для филогенетического анализа использовали программу MEGA X .

Десять моноспоровых изолятов гриба были использованы для определения их патогенности на растениях томата с целью выполнения постулатов Коха.

Вирулентные свойства наиболее патогенного изолята С-М-24-4 C. sphaerospermum изучали на 10 линиях томата селекции ФГБНУ ФНЦО: VS-HM-51-24 (Л-24/25), VS-HM-50-24 (Л-25/25), VS-HM-73-24 (Л-26/25), VS-HM-71-24 (Л-27/25), VS-HM-58-24 (Л-28/25), VS-HM-75-24 (Л-29/25), VS-HM-300-24 (Л-30/25), VS-HM-189-24 (Л-31/25), VS-HM-206-24 (Л-2/25) и VS-HM-275-24 (Л-12/25). Опыт проводили в лабораторном вегетационном боксе в 3-кратной повторности ( n = 3), по 10 растений каждой линии в одной повторности по полной рандомизированной схеме. В качестве стандарта устойчивости (St R) к кладоспориозу использовали линию томата селекции ФГБНУ ФНЦО для защищенного грунта VS-HM-193-19 (Л-15/25), стандарта восприимчивости (St S) — линию VS-HM-15-19 (Л-16/25). Все использованные линии, а также St R и St S проявили неодинаковую интенсивность поражения в течение трех лет при испытании в условиях защищенного грунта в Mосковской области.

При искусственной инокуляции использовали растения томата в возрасте 4-5 настоящих листьев, которые заражали посредством распыления 30 мл суспензии конидий (106 конидий/мл) на нижнюю сторону листьев. После высыхания инокулюма растения помещали в вегетационный бокс на стеллажи. В течение первых 2 сут поддерживали относительную влажность 100 %, затем ее снижали до 85 % Зараженные растения инкубировали в течение 21 сут при 12-часовом световом дне и интенсивности освещения 12 тыс. лк.

Развитие кладоспориоза на листьях томата оценивали через 14 и 21 сут после инокуляции. Поражение кладоспориозом оценивали визуально согласно стандартной четырехбалльной шкале (22) с модификацией: 0-0,1 балла — поражение отсутствует; 0,5 балла — отдельные светлые пятна без спороношения гриба; 1 балл — хлоротичные пятна на единичных листьях без спороношения; 2 балла — пятна на 50 % листовой поверхности, слабое спороношение; 3 балла — пятна на 51-100 % листовой поверхности, сильное спороношение.

На основании результатов оценки, проведенной в динамике, рассчитывали средний индекс поражения (I), а также степень развития болезни 914

(R, %) и степень распространения болезни (Р, %) по следующим формулам: R = {[ ^ (число пораженных растений х соответствующий балл)]/(наивысший балл х общее число проанализированных растений} х 100, %; р = (число пораженных растений/общее число проанализированных растений) х 100, %. На основании этих показателей образцы дифференцировали на высокоустойчивые — ВУ (0 < I <  0,4), толерантные — Т (0,5 < I <  1,0), средневосприимчивые — СВ (1,1 < I <  2,0), высоковосприимчивые — ВВ (2,1 < I <  4,0).

Для проведения статистического анализа полученных данных использовали программы Microsoft Excel 2016 («Microsoft Corporation», США) и Statistica 7.0 («StatSoft, Inc,», США). Значимость различий реакции растений томата в опытных и контрольных вариантах, а также относительно St R и St S определяли с использованием теста Дункана с доверительной вероятностью 95 % (р <  0,05).

Результаты . В 2023 и 2025 годах наблюдалось наиболее сильное развитие кладоспориоза (до 100 % в зависимости от образца), а в 2024 году отмечали умеренное развитие болезни, ее распространение по всей выборке обследованных растений не превышало 36 %.

Первичные симптомы кладоспориоза на томате в условиях теплицы проявлялись на листьях нижнего яруса в виде бледно-зеленых пятен с неровными краями, и при наличии необходимых условий для заражения через 5-7 сут с дорсальной стороны листьев отмечалось спороношение гриба в виде коричневого налета (рис. 1, а, б). У сильновосприимчивых образцов наблюдались также крапчатость, усыхание листовой пластины с периферийной части листа (см. рис. 1, в). Всего за период исследования из пораженных кладоспориозом растений было выделено 10 изолятов гриба . При искусственном заражении эти изоляты вызывали схожие симптомы на тестируемых растениях восприимчивых образцов (см. рис. 1, г-е).

Рис. 1. Симптомы кладоспориоза на растениях томата ( Solánum lycopérsicum L.) восприимчивой линии VS-ИМ-15-19 (Л-16/25): а — первичные симптомы, б — наличие спороношения, в — нпоздние стадии развития болезни (условиях защищенного грунта), г-е — при искусственном заражении Cladosporium sphaerospermum в вегетационном боксе (Московская обл., 2025 год).

Для определения видовой принадлежности полученных 10 оригинальных изолятов и 4 реизолятов из искусственно зараженных растений применяли метод анализа полиморфизма первичной структуры ДНК в локусе ITS (internal transcribed spacer), широко применяемый в филогенетическом анализе. Для этих целей были использованы праймеры ITS5 и ITS4 (23). Полученные последовательности ITS сравнивали с последовательностями этого локуса у разных видов рода Cladosporium из баз данных GenBank NCBI и Mycobank.

Для всей изученной выборки изолятов последовательности локуса ITS были идентичны. Результаты сравнения представлены на рисунке 2 в виде дендрограммы на примере типичного изолята C-M-24-4 (регистрационный номер в GenBank NCBI PX276843). Последовательность ITS C-M-

24-4 была на 100 % гомологична референсной последовательности штамма C. sphaerospermum KX928840 и вошла в общий кластер. Интересно отметить, что последовательность локуса ITS у вида Fulvia fulva ( С. fulvum ) — классического возбудителя кладоспориоза томата обладала наибольшими различиями с последовательностью изучаемого изолята (менее 86 % гомологии).

Рис. 2. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей ITS локуса у разных видов рода Cladosporium и полученного изолята выполненный с помощью программы MEGA X ( метод UPGMA, бутстреп 1000). Последовательности взяты из базы данных GenBank NCBI, в скобках указаны их регистрационные номера. Исследуемый в этой работе изолят обозначен C-M-24-4 (регистрационный номер в GenBank NCBI PX276843).

Колонии возбудителя кладоспориоза, выращенные на PDA tom , PDA, PDA net , были оливково-зеленого цвета, на среде Чапека-Докса — более темного цвета, уплощенные, с радиальными бороздами (рис. 3, а-г). Форма конидий C. sphaerospermum варьировала от эллипсоидной до слегка изогнутой, число перегородок 0-2 (рис. 3, д-з). Размер конидий на PDA tom составлял (6,67±2,49)х(3,0±0,75) мкм; на PDA — (6,17±1,69)х(3,51±1,14) мкм; на PDA net — (6,34±0,79)^х(4,02±0,37) мкм и на среде Чапека-Докса — (4,08±0,44)х(2,87±0,87) мкм.

Рис. 3. Колонии (верхний ряд) и конидии (нижний ряд) Cladosporium sphaerospermum , вызывающего кладоспориоз томата в условиях защищенного грунта в Московской области, при культивировании на разных агаризованных средах: а, д — на PDA tom (PDA с добавлением экстракта листьев томата); б, е — PDA; в, ж — на PDA net (PDA с добавлением экстракта листьев крапивы двудомной); г, з — на среде Чапека-Докса (микроскоп Axio Lab A1, «Zeiss», Германия) .

При культивировании на средах Czapek-Dox, PDA, PDA net и PDA tom была выявлена значительная разница в скорости роста мицелия гриба C. sphaerospermum (рис. 4).

Рис. 4. Динамика роста колоний Cladosporium sphaerospermum , вызывающего кладоспориоз томата в условиях защищенного грунта в Московской области, на разных агаризованных средах: 1 — среда Чапека-Докса, 2 — PDA (картофельно-декстрозный агар), 3 — PDA net (PDA с добавлением экстракта листьев крапивы двудомной), 4 — PDA tom (PDA с добавлением экстракта листьев томата).

Изменение линейного скорости роста мицелия (Vr) гриба на испытанных средах варьировала от самой высокой на PDA tom (7,0 мм/сут) до самой низкой на среде Чапека-Докса (4,8 мм/сут). Добавление в питательную среду PDA сока крапивы (PDA net ) увеличивало скорость роста гриба на 1,3 мм/сут, сока томата (PDA tom ) — на 1,8 мм/сут. Время полного зарастания поверхности питательной среды в чашке Петри в зависимости от среды составила от 14 сут (PDA tom ) до 27 сут (среда Чапека-Докса). Отличался рост гриба на анализируемых средах и по сроку наступления лаг-фазы. При культивировании гриба на среде Чапека-Докса наступление лаг-фазы отмечали только на 9-е сут, на среде PDA tom — на 6-е сут. Следовательно, наиболее предпочтительной для культивирования C. sphaerospermum была питательная среда PDA tom .

На основе полученных результатов молекулярного филогенетического анализа и морфологических признаков чистых культур мы пришли к выводу, что выделенные из растений томата изоляты принадлежат к виду C. sphaerospermum . Исходные изоляты и реизоляты гриба были идентичны по последовательности ITS и по всем изученным морфологическим признакам. Таким образом, мы выполнили условия постулатов Коха и впервые подтвердили, что C. sphaerospermum становится возбудителем кладоспорио-оза томата на территории Российской Федерации.

Десять изолятов гриба были включены в исследование агрессивности посредством заражения растений восприимчивой линии томата in vivo. Изучение динамики развития болезни на растениях выявило различия между анализируемыми изолятами C. sphaerospermum в сроках появления первых симптомов. Динамика развития болезни по всей совокупности изолятов в течение анализируемого периода носила экспоненциальный характер. У 7 изолятов появление хлоротичных пятен было отмечено уже на 10е сут (I = 0,5-2 балла), у остальных — на 13-е сут, а на 16-е сут средний индекс поражения у всех изолятов составил от 2,5 до 4,0 баллов. Среди них наибольшую агрессивность проявил изолят C-M-24-4, который был включен в дальнейшие исследование на более широком наборе линий томата с различной полевой устойчивостью (рис. 5).

Линия

Рис. 5. Вирулентность гриба Cladosporium sphaerospermum , вызывающего кладоспориоз томата в условиях защищенного грунта в Московской области, в отношении различных линий томата на 10-е (1) и 16-е сут (2) : ВУ — высокоустойчивые, Т — толерантные, СВ — средневосприимчивые, ВВ — высоковосприимчивые ( n = 3, M ±SD).

a-d Значения, отмеченные одинаковой буквой, не имеют статистически значимых различий при доверительной вероятности 95 % согласно тесту Дункана.

Изучение динамики развития болезни выявило различия между анализируемыми образцами томата в сроках появления первых симптомов. Первые признаки поражения у линий из толерантной, средне- и высоковосприимчивой групп, включая стандарт восприимчивости (St S), были отмечены уже на 10-е сут (I = 0,5-1,8 балла). При этом у средневосприимчивых (Л-27-25, Л-2/25 и Л-12/25) и восприимчивых (Л-24/25, Л-25/25 и Л-30/25) линий интенсивность развития болезни резко увеличивалась, и к последнему учету средний индекс поражения составил соответственно I = 1,41,8 балла (СВ) и I = 2,4-3,0 балла (ВВ). У двух линий (Л-28/25 и Л-29/25) толерантной группы, наоборот, после появления первых симптомов в дальнейшем заражение шло по типу реакции сверхчувствительности, и к моменту второго учета средний индекс поражения оказался ниже относительно первой оценки. Исследователи связывают это с тем, что белки-эффекторы, кодируемые генами устойчивости к патогену ( Cf -гены) в томатах, распознают специфические белки, кодируемые генами патогенной авиру-лентности ( Avr -генами), что и приводит к реакции сверхчувствительности при заражении растений видом С. fulvum (8-10).

На листьях двух линий (Л-31/25, Л-26/25) с высокой полевой устойчивостью симптомы кладоспориоза появились только на 16-е сут, индекс поражения был невысоким и составил 0,3-0,4 балла, что значимо не отличалось от стандарта устойчивости (St R) Л-15/25.

Таким образом, при лабораторной оценке мы выявили дифференциацию линий томата по степени устойчивости к кладоспориозу — от высокоустойчивых (I = 0,3 балла) до высоковосприимчивых (I = 3,0 балла), что доказывает статистически значимую (р <  0,05) высокую агрессивность и широкий спектр вирулентности гриба C. sphaerospermum в отношении линий томата.

Полученные нами нуклеотидные последовательности ITS локуса выделенных из пораженных растений изолятов отличались от последовательностей, опубликованных в работе M. Hamayun с соавт. (24) и F. Pan с соавт. (25) на 4 %, включая InDel размером 3 нуклеотида.

Известно, что C. sphaerospermum, выделенный в чистую культуру из гниющих листьев померанца (Citrus aurantium), был впервые описан немецким микологом Альбертом Юлиусом Отто Пенцигом (Albert Julius Otto Penzig) в 1886 году (26). Обладая высокой устойчивостью к экстремальным экологическим условиям (27), C. sphaerospermum служит возбудителем различных болезней и аллергических реакций у человека (28, 29). Некоторые штаммы C. sphaerospermum являются эндофитами, стимулирующими рост корней Glycine max (24). Кроме того, ряд штаммов C. sphaerospermum используются как потенциальные биоагенты против возбудителей мучнистой росы пшеницы (30), серой гнили (25).

В работе A.A. Abedy с соавт. (20) C. sphaerospermum был выделен из гниющих больных корней и стеблей томата, но не показано, что он служил источником инфекции. Однако недавно появилось сообщение, что C. sphaerospermum может вызывать пятнистости листьев алоэ вера (31). Это свидетельствует, что изменяется специализация вида C. sphaerospermum и происходит переход его к паразитизму , в том числе на томате, что подтверждают и наши исследования. Все выделенные изоляты этого гриба проявили вирулентность в отношении линий томата с различной устойчивостью к кла-доспориозу.

Итак, с помощью внутреннего транскрибируемого спейсера мы провели молекулярную идентификацию изолята, вызывающего кладоспориоз томата в условиях защищенного грунта. По нашим данным, обнаруженный возбудитель кладоспориоза на 100 % соответствует виду Cladosporium sphaerospermum. Проведена комплексная оценка этого возбудителя на различных сортообразцах томата. Присутствие C. sphaerospermum на растениях томата в качестве патогена должно приниматься во внимание при разработке методов диагностики кладоспориоза томата и контроля развития послеуборочных болезней растений. Дифференциация линий томата по степени устойчивости к C. sphaerospermum доказывает значимую (р <  0,05) высокую вирулентность гриба в отношении культуры. Полученные данные будут иметь практическую ценность для разработки мер борьбы с возбудителем кладоспориоза. Кроме того, новые данные о видовом составе будут использованы в программе селекции томата на устойчивость.

1 ФГБНУ Федеральный научный центр овощеводства, 143080 Россия, Московская обл., Одинцовский городской округ, пос. ВНИИССОК, ул. Селекционная, 14,