Первое выявление гриба Fusarium coffeatum на территории Российской Федерации

Видовая идентификация грибов рода Fusarium , особенно при работе с близкородственными видами, зачастую затруднена вследствие высокого сходства ключевых морфологических структур. Подтверждением этому может служить тот факт, что за историю изучения рода Fusarium было предложено около 10 таксономических систем, основанных на анализе морфологических характеристик, в которых число видов колебалось от 9 до 75 (1-4). Существенное значение в разрешении этих проблем на сегодняшний день имеют молекулярно-генетические методы, основанные прежде всего на секвенировании коротких маркерных участков ДНК («штрихкодов») (5, 6), филогенетическом анализе и ПЦР-идентификации. Наиболее надежным и достоверным методом молекулярной таксономии можно считать филогенетическое распознавание вида на основе генеалогического соответствия

^∗ Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РФФИ ¹ 19-04-00642 А.

(Genealogical Concordance Phylogenetic Species Recognition, GCPSR) (7-10). Этот метод применяется для установления границ видов и основан на муль-тилокусном филогенетическом анализе. В качестве филогенетически информативных ДНК-маркеров для грибов рода Fusarium чаще всего используются гены TEF1α (ген фактора элонгации трансляции 1 альфа) (11) и RPB2 (ген субъединицы РНК-полимеразы II) (12). При этом необходимо отметить, что молекулярно-генетические методы не могут и не должны рассматриваться в качестве замены классическим микробиологическим процедурам, а быть их разумным дополнением, существенно расширяющим арсенал аналитических возможностей специалиста. Примерами удачного комбинирования микробиологических и молекулярных подходов служат работы, посвященные обнаружению на территории России ранее не выявленных видов F. torulosum (13) и F. globosum (14).

С конца 1990-х годов применение мультилокусного анализа позволило провести более глубокую видовую дифференциацию, в результате чего многие морфологически схожие изоляты (штаммы) Fusarium , рассматриваемые до этого как представители одного вида, были ре-классифицированы и отнесены к группе или комплексу видов (species complex) (15). Одним из наиболее крупных и интенсивно изучаемых является комплекс видов Fusarium incarnatum-equiseti (FIESC) (16), на сегодняшний день включающий более 30 филогенетических видов, относящихся к двум кладам — F. equiseti и F. incarnatum (17-20). Интерес, который вызывают у исследователей представители FIESC, обусловлен их высокой генетической вариабельностью, экологической пластичностью, а также способностью к синтезу широкого спектра вторичных метаболитов, в том числе микотоксинов (21).

В 2014 году в рамках ежегодного мониторинга загрязненности зернового сырья микотоксинами, а также изучения их продуцентов, проводимого в ФГБУН ФИЦ питания и биотехнологии, из зерна пшеницы, выращенного в Тульской области, был выделен изолят, получивший рабочее название ION-3/4. Предварительный анализ морфологических особенностей культуры не позволил однозначно определить его видовую принадлежность, что стало основанием для последующих исследований с привлечением молекулярно-генетических инструментов.

Цель настоящей работы — установление видового статуса изолята ION-3/4 c применением комплексного подхода, включающего анализ нуклеотидных последовательностей генов-маркеров, а также расширенное изучение культуральных свойств, макро- и микро-морфологических характеристик.

Ìåòîäèêà . Исследуемый изолят грибов рода Fusarium штамм ION-3/4 был выделен из мицелия, выросшего непосредственно из зерновки при микологическом анализе зерна. Далее в результате последовательных пересевов был получен моноспоровый изолят. В настоящее время культура штамма ION-3/4 хранится в коллекции микроорганизмов в лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома (ФГБУН ФИЦ питания и биобезопасности).

Для проведения молекулярно-генетических исследований и филогенетического анализа, помимо штамма ION-3/4, использовали другие морфологически близкие виды рода Fusarium штаммы: F. equiseti 64803 и 97001 (коллекция ФГБНУ ВИЗР, г. Санкт-Петербург—Пушкин), F. incar-natum F-2681 (коллекция ФИЦ ПНЦБИ, г. Пущино) и F. graminearum F-892 (коллекция НИЦ Курчатовский институт — ГосНИИгенетика, г. Москва), видовая принадлежность которых была подтверждена в предыдущем исследовании (22).

ДНК из моноспоровых культур грибов выделяли с использованием набора реагентов DNAeasy® Plant Pro Kit («Qiagen», Германия) в соответствии с протоколом производителя. Концентрации и степень очистки ДНК от белковых и низкомолекулярных примесей определяли с помощью спектрофотометра NanoVue («GE HealthCare», США).

Дизайн универсальных праймеров для секвенирования маркерных участков проводили с помощью выравнивания последовательностей нуклеотидов генов TEFla и RPB2 грибов рода Fusarium, депонированных в базе данных Национального центра биотехнологической информации (GenBank, . Для выравнивания применяли алгоритм ClustalW (23). Расчет температуры отжига и оценку физико-химических свойств олигонуклеотидов проводили с использованием программы Oligo.6.71 . В результате проведенного анализа были сконструированы праймеры следующей структуры: TEF30F — 5´-CGTCGTC ATCGGCCACGT-3´, TEF650R — 5´-ACCAATGACRGTGACATAGTAGC-3´; RPB2F — 5´-ATGRTCMRCMGAGGYATGGAAGT-3´, RPB2R — 5´- TTGT GATCGGGGAADGGA-3´.

ПЦР проводили в амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия). Для пары TEF30F-650R использовалась следующая программа амплификации: 93 ° С, 90 с (1 цикл); 93 ° С, 20 с, 64 ° С, 5 с, 67 ° С, 5 с (5 циклов); 93 ° С, 1 с, 64 ° С, 5 с, 67 ° С, 5 с (40 циклов); для пары RPB2F-2R — 93 ° С, 90 с (1 цикл); 93 ° С, 5 с, 60 ° С, 10 c, 72 ° С, 5 c (45 циклов). Использовали набор реагентов для проведения ПЦР, в том числе Taq полимеразу UP с активностью 5 ед/мкл (ООО «ДНК-технология», Россия). Состав ПЦР-бу-фера и концентрации компонентов реакционной смеси описаны ранее (24).

Продукты ПЦР клонировали в плазмидный вектор pAL2-T с использованием набора Quick-TA kit (ЗАО «Евроген», Россия) в соответствии с протоколом производителя. Секвенирование проводили модифицированным методом Сэнгера с использованием флуоресцентной метки на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3730 («Applied Biosystems», США; секвенирование выполнено в ЗАО «Евроген»). Для анализа маркерных последовательностей генов TEFla и RPB2 и их сравнения с базой данных NCBI использовали алгоритм BLAST .

Филогенетический анализ выполняли в программе MEGA-X (25) с применением метода максимального правдоподобия (ML) и двухпараметрической модели Кимуры (26). Достоверность топологий филогенетических деревьев подтверждали с помощью бутстреп-анализа с 1000 повторностей. В анализ были включены последовательности генов TEFla и RPB2 грибов рода Fusarium , депонированных в базе данных NCBI: F. equiseti NRRL 264 919 (GQ505599, GQ505777), F. scirpi NRRL 36478 (GQ505654, GQ505832), F. compactum NRRL 36323 (GQ505648, GQ505826), F. lacertarum NRRL 20434 (GQ505593, GQ505771), F. incarnatum CBS 132.73 (MN170476, MN170409). Также использовались последовательности типового штамма F. coffeatum CBS 635.76 (MN120736, MN120755).

Макро- и микроморфологические характеристики моноспорового изолята ION-3/4 исследовали при выращивании на нескольких видах питательных сред: картофельно-сахарозном агаре (КСА) (1), картофельно-декстрозном агаре (PDA) («Himedia Laboratories Pvt Ltd.», Индия; «Neogen

Corporation», США), агаре Чапека-Докса (CDA) («Himedia Laboratories Pvt Ltd.», Индия), овсяном агаре (ОА) (Difco Laboratories, «Fisher Scientific», США), гвоздично-листовом агаре (CLA) (1) и на среде Ниренберга (SNA) (3). Макроморфологические особенности (структура мицелия и пигментация) оценивали на средах КСА, PDA, ОА и CDA на 7-е сут роста, в условиях темноты и переменного освещения (16 ч день/8 ч ночь) при температуре 25 ° С, изменение пигментации наблюдали до 3 нед. Скорость горизонтального роста изолята исследовали при культивировании на средах PDA, CDA, OA и SNA в чашках Петри при температурах 20, 25 и 30 ° С. Диаметр колоний на 3-и, 5-е и 7-е сут измеряли в двух поперечных направлениях для трех параллельных посевов ( n = 3). Рассчитывали средние значения ( М) , стандартное отклонение по результатам всех измерений составляло 5,3 %, вычисления выполняли с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel. Микроморфологические характеристики (форма и размеры конидий, типы фиалид) исследовали при культивировании на среде CLA при 25 ° С на 7-14-е сут с помощью микроскопа Olympus CX33 («Olympus Corporation», Япония). Размеры конидий представлены в виде среднего и диапазонов от наименьшего до наибольшего размера (min-max) в продольном и поперечном направлениях, полученные не менее чем для 10 измерений, выполненных с использование программного обеспечения ToupView .

Морфологические особенности штамма ION-3/4 сопоставляли с описаниями грибов рода Fusarium , представленными в определителях (2, 3), а также в публикациях (20, 27).

Результаты . Анализ нуклеотидных последовательностей участков двух маркерных генов показал 100 % ( TEFla) и 99,45 % ( RPB2 ) сходства с соответствующими последовательностями типового штамма F. coffeatum CBS 635.76. Исследование топологии филогенетических деревьев, представленных на рисунке 1, показало, что штаммы ION-3/4 и CBS 635.76 формируют отдельный кластер с бутстреп-поддержкой 100 % и 99 % соответственно для генов TEFla и RPB2 . Также важно отметить тот факт, что кластер F. cof-featum принадлежал к филогенетической кладе F. incarnatum , что согласуется с данными, опубликованными ранее (20, 27).

Макроморфологические характеристики штамма ION-3/4 изучали при культивировании на питательных средах КСА, PDA, ОА и CDA. На средах КСА и PDA отмечено формирование обильного плотного невысокого воздушного мицелия молочно-белого цвета с легким кремовым оттенком, реверс имел более насыщенный кремово-персиковый цвет, по мере старения культуры (более 2 нед) появлялся более выраженный желтый цвет, который потом переходил в светло-коричневый — «кофе с молоком» (рис. 2, А). При культивировании на питательных средах на основе картофельного экстракта разных фирм-изготовителей варьировала насыщенность цвета реверса. Более светлый реверс отмечали при росте на среде КСА, приготовленной в лабораторных условиях из картофельного отвара согласно рецептуре (2), наиболее интенсивную яркую желто-оранжевую окраску колонии приобретали на среде PDA производства «Himedia Laboratories Pvt Ltd.». Выращивание в условиях переменного освещения (16 ч день/8 ч ночь) на средах КСА и PDA способствовало формированию более насыщенной цветовой палитры реверса в отличие от условий без освещения, воздушный мицелий всегда оставался молочно-белым независимо от освещения. При росте на среде ОA воздушный мицелий был менее плотным, а на среде CDA имел рыхлую, хлопьевидную структуру, менее развитую, чем на PDA. Цвет воздушного мицелия и реверса на средах ОA и CDA оставался молочно-белым (см. рис. 2, Б).

.............................F. equiseti 97001

---------F. scirpi NRRL 36478 GQ505654

• -F. compactum NRRL 36323 GQ505648

• -F. lacertarum NRRL 20434 GQ5O5593

pF. equiseti 64803

991— F equiseti NRRL 26419 GQ505599

Iqq —Fusarium sp. ION-3/4

F coffeatum

If. coffeatum CBS 635.72 MN12O736] (FIE SC28) .F. ineamatum CBS13273 MN 170476

99 I F. ineamatum F-2681

•F. graminearum F-892

0,02

Б

F. equiseti 97001

—F. scirpi NRRL 36478 GQ505832

F. compactum NRRL 36323 GQ505832

F. lacertarum NRRL 20423 GQ505771

■F equiseti 64803

99 I— F. equiseti NRRL 26419 GQ505577

Fusarium sp. ION-3/4

F coffeatum

F. coffeatum CBS 63572 MN 120755] (FIE SC28) . F. ineamatum CBS73273 MN 170409

1001 F, ineamatum F-2681

F. graminearum F-892

Рис. 1 . Филогенетические деревья, построенные на основе сравнения маркерных последовательностей гена TEFla (А) и RPB2 (Б) изолята ION-3/4 и референтных штаммов семи видов грибов рода Fusarium c помощью метода максимального правдоподобия (ML) и двухпараметрической модели Кимуры (26) в программе MEGA-X (25). Показаны только значения бутстрепа более 50 % для 1000 повторностей. Последовательности штамма F. graminearum F-892 использованы в качестве «внешней группы».

Рис. 2 . Fusarium coffeatum (штамм ION-3/4) на 4-е сут культивирования при 25 ° С на карто-фельно-сахарозном агаре (КСА) (А) и агаре Чапека-Докса (CDA) (Б).

Микроморфологические структуры оценивали при культивировании на среде CLA при 25 ° С на 7-14-е сут. В воздушном мицелии культура образовывала обильные микро- и мезоконидии (рис. 3), макроконидии встречались редко. Размеры конидий приведены в таблице 1. Образования спо-родохий не наблюдали.

Рис. 3 . Fusarium coffeatum (штамм ION-3/4) — микро- и мезоконидии, формируемые в воздушном мицелии на моно- и полифиалидах на гвоздично-листовом агаре (CLA): а, в — микроконидии на полифиалидах; б, е — микроконидии на монофиалидах; г — микроконидии на моно- и поли-фиалидах; д — микро- и мезоконидии (микроскопа Olympus CX33, «Olympus Corporation», Япония).

• 1.    Размеры (мкм) конидий Fusarium coffeatum (штамм ION-3/4), формируемых на гвоздично-листовом агаре (CLA) ( n = 10)

  Тип конидий	Длина (Д), среднее (min-max)	Ширина (Ш), среднее (min-max)	Соотношение Д/Ш
  Микроконидии Мезоконидии:	6,7 (6,0-7,4)	1,6 (1,0-2,1)	4,2
  без перегородки:	15,7 (8,6-16,0)	2,7 (2,3-3,1)	5,8
  с одной перегородкой Макроконидии (с двумя	15,2 (9,4-21,0)	2,4 (2,0-2,7)	6,3
  перегородками)	24,5 (24,0-25,0)	3,8 (3,5-4,0)	7,3

2. Динамика радиального роста колоний Fusarium coffeatum (штамм ION-3/4) (мм) на питательных средах при разных температурах ( n = 3, M ±5,3 %)

Макроконидии, образуемые на CLA, в основном с двумя перегородками, почти прямые, с небольшим изгибом с дорсальной стороны, концевые клетки имели слабо выраженную форму (в апикальной части в виде сосочка, в базальной — в виде ступни).

В воздушном мицелии наблюдалось обилие веретеновидных мезоконидий без перегородки или с одной перегородкой (см. рис. 3, д), а также микроконидий овальной или обратнояйцевидной формы (см. рис. 3, а-г, е), формируемых в молодых культурах на монофиалидах (см. рис. 3, б, е), а по мере роста — также на полифиалидах (см. рис. 3, а, в, г). Полифиалиды имели два и более локусов для образования конидий. Размер фиалид варьировал от 6 до 60 мкм (см. рис. 3, а-г, е). Хламидоспоры не были обнаружены.

При сравнении с морфологически близким видом F. chlamydosporum Wollenweber & Reinking (3) у изолята F. coffeatum (штамм ION-3/4) отмечается сходство по снижению или отсутствию формирования спородохий и макроконидий в них, по форме конидиогенных клеток (моно- и полифиа-лиды), обилию и форме микроконидий, образованию белого воздушного мицелия, однако у культур ION-3/4 отсутствуют розовый и бордовый цвет реверса.

По обилию прямых веретенообразных мезоконидий в воздушном мицелии на моно- и полифиалидах изолят F. coffeatum (штамм ION-3/4) схож с F. semitectum Berkeley & Ravenel (син. F. incarnatum ) (3), также их объединяет пониженное образование или отсутствии хламидоспор, что, как и образование спородохий, является штамм-специфичным признаком. Однако, в отличие от F. semitectum , изолят F. coffeatum (штамм ION-3/4) обильно образует микроконидии в молодой культуре, тогда как у F. semitectum это отмечают в старых культурах (3), а появление бежевого или коричневого цвета реверса наблюдается только в старой культуре.

Полученные характеристики для изучаемого изолята (штамм ION-3/4) согласуются с описанием типичного штамма F. coffeatum (CBS 635.76), приведенным ранее (27). Это касается в первую очередь микроморфологи-ческих характеристик (форма и размеры образуемых в воздушном мицелии конидий, строение моно- и полифиалид, а также отсутствие спородохий на CLA). При этом у указанного штамма F. coffeatum (CBS 635.76) утрачена способность продуцировать пигменты (от бежевого до кофейно-коричневого цвета) на средах PDA и OA, а на CLA отсутствуют спородохии, что, по мнению авторов, является следствием его вырождения. У полученного нами изолята F. coffeatum (штамм ION-3/4), как было описано выше, пигмент образуется на средах PDA, но интенсивность пигментации варьирует на средах разных фирм-изготовителей. В настоящее время в научных публикациях отсутствует более подробное описание F. coffeatum .

Скорость роста культуры штамма ION-3/4 изучали в течение 7 сут при культивировании в чашках Петри на четырех видах питательных сред при 20, 25 и 30 ° С (табл. 2).

Время, сут	PDA	CDA	OA	SNA
	20 ° С | 25 ° С | 30 ° С	20 ° С | 20 ° С | 30 ° С	20 ° С | 25 ° С | 30 ° С	20 ° С | 25 ° С | 30 ° С

3-и       22     35      23      30     40      35      18      32     23     23      30      17

5-е       50     65      52     60     77      72     45      72     60     46      53      40

7-е       75     86      75      80      86      86      67      86      70      64      80      60

Примечание. PDA — картофельно-декстрозный агар («Himedia Laboratories Pvt Ltd.», Индия), CDA — агар Чапека-Докса («Himedia Laboratories Pvt Ltd.», Индия), OA — овсяный агар (Difco Laboratories, «Fisher Scientific», США), SNA — среда Ниренберга (3).

Набольшую скорость роста наблюдали при 25 ° С: на 7-е сут колонии достигали максимального размера (86 мм на средах PDA, CDA, OA, 80 мм — на SNA). При 20 ° С и 30 ° С культура росла значительно медленнее на средах

PDA, OA и SNA, при этом на среде CDA размер колонии при 30 ° С был таким же, как при 25 ° С, а при 20 ° С несколько меньше. Таким образом, выявлено, что температура 25 ° С наиболее благоприятна для активного роста изолята F. coffeatum (штамм ION-3/4) на всех видах использованных питательных средах.

Итак, основной результат настоящего исследования — первое обнаружение штамма гриба Fusarium coffeatum на территории России, а также подробное описание его фенотипических характеристик. Согласно данным GenBank (NCBI), до настоящего времени моноспоровые изоляты F. coffeatum были выделены на территории Австралии (FIESC28_10703), Южной Африки (типовой штамм CBS 635.76), Румынии (CBS 430.81). Исходя из полученных данных, можно отметить, что указанный вид является космополитичным и обладает широкой экологической пластичностью, позволяющей ему существовать в различных климатических условиях. Выявление F. coffeatum расширяет представления о видовом разнообразие грибов рода Fusarium на территории Российской Федерации и дополняет новыми знаниями о географических ареалах распространения этого вида. Однако пока не ясно, способен ли вид F. coffeatum заражать сельскохозяйственные культуры и синтезировать микотоксины. Изучение этих аспектов может стать целью будущих исследований.