Первые результаты визуализации и структурной оценки гликокаликса эндотелиоцитов при варикозной болезни

Кардинальное изменение представлений о роли эндотелия в функционировании сердечно-сосудистой системы произошло в начале восьмидесятых годов прошлого века. До 1980 года за монослоем клеток эндотелия признавали только две функции: барьерную, не допускающую проникновения форменных элементов крови в сосудистую стенку, и антитромбогенную, препятствующую внутрисосудистому свертыванию крови. Однако Р. Фурчготт и Дж. Завадски [1] в своей классической работе показали, что эндотелий играет важнейшую роль в регуляции сосудистого тонуса, опосредуя расслабление гладких мышц в ответ на действие многих сосудорасширяющих агонистов [2]. Тогда же было экспериментально доказано, что диаметр сосудов постоянно приспосабливается к величине скорости кровотока и что эта реакция обусловлена способностью эндотелия вырабатывать фактор, расслабляющий гладкие мышцы, в ответ на повышение напряжения сдвига на сосудистой стенке [3; 4]. В течение короткого промежутка времени было показано, что производимый эндотелием фактор, расслабляющий гладкие мышцы, представляет собой образующийся из L-аргинина оксид азота (NO) [5; 6].

Дальнейшие исследования показали, что эндотели-оциты производят не только факторы, расслабляющие гладкие мышцы, такие как NO, эндотелиальный фактор гиперполяризации, простациклин, но и факторы, вызывающие вазоконстрикцию — эндотелины, тромбоксан А2, ангиотензин II. Особое значение имеет тот факт, что большинство из этих субстанций, включая также производимые эндотелием фактор фон Виллебранда и тканевой фактор, играют важную роль в системе гемостаза [7]. Наконец, нужно отметить, что эндотелий может принимать

участие и в процессах воспалительного и иммунного ответов, поскольку способен секретировать как провос-палительные, так и антивоспалительные цитокины и хемокины [8; 9].

Таким образом, накопленные знания не оставляют сомнений в том, что сосудистый эндотелий играет фундаментальную роль в нормальном функционировании организма, и что эндотелиальная дисфункция должна приводить к серьезным нарушениям не только сердечнососудистой системы, но и всего организма.

В большинстве статей, посвященных структуре сосудистой стенки и функции ее различных слоев, можно найти утверждение о том, что именно монослой эндотелиоцитов является «границей» между кровью и сосудистой стенкой, это утверждение не совсем верно. Эндотелий действительно является первым слоем клеток, с которым контактирует текущая по сосудам кровь, но у эндотелия есть свой защитный неклеточный слой — производимый самим эндотелием внеклеточный матрикс, — гликокаликс. Это слой макромолекул, состоящий из протеогликанов, гликозаминогликанов, гликопротеинов и гликолипидов [10]. Он покрывает люминальную (обращенную в просвет сосуда) поверхность эндотелиальных клеток [11], и именно гликокаликс в комбинации с эндотелием обеспечивают гомеостаз сосудистой стенки, поскольку они регулируют её проницаемость [12; 13], тонус гладких мышц и гидравлическое сопротивление сосудов [14; 15], а также предотвращают возникновение микрососудистого тромбоза и подавляют адгезию лейкоцитов и тромбоцитов [16].

Гликокаликс представляет собой слой, покрывающий плазматическую мембрану большинства клеток-эукариотов и состоящий из связанных с мембраной белков, гликопротеинов, гликолипидов и протеогликанов. Предположение о том, что и клетки эндотелия имеют такое покрытие, было впервые высказано еще в 40-х годах прошлого века [17; 18]. Однако, поскольку обнаружить его с помощью световой микроскопии было невозможно, это предположение в течение более двадцати лет оставалось ничем не подкрепленным утверждением. Лишь в 1958 году Копли и Стейпл [19], прижизненно микроскопируя сосуды защечного мешка хомяка, показали, что при внутривенном введении голубого понтамина в микрососудах отчетливо определяется практически неподвижный неокрашенный пристенный слой плазмы. Авторы предположили, что движение плазмы в непосредственной близости от сосудистой стенки тормозит некий неклеточный слой, в который не проникает краситель. В 1963 году Bennett [20] назвал этот слой гликокаликсом, что в переводе с греческого означает «сладкая шелуха» или «сладкая оболочка». Такое название довольно точно отражало представление тех лет о том, что этот обволакивающий клетки слой состоит из мукополисахаридов, производимых самими клетками, то есть представляет собой углеводистый внеклеточный матрикс.

Спустя три года Люфт [21], используя рутениевый красный — катионный краситель, имеющий высокое сродство к мукополисахаридам, являющимся углеводной частью гликокаликса, смог с помощью электронной микроскопии визуализировать тонкий слой макромолекул, покрывающий эндотелий. Толщина этого слоя, по данным Люфта, составляла порядка 20 нм, то есть всего в 2–3 раза превосходила толщину эндотелиальной мембраны. И с того времени в течение почти 30 лет, несмотря на использование разных красителей и методов фиксации, электронномикроскопические исследования показывали, что толщина эндотелиального гликокаликса (ЭГ) даже в крупных артериях не превосходит 60–100 нм. Трудно было себе представить, что имеющее столь малую толщину покрытие эндотелиоцитов могло значимо влиять на функционирование сосудистой стенки.

Однако, начиная с конца 1970-х годов, в литературе стали появляться данные гемодинамических исследований, указывавшие на то, что слой ЭГ должен иметь значительно большую толщину, чем это следовало из данных электронной микроскопии [22; 23]. Эти физиологические измерения показывали, что толщина гликокаликса в капиллярах и артериях млекопитающих должна составлять примерно от 0.5 до 3.0 мкм [24], что, по крайней мере, на порядок больше величин, которые давали микроскопические измерения.

Многие исследователи высказывали предположение о том, что гликокаликс представляет собой весьма «хрупкий» слой, который может легко повреждаться в процессе приготовления препарата для электронной микроскопии и что именно это повреждение обусловливает столь маленькие значения толщины гликокаликса при его микроскопировании. И действительно, ван ден Берг и соавторы, изменив протокол окрашивания и фиксации препарата и использовав в качестве красителя голубой алциан 8GX, показали, что толщина слоя гликокаликса в капиллярах миокарда крыс может достигать 500 нм [12]. Несколько позднее методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии было показано, что толщина гликокаликса в культуре эндотелиальных клеток пупочной вены человека составляет 2–3 мкм [25]. Далее, методом двухфотонной сканирующей микроскопии было показано, что толщина гликокаликса в интактных сонных артериях мышей составляет в среднем 4.5 мкм [26].

Отметим, что толщина гликокаликса, во-первых, различна в сосудах разного калибра (от 0,4 мкм в капиллярах до 3–5 мкм в артериях) и, во-вторых, эта величина в каждом сосуде весьма непостоянна, поскольку, с одной стороны, содержащиеся в крови протеазы и гликозидазы постоянно слущивают (укорачивают) волокна гликока-ликса, а, с другой стороны, эндотелий постоянно нарабатывает новый гликокаликс, причем тем интенсивнее, чем выше напряжение сдвига на стенке сосуда [27; 28]. Как следствие, в литературе можно найти довольно противоречивую информацию о структуре и размерах отдельных компонентов ЭГ.

Рис. 1. Структура и функции ЭГ. Схематическое изображение основных компонентов и функций ЭГ. ЭГ состоит из протеогликанов с длинными боковыми цепями гликозаминогликанов (GAG-цепь) и гликопротеинов с короткими разветвленными углеводными боковыми цепями. ЭГ модулирует процессы коагуляции, воспаления и механотрансдукции [29] (с адаптацией).

Составляющие гликокаликса можно «пометить» специфическими маркерами, что окрашивает их и позволяет наблюдать в флуоресцентном микроскопе. Таким образом, состав и строение гликокаликса можно достаточно хорошо определить при микроскопировании сосуда. Наиболее общие представления о структуре гликокаликса в норме и при патологических состояниях дают рисунки 1–4.

Поскольку, как мы уже отметили, состояние эндотелия в значительной степени определяет способность сердечно-сосудистой системы нормально функционировать, то нет сомнений в том, что достигнуть максимальной эффективности в лечении сердечно-сосудистой патологии невозможно без понимания процессов, приводящих к дисфункции эндотелия. В частности, известно, что варикозная болезнь является следствием изменений, происходящих как в эндотелиоцитах, так и во внеклеточном матриксе, приводящих, в конечном итоге, к изменениям венозного тонуса. Таким образом, можно утверждать, что нарушения состояния и функции венозных сосудов с высокой вероятностью связаны с трансформацией ЭГ.

Периодическая структура ЭГ была впервые выявлена в исследовании Squire и соавторов [33], которые, используя преобразование Фурье изображений, полученных при электронной микроскопии, показали, что компоненты ЭГ образуют квазипериодическую трехмерную сеть, связанную с актином цитоскелета. Позднее, эта модель ультраструктуры гликокаликса позволила исследователям доказать, что ЭГ является механорецептором, воспринимающим действующую на него со стороны текущей крови силу вязкого трения (напряжение сдвига), что обеспечивает эндотелий-зависимую регуляцию тонуса сосудов при изменениях скорости кровотока [14; 15].

Несмотря на очевидно важную роль ЭГ, его оценка в современной научной литературе не находит широкого внимания, что, вероятно, обусловлено трудоемкостью инструментальных исследований, позволяющих визуализировать ЭГ. Разработка методов стабилизации клеточной мембраны дала ключ к реальной визуализации гликока-ликса сначала с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, а затем и других методов (просвечивающей электронной, флуоресцентной, конфокальной, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии и др.).

Гликокаликс непрерывно обновляется за счет сбалансированных и достаточно интенсивных процессов деградации и синтеза. При различных заболеваниях этот баланс смещается в сторону деградации, что приводит к чистой потере гликокаликса. При этом утрачиваются или нарушаются многие функции, за которые он отвечает. В зависимости от заболевания скорость, с которой про-

Residue of Core Protein

Platelet

Monocyte

Residue of Glucosaminoglycan

Activated Granulocyte

Cytokines

Hyaluronan

Reduced hyaluronan

Glycocalyx

Thin cocalyx

Thrombus

Glucosaminogly

Core Protein

Reduced Glucosaminogl

Б

B

[ Integrins ICAMs ~т PECAM-1 Selectin—■

А                Endothelial Cells____^________I____I

Injured Endothelial Cells

Рис. 2. Схема ЭГ поверхностные рецепторы нормального эндотелия покрыты ЭГ, который состоит из сердцевинного белка, гликозаминогликанов и гиалуроновой кислоты. Только основной белок связывается с эндотелиальными клетками; гликозаминогликаны и гиалуронан напрямую не взаимодействуют с этими клетками (левая панель). (Б) Тяжелые воспалительные состояния, такие как цитокиновый шторм, могут разрушать ЭГ. Это может привести к экспонированию как поверхностных, так и поверхностных рецепторов эндотелиальных клеток в просвет сосуда; это, в свою очередь, позволяет гранулоцитам и тромбоцитам прикрепляться к эндотелиальным клеткам и вызывать повреждения и образование тромбов, которые могут блокировать кровоток (средняя панель). (В) Хронические состояния, такие как диабет, ХБП и гипертриглицеридемия, могут снижать выработку компонентов гликокаликса; это приводит к истончению структуры гликокаликса, делая ее более уязвимой для повреждения внешними раздражителями (правая панель) [30].

исходит потеря гликокаликса, различается, и это может иметь решающее значение для терапии, необходимой для его восстановления. К заболеваниям со стремительной деградацией гликокаликса и острой потребностью в его восстановлении относятся острые ишемически-репер-фузионные состояния, сепсис, хирургический стресс, ожоги, пережатие аорты при сердечно-сосудистом шунтировании, а также инфекционные заболевания, вызванные Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa или сибирской язвой [11–14]. Вторая большая группа заболеваний связана с постепенно нарастающим дисбалансом между синтезом и деградацией, приводящим к дефектам гликокаликса. Он представлен сахарным диабетом, хроническими сердечно-сосудистыми заболеваниями, хроническими заболеваниями почек, опухолями, хроническими воспалительными процессами [34–37].

Исследования, посвященные хроническим заболеваниям вен нижних конечностей, определяют одним из ведущих звеньев патогенеза этой группы заболеваний развитие эндотелиальной дисфункции. Действительно, дисбаланс обмена жидкости в системе «сосуд-ткань-сосуд» нарушается. Причины таких нарушений лежат, по-видимому, не только в плоскости изменения соотношения давлений. Здесь задействован также и ряд универсальных механизмов, включающих воспалительную реакцию сосудистой стенки, ишемию тканей и др. Прогрессирование клапанной недостаточности, повышение венозного давления, возникновение веновенозного рефлюкса способствуют прогрессированию воспалительных реакций на венозном эндотелии. Этот патологический цикл вызывает хроническое повреждение венозной стенки. Лейкоцит-эндотелиальные взаимодействия играют важную роль в формировании хронической венозной недостаточности. Таким образом, можно предположить, что феномен эндотелиальной дисфункции является ранним и ключевым событием в расширении вен, недостаточности венозных клапанов, и, следовательно, в патофизиологии варикозной болезни вен нижних конечностей [38]. Безусловно, частный вклад воспалительных реакций в общую картину макроскопических патоморфологических изменений может быть различным. Но объединяющим является процесс повреждения гликокаликса, влекущий за собой последующие патологические каскады.

К сожалению, эта тематика на сегодняшний день представляется новой и недостаточно изученной. На текущем этапе отсутствуют данные о визуализации ЭГ у человека при сосудистых заболеваниях и, в частности, при варикозной болезни вен нижних конечностей.

Как уже было отмечено, исследователями были предприняты множественные попытки визуализации гликокаликса эндотелия. Таких исследований в научной литературе у пациентов с варикозной болезнью не проводилось. В своей работе мы преследовали цель визуализировать гликокаликс у пациентов с варикозной болезнью вен нижних конечностей.

Образцы вен были получены при проведении плановых оперативных вмешательств. Вена блокируется с двух сторон на расстоянии 2 см. Вводится две иглы на расстоянии 1–2 см друг от друга. За иглами вена перевязывается и осуществляется перфузия образца через одну из игл раствором Рингера до появления прозрачного эффлюента из второй иглы. Затем в этот сегмент вены вводится 2,5% раствор Рингера, осуществляется фиксация в течение 5 мин. Затем вырезается сегмент вены, не травмируя его срединный участок и помещается в бюкс, содержащий 2,5% глутарового альдегида на Рингере. Бюкс плотно закрывается, маркируется, помещается в темный холодильник с последующей отправкой в лабораторию для выполнения электронной микроскопии.

Срезы изучались и были сфотографированы на трансмиссионном электронном микроскопе JEOL JEM-1011 (просвечивающий электронный микроскоп с ускоряющим напряжением 100 кВ, предназначенный для работы с биологическими объектами в режиме повышенного контраста и широкого поля с разрешающей способностью 0,3 нм). Микроскоп оборудован электронной CCD камерой Gatan Orius 832 с разрешением 4008 x 2672.

Электроннограмма эндотелия 1. Общий вид вены (увеличение Х3000).

Электроннограмма эндотелия 2. Клетка эндотелия вены, А – увеличение Х12000, Б – у величение Х40000, В – увеличение Х60000.

Электроннограмма эндотелия 3. Клетка эндотелия вены, А – увеличение Х12000, Б – увеличение Х60000.

Электроннограмма эндотелия 4. Клетка эндотелия вены с гликокаликсом, увеличение Х50000.

Полученные результаты с фрагментами гликокалик-са представлены на электроннограммах эндотелия (1–4). На электроннограмме эндотелия 1 полость варикозно расширенной вены выстлана эндотелием. Клетки покрыты тонким слоем гликокаликса толщиной до 250 нм.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов (The authors declare no conflict of interest).