Первый опыт выявления коэкспрессии альфа и бета рецепторов эстрогенов с помощью иммунофлюоресцентного метода

В настоящее время известно два основных типа рецепторов эстрогенов – альфа (РЭ α ) и бета (РЭ β ), локализация в тканях и функции которых существенно различаются. При этом ответ ткани на гормональное воздействие может определяться соотношением уровней различных типов рецепторов в клетках. Экспрессия и прогностическое значение их в злокачественных новообразованиях различных локализаций изучается достаточно давно. Например, коэкспрессия обоих типов РЭ в раке молочной железы чаще наблюдалась в опухолях с метастазами в лимфоузлах.

При этом наиболее часто используемыми методами являются оценка содержания соответствующих мРНК с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) или содержания собственно рецепторов с помощью иммуногистохимиии (ИГХ). Оба метода имеют ограничения, так как уровень мРНК не всегда коррелирует с уровнем соот- ветствующего белка, а ИГХ (в наиболее часто используемом варианте с использованием в качестве хромогена диаминобензидина) позволяет выявлять лишь экспрессию отдельных рецепторов, но говорить об их коэкспрессии в одной клетке или взаимном расположении экспрессирующих разные рецепторы клеток можно только приблизительно.

Метод двойной иммунофлюоресценции (двИФ), использующий антитела, меченые флюорохромами, в отличие от ИГХ позволяет выявлять экспрессию двух (потенциально и большего числа) маркеров в одном срезе, что дает возможность точно установить экспрессию их в одной клетке даже на уровне одного субклеточного компартмента и взаимное расположение экспрессирующих разные маркеры клеток путем визуализации продуктов иммунной реакции на микроскопе с набором соответствующих флюорохромам светофильтров в виде свечения различного цвета.

Дополнительное использование компьютерных программ для обработки полученных изображений позволяет получать объективные оценки экспрессии и коэкспрессии маркеров. Использование двИФ позволит в перспективе разработать алгоритм оценки соотношения уровней РЭ α и РЭ β в опухолях и оценить его влияние на прогноз и ответ на терапию у пациентов.

Цель работы. Оценить возможность использования метода двИФ для выявления коэкспресии РЭ α и РЭ β непосредственно в ткани опухоли.

Материалы и методы. Экспрессия РЭ α и РЭ β была оценена в ткани рака эндометрия методом двИФ. В качестве первичных использовались моноклональные мышиные антитела к РЭ α (клон 1D5+6F11, разведение от 1:50 до 1:200, производство ThermoFischer) и поликлональные кроличьи антитела к РЭ β (от 1:500 до 1:1000, производство BioGenex). Вторичные козьи антитела, меченые флюорохромами AlexaFluor488 (к мышиным антителам) и AlexaFluor594 (к кроличьим антителам), производства Life Technologies, использовались в разведении 1:200. Просмотр препаратов проводился на микроскопе с флюоресцентной осью Zeiss Axeon A2 с использованием соответствующих фильтров.

Результаты. На этапе отработки методики экспрессия РЭ оценивалась в образцах рака эндометрия, полученных при гистерэктомии, так как согласно данным литературы эта опухоль экспрессирует оба типа рецепторов. Разработанный протокол двИФ окрашивания препаратов позволил визуализировать экспрессию в ткани рака эндометрия обоих типов РЭ в виде флюоресценции ядер клеток красным (РЭ β ) или зеленым (РЭ α ) цветом. При этом РЭ α выявлялся преимущественно в ядрах опухолевых клеток эндометрия, а свечение клеток стромы было значительно более слабым и не во всех клетках.

Напротив, РЭ β значительно сильнее экспрессировался в строме, хотя также не во всех клетках, изредка отмечалось его наличие в ядрах эпителия. На данном этапе значительной коэкспрессии маркеров в одной клетке отмечено не было, и даже в строме РЭ β позитивные клетки обычно оказывались РЭ α негативными либо с очень низким уровнем РЭ α . Характерных особенностей взаимного расположения клеток, экспрессирующих различные рецепторы, также не выявлено. Тем не менее эти результаты требуют подтверждения путем систематического изучения большего числа случаев.

Заключение. Представленный первый опыт работы позволяет считать метод двИФ перспективным для исследования коэкспрессии и соотношения уровней РЭ α и РЭ β в раках различных органов, в связи с чем планируется использование его в дальнейшем для изучения экспрессии указанных рецепторов в раке предстательной железы.

• № 4, Special Edition 1 – 2016 г. (21) • MALIGNANT TUMOURS 317