Почвенные актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие высокой амидазной активностью

• ^a Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

• ^b Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Исследованы почвенные культуры актинобактерий рода Rhodococcus , обладающие термостабильной амидазной активностью. Проведен ПЦР-анализ и секвенирование генов амидаз. Выявлены последовательности, гомологичные известным генам амидаз из R. erythropolis (GenBank, M88614), R. erythropolis (GenBank, E12517) и R. rhodochrous N774.

Амидазы (КФ 3.5.1.4) – ферменты, катализирующие реакции гидролиза амидосоединений, участвуют в метаболизме азота и широко распространены в природе: они обнаружены у прокариот и эукариот (Fournand, 2001). У бактерий присутствие амидазной активности нередко ассоциировано с метаболизмом нитрилов. Микроорганизмы, активно использующие амиды и нитрилы в качестве ростового субстрата, обнаружены среди бактерий различных таксономических групп: Agrobacterium, Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Pseudomonas , Rhodococcus и др (Забазная, 1998, Кузнецова, 1997; Максимов, 2003; Моисеева, 1991, Banerjee, 2002; Cowan, 2000; Kotlova, 1999, Yanenko, 1995).

Амидазы, выделенные из различных источников, характеризуются различной субстратной специфичностью (Banerjee, 2002). Некоторые из них преимущественно гидролизуют амиды алифатических кислот, другие расщепляют ароматические соединения, в то время как остальные трансформируют амиды α- или ω-аминокислот. Некоторые амидазы обладают стереоселективностью (Four-nand, 2001). Однако распространение ферментных систем разных типов, способных трансформировать различные виды субстратов, не является видоспецифическим признаком (Перцович, 2005).

Данная работа посвящена исследованию почвенных микроорганизмов, обладающих высокой амидазной активностью, и анализу генов амидаз.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования являлись полученные в результате селекции на ацетонитриле штаммы Rhodococcus erythropolis, активно трансформирующие амиды и нитрилы карбоновых кислот. Культуры выращивали на минеральной безазотной солевой среде N, содержащей ацетонитрил в концентрации 10 мМ .

Трансформацию амидов и нитрилов с использованием активной биомассы проводили в 1 мл 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, pH 7.2, при начальной концентрации субстрата 2% параллельно при 25 и 50°С в течение 10 мин. Реакцию останавливали добавлением концентрированной HCl до концентрации 2%. Пробы центрифугировали при 12 тыс. об/мин в течение 5 мин. Продукты реакции анализировали методами газовой хроматографии и ВЭЖХ.

Газовую хроматографию продуктов трансформации нитрилов проводили на хроматографе Chrom 5d ( " LP " , Чехословакия), оснащенном плазменно-ионизационным детектором. Хроматографическая колонка длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм была заполнена носителем полисорб-1, фракция 0,25-0,5 мм ( " Реахим " , Россия). В газ-носитель азот подавался с объемным расходом 35 см³/мин. Температура термостата 190 ± 3 ° С, температура испарителя 220 ± 10 ° С. В качестве стандартов использовали растворы чистых нитрилов, амидов и карбоновых кислот.

Удельную активность ферментов – амидазы и нитрилгидратазы – выражали в мкмоль продукта реакции (кислоты или амида), образуемого за 1 мин, в пересчете на 1 мг веса сухих клеток (мкмоль/мг/мин).

Хромосомную ДНК получали фенольным методом, модифицированным для выделения ДНК из актиномицетов (Клонирование ДНК, 1988).

Праймеры для амплификации генов нитрилгидратазы (А) и нитрилазы (Б )

Выявляемый тип гена	Праймер	Последовательность
Амидаза, гомологичная ферментам из R. erythropolis (E12517) и R. rhodochrous N-774 (X54074)	AmiRhd-1 AmiRhd-2	5’-ATGGCGACAATCCGACCTGACGACA 5’-CTAGGCGGGGCTGAGTTGTGGTGCAGA
Амидаза, гомологичная ферменту из R. erythropolis (M88714)	AmiReR-1 AmiReR-2	5’-ATGCGACACGGTGACATCTCCTCGA 5’-TTACGCTTCGACGGTCTTCTCGAC
Амидаза, гомологичная ферменту из R. erythropolis (AY026386)	AmiReX-1 AmiReX-2	5’-GTGCGACCCAATCGCCCATTCGGCC 5’-CTACCGCAGCACCGGTGCGCTCGG
Амидаза, гомологичная ферментам из R. rhodochrous J1 (S38270)	AmiJ1-1 AmiJ1-2	5’-ATGTCTTCGTTGACTCCCCCCAATT 5’-TTATGTCAGGGTGCCGGCTGCAGC
Rhodococcus sp. (BD061400)	AmiBD-2	5’-TCAGGACGGCACCGAGGGTCGCGG
Амидаза, гомологичная ферменту Rhodococcus sp. (A19131)	AmiRsp-1 AmiRsp-2	5’-ATGGGCTTGCATGAACTGACGCTCG 5’-TCAAAGCGGCGCCAGTCGCGGCCA
α-субъединица Со-нитрилгидратазы ( R. rhodochrous J1)	F AM3 R АМ9	5’-GTGATACATATGAGCGAGCACGTCAAT 5’-ATGCATCATACGATCACTTCCTG
β- субъединица Со-нитрилгидратазы ( R. rhodochrous J1)	F АМ2 R АМ7	5’-GTGATACATATGGATGGTATCCACGAC 5’-ATGCATCACGCAGAGATCAGGTA
α- субъединица Fe-нитрилгидратазы ( R. rhodochrous N-774, X54074)	F АМ5 R АМ8	5’-СATATGTCAGTAACGATCGAC 5’-ATGCATCAGACGGTGGGAACCTG
β- субъединица Fe-нитрилгидратазы ( R. rhodochrous N-774, X54074)	F АМ4 R АМ6	5’-СATATGGATGGAGTACACGAT 5’-ATGCATCAGGCCGCAGGCTCGAG

Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Taq -SE ДНК-полимеразы (ООО «СибЭнзим», Новосибирск) на термоциклере Т3 (Biometra, Германия). Олигонуклеотидные праймеры разработаны с использованием базы данных GenBank (таблица).

Режим амплификации включал начальный цикл денатурации – 1 мин при 94°С; денатурацию, 94°С - 40 с; отжиг, 55-63° - 30 с; элонгацию, 72°С -60 с; (35 циклов) и завершающий этап – 60 с при 72°С.

Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1,5 % агарозном геле в трис-боратном буфере при напряженности электрического поля 6 В/см.

Результаты и их обсуждение

Выделено более 400 клонов бактерий, способных к быстрому росту при использовании ацетонитрила или изобутиронитрила в качестве единственного источника углерода и азота. Для дальнейшего исследования отобраны 25 клонов, активно утилизирующих амиды и нитрилы и различающихся по морфологическим характеристикам.

Проведена идентификация бактерий по совокупности культурально-морфологических, биохимических, хемотаксономических свойств. Видовая принадлежность представителей рода Rhodococ-cus была подтверждена методом ПЦР-анализа генов 16S РНК с видоспецифическими праймерами.

Рис. 1. Идентификация штаммов R. erythropolis по генам 16S РНК

Рис. 2. Идентификация штаммов R. rhodochrous по генам 16S РНК

Основная часть активных изолятов была представлена нокардиоподобными микроорганизмами, в основном относящимися к роду Rhodococcus (рис. 1, 2).

В ходе селекционного процесса при постепенным повышении концентрации субстрата (нитрила) получены культуры R. erythropolis П4-1, П6-21, П11-2, П11-1-3 и R. rhodochrous П-11-8, П-1185, проявляющих амидазную активность более 6 Ед. при 25°С и более 30 Ед. при 50°С, а также активность нитрилгидратазы более 10°С. Установлено, что наилучшими субстратами для ферментов большинства штаммов являются ацетамид и пропионамид. Никотинамид и бензамид гидролизовались с меньшей скоростью.

Молекулярный анализ генов амидаз и нитрил-гидратаз

Для идентификации генов, кодирующих ферменты гидролиза амидов и нитрилов, проведен ПЦР-анализ с применением набора праймеров, специфичных для известных в настоящее время видов амидаз и нитрилгидратаз.

Показано, что геномы изолятов Rhodococcus содержат преимущественно последовательности, родственные ранее известным генам амидаз R. erythropolis , GenBank , E12517, R. rhodochrous N-771, X54074 и R. erythropolis , GenBank, M88614 (рис.3). Гены других видов амидаз встречались со значительно меньшей частотой.

Большинство штаммов также содержали последовательности, родственные генам α- и β- субъединиц Fe-содержащей нитрилгидратазы штаммов R. rhodochrous N-774, Rhodococcus sp. R312.

Рис. 3. Амплификация последовательностей, гомологичных генам амидазы R. erythropolis , GenBank, M886142.

Проведено секвенирование полученных ПЦР-фрагментов с помощью ДНК-секвенатирующей системы MegaBase1000.

Установлено, что гомология известной последовательности E12517 составляет от 94 до 99% (рис. 4, 5,А). У некоторых штаммов обнаружен ряд нуклеотидных замен, что, очевидно, обуславливает различия субстратной специфичности ферментов.

Последовательности, полученные в ПЦР-реакции с праймерами AmiReR, на 82-99% гомологичны гену амидазы R. erythropolis , приведенному в базе данных GenBANK под номером M88614 (рис.5,Б), относящемуся к структурному семейству нитрилаз-цианидгидратаз (Перцович, 2005).

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Section 1

(1) 1 ,10 go go 40 gO 66

П6-2-1 (1) TCC6AAACC3TCGAACTA6T6GCCCTGACCGSCCACCAC66CATCACCGCCCTCGGCG6CGCGA6C

AmiRhd fr (1) TCCGAAACC6TC*AACTGGTGGCCCTG*CC6GCCACCACGGC*TCACCACCCTCGGCGGCGCGAGC

П11-2 (1) TCCGAAACCGTCAAACTGGTGGCTCTGACCGGCCACCACGGCATCACCACCCTCGGCGGCGCGAGC

E12517 fr (1) TCCGAAACCGTCAAACTGGTGGCTCTGACCGGCCACCACGGCATCACCACCCTCGGCGGCGCGAGC

П4-1 (1) TCCGAAACCGTCAAACTGGTGGCTCTGACCGGCCACCACGGCATCACCACCCTCGGCGGCGCGAGC

П11-8-5 (1) TCCGAAACCGTCAAACTGGTGGCTCTGACCGGCCACCACGGCATCACCACCCTCGGCGGCGCGAG-

K17p (1) TCCGAAACCGTCAAACTGGTGGCTCTGACCGGCCACCACGGCATCACCACCCTCGGCGGCGCGAGC

Consensus (1) TCCGAAACCGTCAAACTGGTGGCTCTGACCGGCCACCACGGCATCACCACCCTCGGCGGCGCGAGC -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Section 2

(67) 67 80 90 J 00 1g 0 120 132

П6-2-1 (67) TACGGCAAAGCCCGGAACCTCGTACCGCTCGCCCGCGCCGCCTACGACAATGCCTTGAGACAATTC

AmiRhd fr (67) tacggcaaagcccggaacctcgtaccgcttgcccgcgccgcctacgacactgccttgagacaattc

П11-2 (67) tacggcaaagcccggaacctcgtaccgctcgcccgcgcagcctacgacactgccttgagacaatt.c

E12517 fr (67) TACGGCAAAGCCCGGAACCTCGTACCGCTCGCCCGCGCCGCCTACGACACTGCCTTGAGACAATTC

П4-1 (67) TACGGCAAAGCCCGGAACCTCGTACCGCTCGCCCGCGCCGCCTACGACACTGCCTTGAGACAATTC

П11-8-5 (66) TACGGCAAAGCCCGGAACCTCGTACCGCTCGCCCGCGCAACCTACGACACTGCCGTGAGACAATTN

K17p (67) TACGGCAAAGCCCGGAACCTCGTACCGCTCGCCCGCGCAGCCTACGACACTGCCTTGAGACAATTC

Consensus (67) TACGGCAAAGCCCGGAACCTCGTACCGCTCGCCCGCGCCGCCTACGACACTGCCTTGAGACAATTC -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Section 3 133) 133 140 150 160 ,170 180 198

П6-2-1 133) GACGTCCTGGTGATGCCCACACTGCCCTACGTCGCATCCGAAGTTCCGGCGAAGGACGTGGATCGT

AmiRhd fr 133) GACGTCCTGGTGATGCCAACGCTGCCCTACGTCGCATCCGAATTGCCGGCGAAGGACGTAGATCGT

П11-2 133) GACGTCCTGGTGATGCCCACACTGCCCTACGTCGCATCCGAACTACCGGCGAAGGACGTGGATCGT

E12517 fr 133) GACGTCCTGGTGATGCCCACACTGCCCTACGTCGCATCCGAACTACCGGCGAAGGACGTGGATCGT

П4-1 133) GACGTCCTGGTGATGCCCACACTGCCCTACGTCGCATCCGAATTGCCGGCGAACGACGTGGATCGT

П11-8-5 132) GACGTCCTGGTGATGCCCACACTGCCCTACGTCGCATCCGAATTGCCGGCGAACGACGTGGATCGT

K17p 133) GACGTCCTGGTGATGCCCACACTGCCCTACGTCGCATCCGAATTGCCGGCGAACGACGTGGATCGT

Consensus 133) gacgtcctggtgatgcccacactgccctacgtcgcatccgaattgccggcgaaggacgtggatcgt -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Section 4

Рис. 4. Нуклеотидные последовательности генов амидаз штаммов почвенных изолятов Rhodococcus , гомологичные генам R. erythropolis (E12517) и R. rhodochrous N744 (X54074).

А ---------------------------П 6-2-1 (0.0198)

---------------------------------------AmiRhd fr (0.0281)

------П11-2 (0.0045)

- E12517fr(0.0015)

П4-1 (0.0007)

--------------П11-8-5 (0.0120)

K17p (0.0000)

Б

111-8-5Г-А (-0.0004)

2-4ff-AR (0.0002)

11-2^(0.0002)

------------4-1 For-A (0.0082)

----------------------------------------------------------------5-2F-A [0.0404]

-------------------4-3F-A (0.0124)

-------------------------------------------------------------------------------------5-4for A (0.0534)

Рис. 5. Филогенетические древа нуклеотидных последовательностей, гомологичных генам амидазы R. rhodochrous N744 (А), R. rhodochrous M88614 (Б)

Заключение

Бактерии, активно трансформирующие амиды карбоновых кислот, широко представлены в почве естественной среды. Среди культур, обладающих высоким уровнем нитрилгидратазной и амидазной активности, преобладают представители рода Rhodococcus .

Среди почвенных изолятов Rhodococcus , обладающих высокой амидазной активностью, наиболее распространены гены амидаз двух типов, гомологичные последовательностям из R. erythropolis , GenBank , E12517 и R. erythropolis , GenBank, M88614.

Филогенетический анализ секвенированных последовательностей позволяет предположить, что структура вновь выявленных генов ближе к гипотетической предковой форме алифатической амидазы, чем последовательности, депонированные в GenBank E12517, M88614 (рис. 5).

Работа поддержана программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», ВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009–2010 гг.)» и грантом поддержки молодых ученых УрО РАН.