Подбор оптимальных условий биосинтеза молочной кислоты

В настоящее время молочная кислота (МК) – промышленно важный продукт, спрос на который растет во всем мире, в том числе в России. Потребность рынка в МК составляет порядка 130–150 тыс. т/год.

Молочную кислоту используют во многих промышленных отраслях,в химической добавляют для синтеза различных соединений (пропионовая и акриловая кислоты, уксусный альдегид и другие) и при изготовлении нейтрализаторов, растворителей, средств от нагара; в пищевой промышленности используют в качестве добавки в изделиях кондитерского и мучного производств, используют при консервации плодоовощных культур, а также в процессе изготовления слабоалкогольных и безалкогольных напитков; в косметической используют в кремах, в средствах против акне, в качестве питающего и отбеливающего компонента; в фармацевтической ее используют при изготовлении диализных растворов и минеральных препаратов, протезов и хирургических нитей, а также в системах контролируемой доставки лекарств. В сельском хозяйстве также отмечают использование молочной кислоты, так ее применяют в качестве добавки, которая способствует снижению уровня заболеваемости и повышению уровня репродуктивности сельскохозяйственных животных и птиц. Особое значение и интерес в современном мире представляют полимеры молочной кислоты, которые используют для получения биоразлагаемого пластика. Такие полимеры оказываются изомерами молочной кислоты и обладают схожими физическими и химическими свойствами с применяемыми в настоящее время полимерами из нефтехимических соединений [1, 5, 7, 11–20].

К сожалению, значительная часть потребности отечественного рынка в МК (40%) удовлетворяется за счёт импорта, так как отсутствуют инновационные технологии для её производства и предприятия, которые обладают возможностью выпускать качественную и высококонцентрированную МК [16].

В настоящее время промышленно молочную кислоту получают двумя способами: микробиологический и синтетический. Целесообразным является микробный синтез, однако, в его технологии основными компонентами выступают ценные сахаросодержащие субстраты (сахароза, меласса, патока), которые оказывают значительное влияние на стоимость конечного продукта. В связи с этим существует очевидная необходимость разработки новых технологий получения молочной кислоты [5, 12, 17, 20].

Получить молочную кислоту можно из отходов молочной промышленности, а именно, молочной сыворотки, в состав которой входит достаточное количество молочного сахара – лактозы, ферментируемой молочнокислыми бактериями в МК [9, 11, 15, 18, 19].

Развитие молочной отрасли способствует увеличению объемов молочной сыворотки, налажено производство её концентрата с увеличенным содержанием лактозы. Это открывает широкую перспективу экономически выгодного и рационального использования сыворотки. Переработка молочной сыворотки в молочную кислоту позволит обеспечить российский рынок ценным продуктом и снизить нагрузку на окружающую среду, так как только 20% сыворотки подвергается переработке, а остальной объём сливается в окружающую среду.

Цель исследования – провести скрининг культур микроорганизмов, способных ферментировать лактозу, содержащуюся в молочной сыворотке, и подобрать состав среды, обеспечивающий максимальный выход молочной кислоты.

Методы и материалы

В эксперименте исследовались штаммы молочнокислых бактерий (МКБ): Leuconostoc-mesenteroides subsp. mesenteroides 122 (B-1699), Lactobacillus brevis B-78 (B-5728), Lactobacillus plantarum K-9 (B-5466), Lactobacillus casei C-1 (B-5726), Lactobacillus acidophilus (B-9012), Lactobacillus paracasei БТ 24/88 (B-6253), Lactobacillus paracasei 139 (B-2430), полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (НИЦ «Курчатовский институт» – ГосНИИгенетика).

Для восстановления лиофилизированных культур молочнокислых бактерий применяли питательную среду Man-RogosaSharpe (MRS, стандартная) следующего состава (г/л): гидролизат казеина – 10, пептон – 10, глюкоза – 20, дрожжевой экстракт – 5, калий фосфорнокислый двузамещенный – 2, ацетат натрия – 5, цитрат триаммония – 2, сульфат магния – 0,2, МnSО 4 – 0,05.

Для изучения накопления молочной кислоты исследуемыми штаммами использовали предварительно освобождённую от белка творожную молочную сыворотку, следующего состава (г/л): молочный жир – 1, белок – 0,70, лактоза – 52, минеральные соли – 9, молочная кислота – 6. Для обогащения сыворотки применяли дрожжевой автолизат и раствор микроэлементов по Федорову (г/л): Н 3 ВО 3 – 5,0; Nа 2 МоО 4 ×2Н 2 O – 5,0; МnSО 4 ×4Н 2 O; KI – 0,5; NaBr – 0,5; ZnSО 4 ×7Н 2 O – 0,2 [4]. Дрожжевой автолизат готовили из прессованных дрожжей, добавляя 2 см³ хлороформа и выдерживая 72 часа при температуре 50 °С [7].

В качестве инокулята использовали культуры молочнокислых бактерий, которые выдерживали на жидкой среде MRS в шейкер-культиваторе Multitron (INFORSHT, Швейцария) при температуре 37 °С в течение 12 часов. Инокулят вносили в количестве 2% от объема среды.

Биосинтез молочной кислоты проводили в лабораторных условиях в шейкере-культиваторе при температуре 37 °С в течение 168 часов. Каждые 12 часов проводится отбор проб для контроля рН, измерение проводили при помощи рН-метра рН-150МИ (ООО «Измерительная техника», Россия). Оптимальное значение рН среды (около 6,7) поддерживали добавлением 20% раствора Ca(OH) 2 [6].

Для определения окончания процесса брожения и максимального накопления молочной кислоты ведут контроль за остатком массовой доли лактозы в среде с помощью рефрактометра. Суть данной методики заключается в том, что молочная кислота обладает способность преломления проходящего луча света под определенным углом, с учетом исходной концентрации молочного сахара [3,4].

Содержание молочной кислоты определяли с помощью спектрофотометрического метода, предложенного Л.Н. Борщевской с соавторами [10].

Результаты и обсуждение

В результате анализа кислотообразующей способности молочнокислых бактерий (рисунок 1) было установлено, что максимальной кислотообразующей способностью обладает штамм Lactobacillus casei C-1 (B-5726). Содержание МК в культуральной жидкости составило 54.77 г./л, что на 54% выше по сравнению с известными в настоящее время продуцентами МК [6, 17]. По способности синтезировать МК из лактозы творожной сыворотки исследуемые штаммы можно расположить в следующей убывающей последовательности: Lactobacillus casei C-1 (B-5726) – 54.77 г./л, Lactobacillus brevis B-78 (B-5728) – 49.39 г./л, Leuconostocmesenteroides-subsp. mesenteroides 122 (B-1699) – 40.60 г./л, Lactobacillus paracasei БТ 24/88 (B-6253) – 24.59 г./л, Lactobacillus paracasei 139 (B-2430) – 14.60 г./л, Lactobacillus acidophilus (B-9012) – 11.80 г./л, Lactobacillus plantarum K-9 (B-5466) – 6.00 г./л.

Аналогичные результаты были получены при анализе способности штаммов ферментировать лактозу (рисунок 2). Установлено, что штамм Lactobacillus casei C-1 (B-5726) утилизировал 78% лактозы, содержащейся в молочной сыворотке, что на 20% выше относительно других исследуемых штаммов.

Исследуемые штаммы МКБ LAB strains

Рисунок 1. Концентрация молочной кислоты в культуральной жидкости исследуемых штаммов через 120 часов культивирования

Figure1. The concentration of lactic acid in the culture fluid after 120 hours of cultivation

7,3

6,8

5,3

12345 Продолжительность биосинтеза, сут.

Duration of biosynthesis, days

4,8

Рисунок 2. Кинетика ассимиляции лактозы (%)

культурами исследуемых штаммов

Figure2. Kinetics of lactose assimilation by the culture of the studied strains

Для определения оптимального состава среды для биосинтеза молочной кислоты штаммом Lactobacillus casei C-1 (B-5726) проводили культивирование в течение 72 ч в питательной среде на основе творожной сыворотки с различным содержанием дрожжевого лизата (таблица 1).

Таблица 1.

Определение оптимальной концентрации дрожжевого автолизата в питательной среде для биосинтеза молочной кислоты штаммом

Lactobacillus casei C-1 (B-5726)

Table 1.

Selection of the optimal concentration of yeast autolysate in the nutrient medium for the biosynthesis of lactic acid by the Lactobacillus casei C-1 (B 5726) strain

Концентрация дрожжевого автолизата в питательной среде, % The concentration of yeast autolysate in the nutrient medium, %	Концентрация молочной кислоты через 72 ч культивирования, г/л Lactic acid concentration after 72 hours of cultivation, g/l
1	22,2
2,5	24,36
5	27,96
7,5	26,33
10	25,35
15	25,20

В ходе эксперимента выявлено, что достичь конечную максимальнуюконцентрацию молочной кислоты можно путем добавления к питательной среде автолизата дрожжей в количестве 5 % от объема среды.

Для определения оптимальной продолжительности биосинтеза МК штаммом Lactobacillus casei C-1 (B-5726) культуру выращивали на стандартной среде (MRS) при температуре 37 °С в течение 7 суток. Количество МК в культуральной жидкости определяли каждые 12 ч (рисунок 3). Установлено, что максимальное количество молочной кислоты продуцент накапливает к 132 ч роста (54.77 г./л). Дальнейшее культивирование не приводило к значительному увеличению концентрации МК, из чего следует вывод о целесообразности ограничения продолжительности культивирования Lactobacillus casei C-1 (B-5726) периодом в 132 ч.

Продолжительность культивирования, ч Duration of biosynthesis, h

Рисунок 3. Кинетика накопления молочной кислоты штаммом Lactobacillus casei C-1 (B-5726)

Figure3. Kinetics of lactic acid accumulation by

Lactobacillus casei C 1 (B 5726) strain

Заключение

Исследование кислотообразующей способности штаммов молочнокислых бактерий показало, что из исследованных штаммов наибольшую способность ферментировать лактозу, синтезируя молочную кислоту, проявил Lactobacillus casei C-1 (B-5726), что коррелирует с данными по ассимиляции культурой лактозы. Подобраны оптимальная продолжительность культивирования (132 ч) и концентрация дрожжевого лизата (5%) в питательной среде на основе творожной сыворотки. При оптимальных параметрах максимальная концентрация молочной кислоты в культуральной жидкости Lactobacillus casei C-1 (B-5726) составила 54.77 г./л, что сопоставимо с используемыми в настоящее время продуцентами при промышленном производстве МК.