Подбор параметров культивирования для наибольшего накопления биомассы и БАВ в напитке из чайного гриба

Чайный гриб («Комбуча») – это напиток, полученный в процессе жизнедеятельности симбиотической культуры SCOBY (Симбиотические культуры бактерий и дрожжей) при ферментации сахаросодержащего раствора [1]. Напиток проявляет противомикробные, противовоспалительные, антиоксидантные свойства, то есть относится к функциональному продукту за счет содержания в своем составе биологически активных веществ (БАВ), проявляющих функциональную активность. В состав напитка входят органиче- ские кислоты (уксусная, лимонная, яблочная, винная, щавелевая и т. д.), сахара (сахароза, глюкоза, фруктоза), водорастворимые витамины, аминокислоты, полифенолы и т. д. [2, 3]. Благодаря содержанию таких БАВ напиток может использоваться как для профилактики основных хронических заболеваний человека (диабета, онкологии, ожирения, ССЗ и т. д.), так и выступать в качестве геропротекторного средства [4, 5].

Получение напитка из сахаросодержащего сырья является простым процессом, но занимающим от 15 до 60 суток. Проведенный литературный обзор показал, что существует несколько приемов, способных либо сократить срок накопления биомассы гриба, либо обогатить напиток БАВ [6]. Так, в работе Д.А. Зайцева описывается способ приготовления «Комбучи», в котором сначала наблюдается предварительное внесение в сладкую среду дрожжевой культуры, а затем уже консорциума чайного гриба (Пат. № 2337592 РФ [7]). В работе N.K. Nguyen [8] к биомассе чайного гриба дополнительно вносили биомассу лактобактерий. Такие подходы позволяют получать напитки, содержащие большее количество БАВ, в сравнении с напитками, приготовленными традиционно - только с культурой гриба. В работах А.В. Иванова [9], В.В. Марченко [10] и В.В. Рогожина [11] использовалась дополнительная аэрация для стимулирования жизнедеятельности аэробных уксуснокислых бактерий.

Цель данной работы состоит в подборе рабочих параметров для получения максимального прироста биомассы чайного гриба и выхода культуральной жидкости, содержащей наибольшее количество органических кислот, за минимальный срок ферментации.

Объекты и методы исследований

Объектом исследования стала биомасса Medusomyces gisevii (SCOBY), приобретенная в ООО «Джет-Лайф» (Россия). Биомассу Medusomyces gisevii помещали в сладкий черный чай (30 % сахарозы и 2 % черного цейлонского чая) и культивировали в течение месяца при комнатной температуре. Затем месячную культуральную жидкость вносили в питательную среду и подвергали ферментации в различных условиях, представленных в табл. 1.

Таблица 1 Условия ферментации культуральной жидкости SCOBY

Питательная среда	№ образца	Параметры культивирования
		температура	аэрация	дрожжи
Черный чай (2 %) Сахароза (10 %)	1	28 °С	—	—
	2	28 °С	+	—
	3	30 °С; 28 °С	—	+
	4	30 °С; 28 °С	+	+

Образец № 1 - контроль.

В исследовании использовался черный цейлонский чай компании «ГК «Орими Трэйд» (Россия), сахароза (ООО «АО РЕАХИМ», Россия), в качестве дрожжевой культуры использовались универсальные прессованные дрожжи «Саф-Левюр» (ООО «САФ-НЕВА», Россия). Культивирование осуществлялось в биореакторе BIOSTAT A («Sartorius Stedim Biotech GmbH», Германия): температура для культивирования дрожжей -30 °С и 28 °С для культивирования чайного гриба, режим аэрации 5 дм3/минхм3.

Для образцов № 3 и № 4 в питательную среду сначала в количестве 1,5 % от объема среды вносили культуру дрожжей - культивирование 1 сутки при 30 °С. После фильтрации (для отделения дрожжевого осадка использовали фильтр «Красная лента») в фильтрат помещали культуральную жидкость Medusomyces gisevii (10 %) [7]. Культивирование осуществлялось в биореакторе при 28 °С в течение 15 суток.

Объектами исследования также являлись напитки (культуральные жидкости), полученные при ферментации. Анализ напитков проводился на 3, 5, 7, 10 и 15 сутки.

Прирост биомассы в течение 15 суток культивирования определяли по методике, описанной в работе J.S. Vitas [12]. Удельную скорость роста для периодической культуры образцов определяли по расчетам, представленным в работе Р.П. Тренкеншу [13]. Общую (титруемую) кислотность определяли по ГОСТ 6687.4-86, рН определяли с помощью электронного pH-метра SevenCompact S210 («Mettler Toledo», США). Анализ органических кислот осуществляли с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель-105». Определение содержания сахаров (сухих веществ) определяли рефрактометрическим методом с помощью рефрактометра HI96801 (Hanna Instruments, Inc., США). Если в процессе ферментации культуральная жидкость мутнела (из-за накопления биомассы дрожжей), то образцы перед анализом фильтровали через фильтр «Красная лента».

Статистический анализ проводился с использованием программы Microsoft Excel 2017.

Результаты и их обсуждение

На рис. 1 отражены изменения прироста биомассы, наблюдаемые в течение 15 суток культивирования, для всех исследуемых образцов.

Сутки

^^— №1  • №2  • №3 ^^— №4

Рис. 1. Динамика изменения биомассы SCOBY в течение всего процесса ферментации, г/л

Наибольшее количество биомассы SCOBY в течение всего процесса культивирования накапливалось у образца № 4. На 15 сутки прирост биомассы равнялся 18,50 г. В сравнении полученная масса примерно в 2 раза больше массы контрольного образца, в 1,25 раз больше чем у образца № 2, в 1,83 больше – № 3. Но максимальная удельная скорость роста периодической культуры чайного гриба наблюдалась у образца № 2 – 0,27 г/сутки, для сравнения у образца № 4 – 0,23 г/сутки. Следовательно, при дополнительной аэрации, не зависимо от предварительного внесения дрожжей, прирост биомассы больше, чем в условиях без дополненного обогащения питательной среды кислородом. Но, с учетом того, что сбраживание предварительно внесенной дрожжевой культуры занимает 1 сутки, то менее затратным по продолжительности ферментации является условие № 2.

Результаты по измерению рН при культивировании чайного гриба при различных условиях культивирования представлены на рис. 2.

С увеличением продолжительности культивирования всех образцов наблюдалось снижение значения рН, происходящее за счет накопления органических кислот в среде. Через 15 дней ферментации значения рН для всех образцов находились в диапазоне от 3,36 до 3,76.

Результаты по измерению титруемой кислотности отражены на рис. 3.

Наибольшее значение титруемой кислотности, следовательно, и содержание органических кислот на 15 сутки наблюдалось у об- разца № 4 (18,7 °Т), это значение примерно в 1,5 раза больше, чем у образца № 1.

Результаты по качественному и количественному определению органических кислот в исследуемых образцах, полученных на 15 сутки культивирования, отражены в табл. 2.

Таблица 2

Количественное содержание органических кислот в образцах, г/л

№ образца	Кислота
	уксусная	янтарная	лимонная	винная	щавелевая
1	0,603	0,035	0,067	0,032	0,006
2	1,199	0,053	0,066	0,032	0,015
3	0,791	0,037	0,123	0,052	0,012
4	3,234	0,061	0,136	0,064	0,018

Основной кислотой, выделяемой SCOBY, является уксусная кислота – максимальные концентрации которой наблюдались в образце № 4. Также данный образец содержал наибольшее количество янтарной, лимонной, винной и щавелевой кислот. В образце № 2 (не сравнивая с № 4) содержится максимальное количество уксусной, янтарной и щавелевой кислоты, а в образце № 3 – лимонной и винной кислоты. Предположительно, обогащение кислородом питательной среды стимулирует уксуснокислых бактерий к более интенсивному преобразованию спиртов в янтарную и щавелевые кислоты. А предварительное внесение дрожжей, преобразует спирты в продукты, предшествующие образованию лимонной и винной кислот. Анализ научных

и 5,5

к к я о к 00

4,5

3,5

0           3           5           7           10          15

Сутки

• ■    №1 ■ №2 ■ №3 ■ №4

  
  
  
  

  Рис. 2. Изменение рН культуральной жидкости исследуемых образцов в период протекания ферментации

  л 20

  н

  

  0           3           5           7           10          15

  
  

Сутки

• ■    №1 ■ №2 ■ №3 ■ №4

Рис. 3. Результаты изменения титруемой кислотности в процессе культивирования данных не выявлял исследования, подкрепляющие или опровергающие данное предположение.

Результаты по измерению сухих веществ представлены на рис. 4.

Рефрактометрический анализ содержания сухих веществ показал, что на 0 день ферментации содержание сухих веществ (сахарозы) различно между образцами № 1, № 2 и № 3, № 4. Так как у последних образцов ферментации сладкого чая микроорганизмами чайного гриба предшествует сбраживание сахаров дрожжами. Минимальное содержание сухих веществ (сахаров) через 15 дней культивиро- вания наблюдалось у образцов № 3 (6,3 °Brix) и № 4 (6,0 °Brix).

Выводы

Модификация, улучшение существующих технологических процессов производства продуктов питания позволяет сократить продолжительность определенных этапов, следовательно, снизить затраты. В данной статье представлен способ сокращения продолжительности ферментации при получении «Ком-бучи».

В работе сравнивался прирост биомассы и содержание органических кислот в четырех видах напитков на основе чайного гриба: кон-

*

m о

X

м н u ID

У К

о

МгШп

Сутки

• ■    №1 ■ №2 ■ №3 ■ №4

Рис. 4. Результаты рефрактометрического анализа троль – традиционный напиток на сладком чае; напиток, полученный с дополнительной аэрацией; напиток с предварительным сбраживанием дрожжами; и напиток, совмещающий в себя и внесение дрожжей, и аэрацию. Результаты показали, что максимальная скорость прироста биомассы SCOBY (0,270 г/сутки) наблюдалась при использовании дополнительной аэрации. Максимальное содержание органических кислот в напитке наблюдалось при предварительном внесении дрожжей и дополнительной аэрации, к тому же скорость роста биомассы составляла 0,23 г/сутки. Данные представленного исследования позволяют получить напиток «Комбуча», сократив процесс культивирования SCOBY, увеличивая его биологически активное действие (за счет увеличения содержания органических кислот).

В дальнейшем авторами планируется создание новых функциональных напитков на основе чайного гриба, созданных за счет использования различного сырья, например, чая и/или смеси лекарственных трав, кофе, обезжиренного молока; различных сахаров (фруктозы, глюкозы и т. п.); с использованием в качестве добавок не только дрожжевых культур, но и молочнокислых штаммов. Оценка не только состава органических кислот в напитках, но и содержание витаминов и полифенолов.

Работа выполнена в рамках государственного задания по теме «Скрининг биологически активных веществ растительного происхождения, обладающих геропротекторными свойствами, и разработка технологии получения нутрицевтиков, замедляющих старение» (номер темы FZSR-2020-0006).