Подходы к классификации изолятов Listeria monocytogenes по вирулентности для лабораторных животных

Как известно, при возникновении любого заболевания большую роль играет вирулентность возбудителя, которую следует рассматривать как фенотипический признак, проявляющийся в способности инфекционного агента вызывать поражение клеток человека или животного. Она служит индивидуальным показателем, отражающим степень проявления патогенности как качественной характеристики микроорганизма и может изменяться под влиянием как экологических факторов, так и естественного состояния внутренней среды в организме хозяина. Вирулентные свойства бактериального штамма зависят от выработки определенных токсических веществ, на что, в свою очередь, влияет способ заражения патогеном, условия его жизнедеятельности при проникновении в макроорганизм или при культивировании в специфических питательных средах, а также от физиологического и иммунологического статуса хозяина, подвергшегося заражению (1).

Классически патогенность листериозных культур принято определять качественным методом — постановкой кератоконъюнктивальной пробы на морских свинках (2). Это дает возможность разделить культуры на две основные группы (патогенные и непатогенные), но не позволяет провести внутривидовое типирование, необходимое для установления источника инфекции и путей ее распространения, а также оценку эпидемической значимости изолятов, выделяемых из объектов внешней среды и пищевой продукции.

Для этих целей в большинстве случаев используют величину LD100 и LD50 для лабораторных животных. Сравнением этих показателей для различных штаммов устанавливают степень их сходства, эпидемическую и эпизоотическую опасность. Наиболее эффективны такие подходы при внутривидовом типировании возбудителей особо опасных болезней животных и человека. Например, для классификации и проведения внутривидового типирования возбудителя сибирской язвы по показателям вирулентности для лабораторных животных предложены три схемы — И.Н. Преснова, Г.И. Романова, Э.Н. Шляхова и Е.В. Груз (3-5). К сожалению, подобные схемы классификации при изучении биологии изолятов L. monocytogenes в настоящее время отсутствуют. В отечественной литературе имеются лишь отрывочные сведения об определении показателей вирулентности референс-культур и некоторых полевых изолятов листерий (2, 6-9). При этом все авторы отмечают неоднородность проявления вирулентных свойств листерий для лабораторных животных.

Целью представляемой работы было изучение патогенности различных культур Listeria monocytogenes и разработка подходов к созданию системы классификации изолятов листерий по их вирулентности для лабораторных животных.

Материалы . Использовали 30 штаммов и изолятов L . monocytogenes , выделенных из разнообразных источников и на различных географических территориях в разное время.

Патогенность культур определяли постановкой кератоконъюнкти-вальной пробы на морских свинках. Для этого на конъюнктиву глаза животного наносили 1-2 капли бактериальной суспензии (109 м.т./см3), которую готовили с использованием оптического стандарта мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (г. Москва). За морскими свинками наблюдали в течение 10 сут. Патогенными признавали культуры, которые вызывали формирование гнойного кератоконъюнктивита в течение 2-5 сут после инокуляции возбудителя.

Вирулентность оценивали вычислением показателей LD₁₀₀ и LD₅₀ в биопробах на аутбредных белых мышах. Для заражения использовали бактериальную агаровую культуру в экспоненциальной фазе роста, из которой готовили 5-кратные серийные разведения на физиологическом растворе. Мышей объединяли в 5 групп (по 6 гол.) по принципу аналогов. Животным каждой группы вводили внутрибрюшинно препараты возбудителя (0,50±0,05 см³, титры 1*10⁹, 2x10 8 , 4x10 7 , 8x10⁶ и 1,6x10⁶ м.т.).

Для получения достоверной информации о показателях вирулентности определяли содержание жизнеспособных клеток в первой заражающей дозе высевом серийных разведений на агаризованные питательные среды с вычислением по формуле:

С = X n + X n + 1 „ 1 •ю n ,

• 1, 1 V

где С — число жизнеспособных клеток в 1 см³ бактериальной суспензии; X_n — среднее арифметическое число колоний, выросших в чашках при высеве из разведения 10^{- n} ; X_{n +} 1 — среднее арифметическое число колоний, выросших в чашках при высеве из разведения 10 ^{- ( n +} 1) ; 1,1 — постоянный коэффициент; V — объем высеянной бактериальной суспензии; 10 ⁿ — разведение бактериальной суспензии, используемое при определении числа жизнеспособных клеток.

За показатель LD100 принимали минимальную из испытанных доз, вызывающую гибель 100 % взятых в опыт животных. Величину LD50 рассчитывали по формуле Кербера в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева (10).

Результаты. Перед разработкой подходов к классификации листерий по вирулентности для лабораторных животных оценивали патогенные свойства штаммов/изолятов листерий общепринятым способом — пробой Антона. Из 30 изучаемых штаммов/изолятов 29 вызывали формирование гнойного кератоконъюнктивита у морских свинок на 2-4-е сут после инокуляции патогена. При этом два штамма вызывали гибель морских свинок на 8-10-е сут после постановки кератоконъюнктивальной пробы. Подобный феномен также наблюдали Р.В. Гребенюк с соавт. (6), изучавшие патогенность изолятов листерий, выделенных от диких животных и членистоногих.

Согласно данным литературы, наиболее доступной и удобной моделью для определения вирулентности листерий считается белая мышь. Установлено, что белые мыши с живой массой менее 18 г при заражении летальными дозами интрацеребрально и внутрибрюшинно погибают в 100 % случаев, при внутривенном и подкожном заражении — в 75 % случаев (2). Мы для оценки степени патогенности листерий использовали аутбредных белых мышей с живой массой 14-16 г. Показатели вирулентности определяли на животных обоих полов.

Известно, что вирулентность одного и того же штамма микроорганизма может варьировать в зависимости от условий получения культуры, метода заражения, массы тела животного, сезона года и других факторов (11). Поэтому на первом этапе мы изучили влияния состава питательных сред и сезонов года на показатели LD₁₀₀ и LD₅₀ для белых аутбредных мышей. Опыты проводили с использованием референс-штамма L . monocytogenes № 766 (I серогруппа). Бактериальную массу листерий получали с использованием твердых (триптон-соевый и дрожжевой триптон-соевый агары) и жидких (сердечно-мозговой бульон) питательных сред. Определение показателей LD₁₀₀ и LD₅₀ проводили в зимний и весенне-летний периоды (табл. 1).

1. Показатели LD iqq и LD 50 референс-штамма Listeria monocytogenes № 766 (I серогруппа) для аутбредных белых мышей в зависимости от состава питательных сред и сезона года
Питательная среда	Производитель	Сезон года	Вирулентность для белых мышей, м.т./гол.
			LD 100         1        LD 50
СМБ          «Difco» (США)          Зима              4,00х108              3,58х107 СМБ          «Merk» (Германия)       Зима            > 3,75х108              1,97х107 СМБ          «Merk» (Германия)       Весна           > 5,65х108              2,97х107 ТСА          «HiMedia» (Индия)       Зима            > 5,75х108              3,03х107 ДТСА _________«HiMedia» (Индия)       Весна             3,24х108              4,97х107 Примечание. СМБ — сердечно-мозговой бульон, ТСА — триптон-соевый агар, ДТСА — дрожжевой триптон-соевый агар; м.т./гол. — микробных тел в расчете на 1 голову.

Полученные данные свидетельствуют о том, что состав питательной среды и сезон года не оказывали существенного влияния на вирулентность листерий для аутбредных белых мышей с живой массой 14-16 г — значения LD100 и LD50 соответствовали одному числовому порядку. Однако необходимо отметить, что в некоторых случаях, определяя показатель LD100 (как и в дальнейшем, когда устанавливали вирулентность полевых изолятов листерий), наблюдали выживание 1-2 особей в группах животных, зараженных максимальными дозами возбудителя, при гибели 100 % мышей, инфицированных меньшими дозами. Это согласуется с результатами экспериментов И.А. Бакулова с соавт. (2), показавшими, что иногда часть зараженных летальными дозами лабораторных животных выживает. По мнению авторов, это связано с индивидуальной устойчивостью, а также половой принадлежностью особей. Так, 93 % самцов морских свинок оказались устойчивыми к заражению возбудителем листериоза.

Анализ имеющихся в специальной литературе публикаций подтверждает, что в настоящее время чаще всего применяется значение LD50, 72

тогда как LD 100 практически не используется. Для определения величины LD₅₀ требуется меньшее число животных, а учитываемые показатели, подвергнутые статистической обработке, более точны (12). В настоящем исследовании при создании схемы классификации изолятов листерий по вирулентности для аутбредных белых мышей в дальнейшем использовали только показатель LD₅₀, позволяющий оперировать объективными данными. Для получения достоверной информации определяли верхние и нижние границы доверительного интервала, в котором с вероятностью 95 % находится действительная величина LD₅₀. Значения LD₅₀ / _max и LD s _{0/ min} для некоторых полевых изолятов представлены в таблице 2.

2. Показатели LD 50 у некоторых штаммов/изолятов Listeria monocytogenes для аутбредных белых мышей

Условное обозначение штамма/изолята	Источник и год выделения	Показатель LD50, м.т./гол.
		LD 50/max 1	LD 50/min
«А»	Пастбищный клещ, 1952	Не титруетсяа	Не титруется
61-06	Фекалии кабана, 2006	3,59х 106	5,20 х105
69-06	Лещ, 2006	2,32х107	4,63х106
71-06	Густера, 2006	2,82х107	5,51х106
76-06	Головной мозг овцы, 2006	1,82х107	3,64х106
134-08	Грунт подкормочных площадок, 2008	2,52х107	4,30х106
139-08	Фекалии кабана, 2008	2,18х107	4,35х106
243-09	Фекалии пятнистого оленя, 2009	2,67х106	5,34х105
311-07	Окунь, 2007	6,14х106	1,23х106
431-09	Фекалии пятнистого оленя, 2009	2,16х107	2,67 х106
434-09	Фекалии кабана, 2009	1,23х106	1,78х105
488-09	Фекалии пятнистого оленя, 2009	5,00х107	8,52х106
633-09	Фекалии кабана, 2006	3,00х107	4,35х106
699-09	Фекалии пятнистого оленя, 2009	9,48х106	1,37х106
39-12	Кровь сердца аборт-плода КРС, 2012	1,16х107	1,69х106
Референс-штамм № 634 (II серогруппа)	Головной мозг овцы, 1978	1,35х108	2,69х107
Референс-штамм № 766 (I серогруппа)	Труп свиньи, 1955	6,64х107	1,33х107
12б	Человек	2,30х106	2,00 х106
138б	Человек	3,20 х106	2,95х105
Костюченкоб	Человек	2,30х105	2,00 х105
Нелюбоваб	Человек	5,60х106	5,35х106
Примечание. КРС — крупный рогатый скот, а — показатель LD 100 выше 109 м.т./гол.;			б — изоляты,
полученные от больных людей, показатели LD 50 определены Б.И. Маракушей, К. Дарвишем ковским (1996; НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва).			и И.С. Тарта-

Установлено, что изучаемые культуры отличались друг от друга по показателю LD₅₀, хотя для большинства из них LD₅₀ / _min и LD₅₀ / _max находились в пределах 10 6 -10⁷ м.т./гол. На основе анализа результатов определения LD₅₀ у 30 культур L . monocytogenes была предложена схема дифференциации изолятов листерий по их вирулентности для белых аутбредных мышей.

Как оказалось, в зависимости от величины LD₅₀ / _m j _n и LD₅₀ / _max изоляты разделяются на пять групп, которые условно можно обозначить как высоковирулентные штаммы (LD₅₀ / _min и LD₅₀ / _max в пределах 10⁴10 6 м.т./гол.), вирулентные (LD₅₀ / _min и LD₅₀ / _max — 10 6 -10⁷ м.т./гол.), умеренно вирулентные (LD₅₀ / _min и LD₅₀ / _max — 10⁷-10⁸ м.т./гол.), слабовирулентные (LD₅₀ / _min и LD₅₀ / _max — 10⁸-10⁹ м.т./гол.) и авирулентные, у которых LD₅₀ не титруется (LD₁₀₀ выше 10⁹ м.т./гол.).

На основании разработанной нами схемы классификации изолятов L. monocytogenes по показателю LD50 для белых мышей были оценены вирулентные свойства у 30 полевых изолятов L. monocytogenes, выделенных из различных источников. Установлено, что изоляты, полученные от восприимчивых особей и диких животных-листерионосителей, относились, как правило, к группе высоковирулентных и вирулентных. В частности, изолят № 39-12, который вызвал в 2012 году в Нижегородской области вспышку листериоза среди поголовья крупного рогатого скота, сопровож- давшуюся абортами, вошел в группу вирулентных. Примеры дифференциации некоторых культур листерий представлены в таблице 3.

• 3.    Дифференциация некоторых культур Listeria monocytogenes по степени патогенности в соответствии с предлагаемой классификацией

Условное обозначение штамма/изолята | LD₅₀ / _min и LD₅₀ / _max, КОЕ/гол. | Оценка вирулентности"

№ 61-06	105-106	Высоковирулентный
№ 69-06	106-107	Вирулентный
№ 39-12	106-107	Вирулентный
Референс-штамм № 634 (II серогруппа)	10 7 -108	Умеренно вирулентный
«А»	Не титруется	Авирулентный

Принадлежность некоторых штаммов L . monocytogenes , обнаруженных у представителей дикой фауны, к группам высоковирулентных и вирулентных культур, к которым относятся и клинически значимые изоляты листерий, выделенные от людей с различной патологией, позволяет оценить их как эпизоотически и эпидемически значимые. При наличии определенных факторов (иммунодефицитные состояния животных и человека, суровые и голодные зимы, стресс, беременность и т.п.) изоляты из этих групп могут вызвать вспышки листериозной инфекции не только среди животных, но также у человека.

Таким образом, разработанные нами подходы к оценке вирулентности культур Listeria monocytogenes позволяют проводить их дифференциацию по патогенности и могут быть использованы для характеристики эпизоотической и эпидемической значимости изолятов, выделяемых от животных-листерионосителей и из объектов внешней среды. Это, в свою очередь, позволит своевременно корректировать проводимые противоэпи-зоотические мероприятия.