Поиск активного центра пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы из Pseudomonas fluorescens, ответственного за индукцию устойчивости к вирусу табачной мозаики у растений табака (Nicotiana tabacum L.)

Индуцирование устойчивости биогенными элиситорами или их аналогами признается перспективным направлением в современных технологиях защиты растений от болезней. Различные элиситоры, выделенные к настоящему времени из фитопатогенов или из не патогенных для растений микроорганизмов, представлены олигосахаридами, гликопротеинами, липидами, пептидами и белками. Первым белковым элиситором, нашедшим применение в сельском хозяйстве, был харпин, выделенный из бактерии Erwinia amylovora, на основе которого был разработан коммерческий препарат Messenger® (США). В проведенных нами ранее исследованиях из клеток штамма 197 Pseudomonas fluorescens был выделен белок-элиситор MF3, способный индуцировать устойчивость растений к вирусным и грибным патогенам. Столь широкий спектр действия предполагал перспективность использования MF3 в качестве потенциального средства защиты сельскохозяйственных культур от болезней. Была определена полная аминокислотная последовательность выявленного белка и показана высокая степень ее гомологии пептидил-пролил-цис/транс-изомеразам FKBP-типа той же бактерии, вследствие чего MF3 получил название Pf197_ППИ-аза. В отличие от многих белковых индукторов устойчивости растений к фитопатогенам Pf197_ППИ-аза обладает высокой термостабильностью, что облегчает выделение и очистку белка из клеточных лизатов с помощью их кипячения. Активные центры большинства известных белковых индукторов устойчивости растений к патогенам, как правило, связаны с наиболее консервативными участками полипептидной цепи. Мы предположили, что активный центр Pf197_ППИ-азы, ответственный за ее способность индуцировать устойчивость, может быть локализован в одной из наиболее консервативных аминокислотных последовательностей этого белка. Расчет такой последовательности при помощи биоинформационного ресурса PROSITE показал, что она содержит гидролизуемые трипсином сайты, образованные аминокислотами аргинином и лизином. Препараты Pf197_ППИ-азы были получены из штамма Escherichia coli BL21(DE3)+plMF3 - суперпродуцента ППИ-азы. Трипсинолиз Pf197_ППИ-азы приводил к утрате способности белка индуцировать устойчивость растений к патогенам, что косвенно подтвердило правильность нашего предположения об ответственности консервативного участка за элиситорную активность белка. Посредством химического синтеза (Пущинский филиал Института биоорганической химии) был получен соответствующий консервативному участку олигомер, состоящий из 29 аминокислот (Pf_29ак). Дальнейшие эксперименты показали, что эквимолярные концентрации Pf197_ППИ-азы и олигопептида Pf_29ак в одинаковой степени индуцируют устойчивость растений табака Nicotiana tabacum L. к вирусу табачной мозаики (ВТМ). Это было подтверждено в биотесте при подсчете развившихся некрозов на листьях растений табака ( Nicotiana tabacum L.) сорта Xanthi (NN). Листья обрабатывали исследуемыми препаратами и помещали во влажную камеру, инкубировали 1 сут при 22 °С, после чего инокулировали вирусом и выдерживали во влажной камере 3-4 сут при 22 °С. Полученные результаты позволили сделать вывод о том, что для индуцирования устойчивости растений к ВТМ достаточно одного консервативного участка Pf197_ППИ-азы. Далее предполагается определить минимальный размер активного центра, способного проявлять элиситорные свойства.