Поиск активного центра пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы из Pseudomonas fluorescens, ответственного за индукцию устойчивости к вирусу табачной мозаики у растений табака (Nicotiana tabacum L.)

Разработка различных технологий применения веществ биологического происхождения в растениеводстве признается перспективным направлением современной сельскохозяйственной науки (1-3). Подобные технологии применяются и для защиты растений от болезней, включая использование биопестицидов и индуцирование устойчивости биогенными элиситорами (4-7). В результате поиска биологически активных веществ с подобными свойствами выявлены микробные белки, способные вызывать у растений устойчивость к различным патогенам и вредителям (8-11). Один из таких белков, получивший название MF3 (microbial factor 3), был выделен нами из штамма Pf197 бактерии Pseudomonas fluorescens (12). Проведенные исследования показали, что MF3 не оказывает прямого влияния на фитопатогены, но может повышать устойчивость разных растений к ряду вирусных и грибных патогенов, в частности способствовать появлению системной устойчивости табака к вирусу табачной мозаики (ВТМ). Столь широкий спектр действия предполагал перспективность использования MF3 в качестве потенциального средства защиты сельскохозяйственных культур от болезней. Определение полной аминокислотной последовательности (13) показало высокую степень ее гомологии у MF3 и пеп-тидил-пролил-цис/транс-изомераз FKBP-типа (ППИ-азы) той же бактерии (14), в связи с чем MF3 получил название Pf197_ППИ-аза. В отличие от других белковых индукторов устойчивости растений к патогенам, например харпинов (15), Pf197_ППИ-аза обладает относительно низкой молекулярной массой — 16,9 кДа (13), а также высокой термостабильностью, что облегчает выделение и очистку этого белка из клеточных лизатов. Возможность деградации белков в природных условиях создает определенные ограничения для их использования в качестве средств защиты растений. Однако для многих белков, индуцирующих устойчивость растений к болезням, было показано, что элиситорной активностью обладает не только нативная молекула белка, но и ее фрагменты. Так, пептид flg22 (наиболее консервативный фрагмент аминокислотной последовательности бактериального флагеллина, проявляющего элиситорную активность), как и нативный флагеллин, может индуцировать у арабидопсиса окислительный взрыв, экспрессию PR-белков и синтез этилена, а также стимулировать отложение каллозы в тканях растения (16). Именно этот пептид, состоящий из 22 аминокислотных остатков, отвечает за элиситорные свойства, связывание и распознавание флагеллина растительными клетками (17). Известно также, что растения арабидопсиса специфично распознают N-концевой домен другого элиситорного белка — бактериального фактора элонгации Tu (EF-Tu), что приводит к активации системы защитных ответов растения. Аналогичный эффект может быть достигнут при использовании в качестве индуктора пептида elf18, входящего в состав упомянутого фактора элонгации и состоящего из 18 аминокислотных остатков (18). Белок холодового шока из Micrococcus lysodeikticus служит неспецифическим элиситором защитных реакций для представителей семейства Solanaceae. За элиситорную активность этого белка отвечает пептид csp15, расположенный в зоне консервативного домена и включающий 15 аминокислотных остатков (19, 20).

При исследовании Pf197_ППИ-азы нами впервые было обнаружено новое свойство у пептидил-пролил-цис/транс-изомераз FKBP-типа, а именно способность индуцировать устойчивость растений к фитопатогенам, в частности к вирусу табачной мозаики (ВТМ). Однако механизм этого явления оставался неизвестным. В частности, отсутствовали сведения о том, содержит ли названный белок аминокислотную последовательность, обусловливающую такую активность. В настоящей работе нами выявлен участок полипептидной цепи ППИ-азы из штамма 179 P fluorescens, отвечающий за элиситорные свойства этого белка, и получены экспериментальные подтверждения его роли в проявлении устойчивости растений табака к ВТМ.

Целью представляемой работы было определение фрагмента поли-пептидной цепи ППИ-азы из штамма 179 P. fluorescens, отвечающего за способность этого белка индуцировать устойчивость различных растений к фитопатогенам.

Методика. Препараты ВГ197_ППИ-азы были получены из штамма Escherichia coli BL21(DE3)+plMF3 — суперпродуцента ППИ-азы, который выращивали на среде YT (100 мл) в колбах; непосредственно перед посевом в среду добавляли ампициллин до конечной концентрации 100 мкг/мл. Инокулятом служила сток-культура штамма BL21(DE3)+plMF3, хранившаяся при -20 °C в 25 % глицерине. Колбы инкубировали на термостатируемой качалке Excella™ E-25/25R («New Brunswick Scientific Co., Inc.», США) при 250 об/мин (эксцентриситет 5 см) и температуре 37 °C в течение 20-22 ч. Полученную культуральную жидкость центрифугировали 30 мин при 4000 g. Осажденные клетки суспендировали в буфере (50 мМ Трис-HCl, 0,15 М NaCl, 2 мМ EDTA, рН 8,0), содержащем лизоцим (2 мкг/мл), и инкубировали в течение 30 мин при 37 °C. Клеточную суспензию обрабатывали ультразвуком (5 раз по 40 с) и помещали на кипящую водяную баню (20 мин, 100 °C) с периодическим перемешиванием, после чего быстро охлаждали на льду до 0 °C и центрифугировали (4000 g, 30 мин).

Супернатант, содержавший приблизительно 200 мг Pf197_ППИ-азы на 1 л культуральной жидкости, подвергали последовательной ультрафильтрации в ячейке Amicon 8050 («Millipore Corp.», C0A). Cначала супернатант разделяли с использованием селективной мембраны MWCO 100 kDa, а затем пермеат фильтровали через мембрану MWCO 10 kDa. В процессе ультрафильтрации происходило концентрирование целевого белка и его одновременное отделение от более высоко- и низкомолекулярных компонентов супернатанта.

Осветленный клеточный лизат наносили на колонку (25x50 мм) с наполнителем Chelating Sepharose (Ni2+) («Pharmacia», Швеция), уравновешенную 50 мМ Трис-HCl буфером (pH 7,5) с 0,25 М NaCl. Колонку тщательно промывали 50 мМ Трис-HCl буфером (pH 7,5), содержавшим 1 М NaCl. Белок элюировали линейным градиентом имидазола. Cкорость потока составляла 3 мл/мин, объем градиента — 300 мл. Элюат (50-60 мл) диализовали против 2 л дистиллированной воды при 4 °C. Поскольку ППИ-аза при кислых значениях pH выпадает в осадок, воду подщелачивали раствором NaOH до pH 7,0. Чистоту полученного раствора ППИ-азы оценивали при помощи гель-электрофореза по Лэммли (21). Для длительного хранения РЛ97_ППИ-азу лиофилизировали и хранили при -20 °C в герметично закупоренных пробирках.

Для выявления наиболее консервативных участков был выполнен анализ установленной ранее аминокислотной последовательности белка (12) с использованием биоинформационного ресурса PROSITE (22, 23).

Для подтверждения роли обнаруженного консервативного участка в индукции устойчивости Pf197_ППИ-азу обрабатывали трипсином, предварительно денатурировав прогреванием исходного препарата в 50 мM Трис-HCl буфере (pH 8,0), содержавшем мочевину (8 M) и меркаптоэтанол (4 мM), в течение 15-20 мин при 95 °C. После охлаждения раствор разбавляли 50 мM Трис-HCl буфером с 1 мM CaCl2 (pH 7,6) до конечной концентрации мочевины 1 М. К денатурированному белку добавляли трипсин в соотношении 1:20 (по массе) и инкубировали смесь при 37 °C в течение 1 ч, после чего ферментативную реакцию останавливали, добавляя фе-нилметилсульфонилфторид до концентрации 1 мМ. Полноту гидролиза кон-394

тролировали с помощью электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия.

Состоящий из 29 аминокислотных остатков олигопептид, соответствующий фрагменту одной из консервативных областей Bf197_ППИ-азы (далее обозначен как Bf_29ак), был синтезирован сотрудниками Пущин-ского филиала Института биоорганической химии ВАН.

Защитную активность оценивали в биотесте на листьях табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Xanthi (NN), выращенных в климатической камере при 16-часовом световом дне и температуре 24 °С днем и 20 °С ночью. У растений, достигших стадии 3-4 настоящих листьев, отделяли листья одного и того же яруса и обрабатывали их препаратами тестируемых веществ (по 5 листьев на вариант). При этом на одну из половинок каждого листа наносили водные или буферные растворы, содержавшие эквимолярные количества ВН97_ППИ-азы, смеси триптических пептидов, полученных после ее гидролиза, или синтезированного олигопептидного фрагмента ВГ_29ак. Вторые (контрольные) половинки тех же листьев обрабатывали дистиллированной водой или соответствующими буферными растворами, включающими все использованные для обработок соседних половинок компоненты, кроме анализируемого белка и пептидов. Так, в опытах с триптическими пептидами на контрольные половинки наносили буфер для протеолиза (см. выше) с инактивированным трипсином, а при анализе активности ВГ_29ак — 0,1 % водный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА), который использовался для растворения тестируемого олигопептида. При проверке инфекционности препарата ВТМ дополнительным контролем служили листья, на обе половинки которых перед заражением наносили дистиллированную воду. Обработанные листья помещали во влажную камеру, инкубировали 1 сут при 22 °С, а затем инокулировали ВТМ, используя сок растений табака, предварительно инфицированных вирусом, который разбавляли дистиллированной водой так, чтобы при нанесении 60 мкл сока на контрольных половинках образовывалось от 100 до 200 некрозов (в сок, содержащий ВТМ, добавляли карборунд). Инокулированные листья выдерживали во влажной камере 3-4 сут при 22 °С, после чего подсчитывали число развившихся некрозов. Опыты по оценке защитной активности каждого из анализируемых препаратов повторяли не менее 3 раз.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы STATISTICA 6.0 («SoftStat, Inc.», США). Определяли среднее стандартное отклонение и стандартную ошибку среднего арифметического. Вазличия между вариантами, согласно t -тесту, везде, где это не оговорено специально, достоверны при р > 0,05.

Результаты. Поскольку защитный эффект Вf197_ППИ-азы проявлялся при обработке филогенетически отдаленных растений против филогенетически неродственных патогенов (12), индуцируемая этим белком устойчивость носит неспецифический характер, а сам белок, возможно, вызывает активацию защитных ответов, общих для различных видов растений (24). Известно, что типичными индукторами таких ответов служат элиситоры МАМВ/ВАМВ-типа (Microbial Associated Molecular Battern/Bath-ogen Associated Molecular Battern) (25, 26), представляющие собой метаболиты микроорганизмов, в том числе белки, необходимые им для жизнедеятельности и поэтому всегда присутствующие в их составе. При этом сайтами распознавания в процессе взаимодействия с растениями обычно оказываются наиболее консервативные участки элиситорных молекул, например такие пептидные фрагменты, как упомянутые выше flg22, elf18 и csp15 (9, 27). Исходя из этого, мы предположили, что Bf197_ППИ-аза также 395

может содержать пептидный фрагмент, с которым связана ее активность против фитопатогенов, в частности против ВТМ, причем весьма вероятно, что такой фрагмент будет локализован в консервативной зоне молекулы.

В результате поиска генов, гомологичных гену, кодирующему Pf197_ППИ-азу, проведенного с помощью программы Scan Prosite (22, 23), выявили более 45 сходных по составу генов ППИ-аз разных организмов (28). Далее был осуществлен поиск консервативных последовательностей внутри Pf197_ППИ-азы и обнаружены две основные консервативные области (рис.). В одной из них располагался наиболее консервативный фрагмент, состоящий из 29 аминокислотных остатков. Чтобы проверить возможную ассоциацию элиситорной активности с этим консервативным участком, провели специфический протеолиз ферментом, расщепляющим белок в том числе внутри этого участка (см. рис.).

Потеря или снижение активности Pf197_ППИ-азы могли бы свидетельствовать о том, что центр, ответственный за его протективную активность, расположен внутри найденной консервативной области. С помощью программы Peptide Cutter для протеолиза был выбран фермент трипсин, гидролизующий пептидные связи, образованные остатками основных аминокислот — аргинина и лизина. В результате обработки трипсином исследуемый белок должен был расщепиться, в том числе внутри предполагаемой консервативной области, образовав 10 фрагментов (см. рис.).

Tryps Tryps                                     Tryps         Tryps

IIII

MLIAANKAVSIDYTLTKHAGEVIDSSAGGAPLVYLQGAGNIIPGLEKALEGKAVGDDLEV ।       ----------1-----------1-----------1-----------r|----------11- ^o

Tryps

I

AVEPEDAYGEYAAELVSTLSRSMFEGVDELEVGMQFHASAPDGQMQIVTIADLDGDDVTV 61     —--------^4----------4----------4-----------b---------4----------4-120

Tryps Tryps

Tryps I I Tryps

DGNHPLAGQRLNFKVKIVDIRDASQEEIAHGHVHGEGGHHH 121 ---------+---------+---------+---------+- 161

Схема действия трипсина (Tryps) на РА97_ППИ-азу FKBP-типа, выделенную из Pseudomonas fluorescens. Светло-серым цветом выделены консервативные области, темно-серым — наиболее консервативный фрагмент (Pf_29 ак).

В качестве тест-системы для определения устойчивости растений использовали модель ВТМ—некрозообразующий сорт табака Xanthy. Она оказалась удобна тем, что позволила, подсчитывая число некрозов на листьях, получать достаточно точную количественную оценку степени индуцируемой устойчивости.

Результаты эксперимента показали, что предварительная обработка листьев табака раствором пептидов, полученных в результате трипсинолиза, не препятствовала развитию некрозов после заражения ВТМ, то есть расщепление Pf197_ППИ-азы лишало ее способности вызывать устойчивость. На половинках листьев, обработанных исходным белком, число некрозов было существенно меньше, чем при обработке смесью триптических пептидов (табл. 1). Таким образом, обработка Pf197 ППИ-азы трипсином приводила к образованию неактивных пептидов, что свидетельствует о повреждении трипсином части молекулы ППИ-азы, ответственной за ее элиситорные свойства.

1. Влияние предварительной обработки продуктами трипсинолиза Pf197_ ППИ-азы на заражение листьев табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Xanthy вирусом табачной мозаики (ВТМ) (Х±х)

Вариант |                 Препарат                 | Число некрозов на половинке листа "

I       Продукты протеолиза (пептиды), 1 мкг/мл                          93,4±17,0a

Контрольный раствор                                           96,2±18,1a

II      Продукты протеолиза (пептиды), 1 мкг/мл                         116,2±20,4b

Контрольный раствор + Pf197_ ППИ-азы 1 мкг/мл                12,4±1,8b

Примечание. Тестируемые растворы продуктов протеолиза наносили на одну половинку листа, другую половинку того же листа обрабатывали контрольными растворами (контрольный раствор — это буфер, в котором проводилась рестрикция белка, с добавлением инактивированного трипсина). Данные, отмеченные одинаковыми буквами, статистически не отличаются друг от друга (р > 0,05).

В состав одной из наиболее консервативных областей Pf197_ППИ-азы входит пептид, который состоит из 29 аминокислотных остатков: IIPGLEKALE GKAVGDDLEV AVEPEDAYG (Pf_29ак). В условиях лаборатории искусственного климата мы изучили способность пептида Pf_29ак индуцировать устойчивость к ВТМ у листьев табака. Для минимизации воздействия на пептид протеиназ в раствор пептида добавляли 0,1 % БСА. При исследовании защитных свойств синтетического олигопептида (табл. 2) было показано, что предобработка листьев растворами Pf_29ак в трех концентрациях индуцировала устойчивость к ВТМ как обработанных половинок, так и (в определенной степени) соседних, то есть имел место трансламинарный эффект. Таким образом, было установлено, что синтетический олигопептид обладает способностью индуцировать устойчивость листьев табака к ВТМ.

2. Влияние предварительной обработки листьев табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Xanthy растворами пептида Pf_29ак и Pf197_ППИ-азы разной концентрации на образование некрозов при заражении вирусом табачной мозаики (ВТМ) (Х±х)

Вариант обработки	Половинка листа	Число некрозов на половинке листа	Степень защиты, %
БСА (0,1 %)	Контроль	294,9±13,2
Pf 29ак (0,5 нМ) + БСА	Опыт	96,7±44,7	67,2
(0,1 %)	Контроль	235,0±25,5	20,3
Pf197 ППИ-аза	Опыт	193,2±9,7	34,5
(5,9 нМ) + БСА (0,1 %)	Контроль	251,7±41,5	16,7
Pf29ак	Опыт	62,3±22,0	78,9
(5 нМ) + БСА (0,1 %)	Контроль	186,3±58,5	36,8
Pf197 ППИ-аза	Опыт	49,7±17,3	83,7
(59 нМ) + БСА (0,1 %)	Контроль	277,5±33,1	5,9
Pf29ак (50 нМ) + БСА	Опыт	60,8±15,3	79,4
(0,1 %)	Контроль	200,2±75,7	32,1

Примечание. БСА — бычий сывороточный альбумин.

Сравнение действия пептида и исходного белка проводили, выражая их количество в наномолях. Так, при обработке Pf197_ППИ-азой в концентрации 1 мкг/мл, что соответствует 59 нМ, листья были защищены на 80-90 %, в концентрации 5,9 нМ — примерно на 30 %. В то же время в варианте с раствором пептида Pf_29ак в концентрации 5 нМ защитный эффект достигал 78,9 %. Таким образом, синтетический пептид обладал не меньшими защитными свойствами, чем нативная молекула Pf197_ППИ-азы.

FK506-связывающие белки (FKBP) относятся к большому семейству пептидил-пролил-цис/транс-изомераз (28). Несмотря на то, что эти белки известны довольно давно, их внутриклеточные функции до конца не изучены. Белки FKBP-типа вовлечены во многие внутриклеточные процессы, такие как сигналинг, белковый трафик и транскрипция. Они участвуют в процессах роста и развития растений, что было показано в 397

опытах с блокированием генов растений, кодирующих белки FKBP-типа. Инактивация двух подобных генов у Arabidopsis показала причастность этих белков к регуляции биосинтеза таких важных гормонов, как цитокинины и брассиностероиды. Эти два белка FKBP-типа вовлечены в передачу сигнала в клетке разными путями, регулируя сборку сложных белков или их активность (29). Белки FKBP-типа участвуют в упаковке вновь синтезируемых полипептидов, а также в транспорте и сборке клеточных белковых комплексов (30). Помимо того, что ППИ-азы одного организма могут ингибировать рост другого организма за счет конкурентного связывания с рецепторами, некоторые циклофилины, по-видимому, способны непосредственно подавлять рост грибов. Так, циклофилин C-CyP с молекулярной массой 20 кДа, выделенный из китайской капусты (Brassica campestris L. ssp. pekinensis), обладает фунгитоксичным действием и ограничивает in vitro рост Candida albicans, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Trichoderma harzianum и T viride. В меньшей степени белок сдерживает рост мицелия Fusarium solani и F oxysporum. Наконец, C-CyP не оказывает влияния на развитие Aspergillus flavus (31). В отличие от описанного выше белка Pf197_ППИ-аза, выделенная нами из P. fluorescens, не проявляет прямого антигрибного или антивирусного действия, однако это первая из ППИ-аз FKBP-типа, для которой показана способность индуцировать устойчивость растений к патогенам.

Для того чтобы выяснить, определяет ли Pf_29ак минимальный размер активного центра, планируется создать библиотеку более коротких олигопептидов в пределах этой последовательности. Тестирование биологической активности таких пептидов позволит выявить минимальный фрагмент молекулы Pf197_ППИ-азы, достаточный для индуцирования устойчивости растений к патогенам, либо установить, что для этого необходима полная последовательность Pf_29ак.

Итак, аминокислотная последовательность Pf197_ППИ-азы содержит участок, повреждение которого приводит к потере индуцирующей активности. Этот фрагмент соответствует наиболее консервативной части последовательности и состоит из 29 аминокислот. Искусственно синтезированный гипотетический олигопептид Pf_29ак в эквимолярных концентрациях обладает такой же элиситорной активностью, как и нативная молекула Pf197_ППИ-азы. Иными словами, активный центр молекулы Pf197_ППИ-азы, ответственный за его способность индуцировать устойчивость растений к патогенам, представлен фрагментом, состоящим, по крайней мере, из 29 аминокислот.