Поиск ДНК-зависимого механизма в формировании и поддержании долговременной памяти при раннем обонятельном обучении

Известно, что обонятельное обучение в ранний постнатальный период формирует устойчивую долговременную память, сохраняющуюся, часто, на протяжении всей жизни. Согласно современным представлениям основой прочного хранения нового ольфакторного опыта у неона-тов служат долговременные структурно - функциональные перестройки в синаптических контактах нейронов и их ансамблей в развивающихся обонятельных луковицах [8], а маркером пластических перестроек в развивающемся мозге, индуцированных обучением – экспрессия транскрипционного фактора немедленного раннего гена с-Fos [2, 5]. Экспериментальные данные об амнестических эффектах нуклеотидных аналогов и субстратных ингибиторах синтеза ДНК, данные об индукции синтеза ДНК под влиянием обучения у взрослых животных и цыплят [1, 3, 4] свидетельствуют о возможном участии ДНК-зависимого механизма в процессах долговременной пластичности в мозге.

Однако возникает вопрос, насколько этот механизм является универсальным и может ли он реализоваться при обучении незрелорождающихся животных в раннем онтогенезе, характеризующемся продолжением нейрогенеза в структурах головного мозга. Известно, что в этот же период в обонятельных луковицах новорожденных мышат иммунно-гистохимически детектируется большое количество пролиферирующих нейрональных клеток-предшественников. Распределение их в луковицах имеет четко выраженнный ростро-каудальный градиент. Показана их тесная корреляция с возрастом [7]. Максимальное число прогениторных клеток в луковицах наблюдается на 3-ий постнатальный день (PD3) и резко снижается на PD7. В более позднем возрасте (PD21 и далее) обнаруживаются только единичные клетки. Установлено, что нейрональные прогениторные клетки образуются из стволовых клеток в передней субвентрикулярной зоне боковых желудочков мозга, откуда они по ростро-медиальному пути (РМП) мигрируют в обонятельную луковицу и в дальнейшем дифференцируются в интернейроны [6].

Данная работа посвящается исследованию возможного участия ДНК-зависимого механизма в формировании и хранении долговременной памяти у мышат в раннем постнатальном периоде в модели обучения пассивному избеганию запаха хищника.

Мышат линии C57BL/6 в возрасте 8 суток на 5 мин помещали в пластиковый бокс размером 6×6×5 см, в котором находилась капсула с запахом хищника. Источником запаха служила подстилка из домашнего лотка хоря, пропитанная его мочой и фекалиями. В конце 5-й минуты мышонку прищипывали кончик хвоста в течение 2 секунд. За 1 час до обучения мышатам из опытной группы вводили нуклеотидный аналог 5-бромо-2'-дезоксиуридин (BrdU, Sigma) в дозе 50 мг/кг, внутрибрюшинно, который включается в синтез ядерной ДНК при апоптозе, пролиферации, а также при репарации. Животным из контрольной группы вводили физиологический р-р в том же объёме. Через 3 дня детенышей тестировали на избегание запаха хищника в специальной пластиковой камере двойным дном. Пространство между верхним и нижним дном камеры было разделено на два равных отсека, один отсек которого был заполнен чистыми опилками, а другой – субстратом с запахом хищника. Мышонка помещали в середину камеры на перфорированную пластину и в течение 1мин регистрировали время пребывания его в отсеке с запахом хищника. Затем возвращали в домашний бокс. Через 1 мин процедуру повторяли. Общее время тестирования составило 5 мин.

Детекцию включения BrdU в клетки мозга проводили на срезах толщиной 20 мкм в двух группах животных: у мышат, обученных навыку пассивного избегания запаха хищника, и у мышат, не подвергавшихся никаким воздействиям, кроме введения BrdU. Флюоресцентное иммуногистохимическое (ИГХ) выявление BrdU в клетках мозга мышат проводили с использованием первичных антител sheep anti-BrdU 1:500 (Novus biological, USA). При двойном окрашивании были использованы следующие первичные антитела: к митотическому маркеру – rabbit anti-Ki67 1:150 (Chemicon, USA); к апоптотическому ферменту – rabbit anti-caspasa-3 1:300 (Sigma, USA); к нейрон-специфическому ядерному белку – mouse anti-NeuN 1:300 (Chemicon, USA); и к транскрипционному фактору немедленного раннего гена c-Fos – goat anti-c-Fos 1:1000 (Santa Cruz Biotechnology, USA). Визуализацию первичных антител осуществляли с помощью вторичных антител, конъюгированных с Alexa Fluor: 1) anti-sheep Alexa Fluor 488 1:500 (Introgen, USA); 2) anti-rabbit Alexa Fluor 568 1:500 (Introgen, USA); 3) anti-goat Alexa Fluor 568 1:500 (Introgen, USA). Работа выполнена с соблюдением основных биоэтических правил.

При тестировании через 3 дня мышата контрольной группы демонстрировали стойкое избегание отсека с запахом хищника, что свидетельствовало о формировании у них устойчивой долговременной памяти, в то время как у опытных мышат с инъекцией BrdU наблюдалась амнезия.

ИГХ исследование обнаружило включение BrdU в пролиферирующие нейрональные прогениторные клетки, о чём свидетельствовала колоколизация BrdU и митотического маркера Ki67, и отсутствие ее с апоптотическим ферментом каспазой-3. Уже через 2 часа после обучения у опытных мышат по сравнению с необученными животными наблюдалось 4-х кратное увеличение количества BrdU-положительных клеток, мигрирующих из рострального расширения РМП в обонятельную луковицу. В результате этого на 3-и сутки после обучения в ядерной области луковицы образовалось большое скопление из плотно расположенных клеток предшественников, откуда они ускоренно мигрировали в гломерулярный и поверхностный гранулярный слои, преимущественно в запах-специфическую область луковицы. Об ускоренной миграции свидетельствовало значимое увеличение BrdU - положительных клеток в этих слоях у обученных мышат по сравнению с необученными животными. На 5-е сутки в обонятельных луковицах наблюдалась массовая повсеместная миграция пролиферирующих клеток. С помощью двойного иммуно-гистохимического окрашивания BrdU и нейрон-специфического ядерного белка (NeuN) установлено, что уже на 10-е сутки после обучения многие BrdU-положительные клетки коэкспрессировали NeuN, что свидетельствовало об их дифференцировке в интернейроны. Помимо этого было обнаружено, что через 24 часа после обучения в каудальной части обонятельных луковиц преимущественно в глубине гранулярного слоя выявляется значительное количество BrdU-положительных пролиферирующих клеток, находящихся в различных стадиях митотического цикла, в отличие от единичных делящихся клеток, наблюдаемых там же у контрольных животных .

Результаты двойного мечения BrdU с транскрипционным фактором c-Fos, показали, что раннее обонятельное обучение, наряду со зрелыми нейронами, вовлеченными в процесс консолидации памяти и претерпевающими пластические изменения, индуцирует экспрессию c-Fos в отдельных BrdU – положительных незрелых нейронах, расположенных в митральном, гранулярном и гломерулярном слоях в запах-специфической области обонятельной луковицы. Эти новообразованные модифицированные нейроны в дальнейшем могут обладать новыми качествами и отличаться от других нейронов, например, продолжительностью жизни, более эффективными синапсами, а также увеличенным количеством шипиков на отростках дендритов и соответственно самих синапсов. Такие новообразованные нейроны после их интеграции в пресуществующие бульбарные сети могут опосредовать их модификацию.

Таким образом, обонятельное обучение в ранний постнатальный период стимулирует бульбарный нейрогенез, активируя процесс пролиферации в нейрональных прогениторных клетках в обонятельных луковицах, а также индуцируя ускорение миграции этих клеток и, тем самым, способствует ускоренному образованию интернейронов. Амнестический эффект BrdU, наблюдаемый при тестировании на 3-и сутки после обучения свидетельствует о необходимости синтеза ДНК для поддержания долговременной памяти в данной модели раннего обонятельного обучения.