Поиск и изучение генов, кодирующих металло-бета-лактамазы, у госпитальных штаммов Pseudomonas aeruginosa

Карбапенемы – это один из важнейших классов антибиотиков, сочетающий исключительно широкий спектр антибактериальной активности, низкую токсичность и благоприятные фармакологические параметры (Галкин, 2007). Меропенем и имипенем, наряду с другими «антисинегнойными» средствами, являются препаратами выбора в терапии тяжелых нозокомиальных инфекций, вызванных P. aeruginosa (Руднов, 2005; Иванов и др., 2009).

Наиболее распространенным механизмом резистентности к карбапенемам у P. aeruginosa является их ферментная инактивация. Этот механизм может реализовываться с помощью бета-лактамаз трех классов: некоторыми ферментами классов А и D и металло-бета-лактамазами класса В (Queenan, Bush, 2007). Для P. aeruginosa описано пять основных групп карбапенемаз молекулярного класса В, подкласса В1: VIM, IMP, SPM, GIM и SIM. Все они содержат по два атома цинка и различаются аминокислотными последовательностями. Гены, кодирующие большую часть этих ферментов, в составе генных кассет включены в различные мобильные элементы, в основном интегроны 1-го класса.

VIM-1-карбапенемаза (for “Verona integron-encoded metallo-lactamase”) была впервые выделена из нозокомиального штамма P. aeruginosa в Вероне (Италия) в 1997 г. (Lauretti, Riccio, Mazzariol et al., 1999). Позднее описан VIM-2-фермент из штамма, изолированного еще в 1996 г. во Франции (Poirel, Naas, Nicholas et al., 2000). Госпитальные штаммы P. aeruginosa чаще всего продуцируют именно VIM-ферменты (Lee, Lim, Yum et al., 2002; Черкашин, Федорчук, Иванов и др., 2006; Шевченко, Эйдельштейн, Степанова, 2007). Внутри VIM-карбапенемаз выделяют две большие филогенетические линии: подгруппа VIM1 (VIM-1, 4, 5, 12, 14, 19) и подгруппа VIM2 (VIM-2, 3, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 23), в отдельный кластер выделен единственный фермент VIM-7 (Toleman, Rols-ton, Jones, Walsh, 2004). Сегодня описано 25 вариантов этих ферментов, и их список постоянно пополняется #table1). Первый фермент IMP-группы (for “active on imipenem”) был описан у А. baumannii, изолированного в госпитале Италии (Riccio, Franceschini, Boschi et al., 2000). После этого IMP-карбапенемазы найдены во всем мире, включая США и Австралию. GIM-1-фермент (for “German imipenemase”) был изучен в Германии в 2002 г. (Castanheira, Toleman, Jones et al., 2004), SPM-1 (for “Sao Paulo metallo-lactamase”) впервые выделен у штаммов P. aeruginosa из Сан-Паулу в Бразилии (Poirel, Magalhaes, Lopes, Nordmann, 2004). Фермент SIM-1 (for “Seoul imipenemase”) – последний из металло-лактамаз описан в Корее (Lee, Yum, Yong et al., 2005). Если SPM-, GIM- и SIM-ферменты почти не распространись за пределы

страны их происхождения, то VIM и IMP-металло-бета-лактамазы описаны по всему миру и продолжают обнаруживаться не только у P. aeruginosa , но и у других видов бактерий (Queenan, Bush, 2007).

Цель настоящего исследования – поиск и изучение генов металло-бета-лактамаз у нозокомиальных штаммов P. aeruginosa .

Материалы и методы исследования

Исследовано 34 штамма P. aeruginosa , обладающих фенотипическими признаками продукции ме-талло-бета-лактамаз (положительных в ЭДТА-тесте) (Arakawa et al., 2000). Культуры выделены в 2008– 2009 гг. от больных крупных хирургических стационаров г. Перми (краевая клиническая больница – ККБ, городская клиническая больница – ГКБ) и пос. Лобаново Пермского края (центральная районная больница – ЛКБ).

ДНК получали, как описано G.G. Stone, R.D. Oberst, S. Hays et al. (1994). Петлю биомассы бактериальной культуры инокулировали в 100 мкл сверхчистой воды, прогревали при 95°С в твердотельном термостате «Термит» 15 мин, пробы охлаждали, центрифугировали 5 мин при 12 тыс. об./мин. Супернатант использовали в генетических исследованиях.

Генетическое типирование (фингерпринтинг) штаммов осуществляли с использованием методов

RAPD-ПЦР (с праймером М13) и BOX-ПЦР (Versa-lonic et al., 1994). Продукты реакции разделяли посредством электрофореза в 1.2%-ном агарозном геле.

Таблица 1

Праймеры для ПЦР-анализа генов металло-бета-лактамаз

Рестрикционный анализ амплифицированных фрагментов ДНК, с использованием праймеров к bla VIM-2 -гену, проводили с помощью эндонуклеазы Hind II. 5 мкл ПЦР-продукта обрабатывали 1 ед. ре-стриктазы (Fermentas, Литва) с использованием рекомендуемого буфера и при соответствующем температурном режиме.

«Healthcare» (США) использовался согласно рекомендациям производителя. Для секвенирующей ПЦР использовали те же праймеры, что и для наработки ампликонов. Предварительный анализ гена blaVIM-2 и «внутреннего» фрагмента генов blaVIM и поиск гомологичных последовательностей осуществляли, используя программы BLAST и базы данных GenBank/EMBL/DDBJ . Далее их анализировали с использованием программ CLUSTAL X 1.83 (Thompson et al., 1994), TREECON version 1.3b (Van de Peer et al., 1994). Анализ первичной структуры белков осуществляли с помощью программы Vector NTI 10 . Поиск гомологичных последовательностей выполнен с использованием программ BLAST. Выравнивание аминокислотных последовательностей проведено с помощью программы CLUSTAL X 1.83.

Результаты и их обсуждение

Скрининг штаммов на наличие генов, кодирующих металло-бета-лактамазы

Для определения родства выделенных изолятов и отбора штаммов для дальнейших исследований проведено их генетическое типирование. Штаммы P. aeruginosa , выделенные от больных ГКБ, распределились в две геномогруппы. Изоляты 2ПЛ, 31 и 60, полученные из ЛКБ, обладают индивидуальными RAPD-профилями. Все культуры P. aeruginosa ККБ образуют одну геномогруппу (табл. 2). На матрице ДНК исследуемых штаммов была проведена амплификация нуклеотидных последовательностей, гомологичных гену bla VIM-2 и консервативному участку генов группы VIM.

Таблица 2

Распределение исследуемых штаммов P. aeruginosa в геномогруппы

ЛПУ	Изолят	Геномо-группа
ГКБ	11р, 9р, 2р, 10к, 11к, 12к, 13к, 1-13, 2-1, 2-4, 2-9, 3-4, 3-6, 3-7, 3-9, 3-14, 3-16, 3-17, 3-22, 3-22а	I
	125, 127, 128, 129	II
ККБ	195, 196, 197, 198, 201, 203	III
ЛКБ	2 ПЛ	IV
	31	V
	60, 18	VI

Специфичная амплификация была обнаружена у 34 штаммов, изолированных из 3 стационаров (ГКБ, ККБ, ЛКБ) (рис. 1). Амплифицированные участки ДНК длиной около 260 п.н. соответствуют по размеру консервативной части генов группы VIM, а ДНК-фрагменты размером 800 п.н. – полному bla VIM-2 -гену.

261 п.н.

---►

801 п.н. ◄---

1   2  3   4   5   6   7  8   9  10   11 12 13   14

А

В

Рис. 1 . Электрофореграмма продуктов амплификации консервативных последовательностей (А) и полных генов (В), кодирующих металло-бета-лактамазы, изолятов P. aeruginosa :

1, 9 – штамм 129 (ГКБ, геномогруппа II); 2,10 – штамм 3-16 (ГКБ, геномогруппа I); 3, 11 – штамм 198 (ККБ, геномогруппа III); 4, 12 – штамм 2ПЛ (ЛКБ, геномогруппа IV); 5, 13 – штамм 31 (ЛКБ, геномогруппа V); 6, 14 – штамм 60 (ЛКБ, геномогруппа VI); 7 – маркер молекулярных масс pUC19 ДНК/MspI (“Силекс”, Россия); 8 – маркер молекулярных масс O’GeneRuler^TM 100bp Plus DNA Ladder (“Fermentas”, Литва)

Амплификация с праймерами к фланкирующим участкам генов других металло-бета-лактамаз не дала положительного результата.

ПДРФ-анализ амплифицированных участков

Для выявления сходства и различий между исследуемыми генами, кодирующими VIM-карба-пенемазы, был проведен анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифициро-ванных последовательностей. Набор рестрикционных фрагментов, полученный после обработки ампликонов blaVIM-2-гена исследуемых штаммов ре-стриктазой HindII, был представлен фрагментами ДНК длиной 414 и 387 п.н. (рис. 2). Длины полу- ченных рестрикционных фрагментов сопоставимы с длинами фрагментов на рестрикционных картах гена blaVIM-2 известных карбапенеморезистентных штаммов P. aeruginosa (рис. 3).

Анализ нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов bla VIM-2

Определены нуклеотидные последовательности фрагментов и полных генов металло-бета-лактамаз группы VIM, амплифицированные с ДНК штаммов P. aeruginosa 3-16, 127, 2ПЛ, 31, 60, 198, являющихся представителями разных геномогрупп. Анализ нуклеотидной последовательности фрагментов длиной около 260 п.н. исследуемых штам- мов показал их 100%-ное сходство между собой, а также с известными последовательностями гена blaVIM-2 на участке с 114 по 353 нуклеотид. Исследуемые участки ДНК размером 615-741 п.н. были на 99–100% сходны с последовательностью blaVIM-2-гена известных штаммов (табл. 3, рис. 4). Степень сходства с геном blaVIM-2 референтного штамма P. aeruginosa COL-1 (GenBank AF191564.1) составила 99-100%. Обнаружены точечные нуклеотидные замены в последовательности исследуемых генов у 4 штаммов (табл. 3), в трех из них выявлена замена аминокислотного остатка.

У штаммов P. aeruginosa 2ПЛ, 31 и 3–16 обнаружена точечная мутация bla VIM-2 -гена в позиции 85, несущая замену серина на пролин, которая характерна для генов, кодирующих ферменты подгруппы VIM-1 и VIM-7 (Lauretti et al., 1999; Tole-man et al., 2007). Учитывая, что эта область находится на поверхности белка и удалена от активного центра, данные замены не влияют на связывание фермента с субстратом – антибиотиком. Несмотря на выявленные нуклеотидные замены результаты сравнительного анализа свидетельствуют о наличии bla VIM-2 -генов в штаммах P. aeruginosa , изолированных из крупных стационаров г. Перми и пос. Лобаново.

1  2  3  4   5 6  7  8  9  10 11 12 13 14 15

Рис. 2 . Электрофореграмма гидролиза ПЦР-продуктов амплификации bla VIM-2 -гена, обработанных Hind II:

1, 12 – маркер молекулярных масс O’GeneRuler^TM 100bp Plus DNA Ladder; 2, 13 – ампликоны bla VIM-2 -гена; изоляты из ЛКБ: 3 – штамм 2ПЛ; 4 – штамм 31; 5 – штамм 60; изоляты из ККБ: 6 – штамм 198; 7

– штамм 201; 8 – штамм 203; изоляты из ГКБ: 9 – штамм 3-16; 10 – штамм 128; 11 – штамм 127; 14 – штамм 1-13; 15 – штамм 3-9

0.1

VIM2 (GQ853417.1)

VBI16 (ELT419746)

VBI15 (ELT419745)

VIM18 (АМ778091)

VIM3 (PS-26/00)

там (AY165025)

mill (AY605049)

2 ПЛ

bla VIM-1

109      305                387

bla VIM-2

414                 387

801 п.н.

Рис. 3 . Карты расположения сайтов реестрик-ции эндонуклеазы Hind II на генах bla VIM .

Карты построены с помощью программы Vector NTI для известных последовательностей, кодирующих металло-бета-лактамазы основных ферментов группы VIM (подгруппа VIM-1 – карта на примере bla VIM-1 идентична картам других ферментов данной подгруппы, подгруппа VIM-2 – карта на примере bla _VIM-2 соответствует картам остальных ферментов данной подгруппы, за исключением bla _VIM-13)

юо

3-16

— VIM8 (AY524987)

¥IM5(PSEK5)

VIM1 (Y180502)

таи 4 (FJ445404)

VIM4 (GU250441)

VIM13(EF577407)

Рис. 4 . Древо сходства нуклеотидных последовательностей полных генов металло-бета-лактамаз (группа VIM) бактерий рода Pseudomonas , построенное методом UPGMA :

“Bootstrap”-анализ проведен на 1000 повторностях. Жирным крупным шрифтом выделены штаммы, исследуемые в данной работе. В скобках указаны номера последовательностей, депонированных в GenBank, или обозначение штамма

Таблица 3

Анализ нуклеотидной последовательности фрагментов полных генов bla VIM-2

Штамм	Размер секвенированного фрагмента, п.н. (расположение на гене bla VIM-2 P. aeruginosa COL-1 )		Сходство с bla VIM-2 P. aeruginosa COL-1 , %	Нуклеотидные замены*	Аминокислотные замены*
2ПЛ	665	с 24 п.н. по 689 п.н.	99	Т85С	S29P
31	637	с 68 п.н. по 704 п.н.	99	T85C	S29P
60	615	с 51 п.н. по 665 п.н.	100	-	-
3-16	741	с 61 п.н. по 801 п.н.	99	T85C	S29P
127	678	с 97 п.н. по 774 п.н.	99	G744A	нет замены
198	637	с 63 п.н. по 698 п.н.	100	-	-

*Номер замены соответствует месту нуклеотида и аминокислотного остатка от начала гена bla _VIM-2

Заключение

Таким образом, устойчивость к карбапенемам 34 культур P. aeruginosa , изолированных из двух стационаров г. Перми и пос. Лобаново, обусловлена продукцией ими металло-бета-лактамаз группы VIM, и в частности – фермента VIM-2. Можно предположить, что в Пермском крае циркулируют преимущественно продуценты VIM-2-подобных ферментов. Полученные результаты согласуются с литературными данными о распространенности VIM-2-обусловленной карбапенеморезистентности внутрибольничных штаммов P. aeruginosa в России и странах Европы (Poirel, Naas, Nicholas et al., 2000; Черкашин, Федорчук, Иванов и др., 2006; Шевченко, Эйдельштейн, Степанова, 2007).