Поиск корректоров метаболических нарушений при сахарном диабете 2-го типа среди 5-замещенных бензимидазолов, содержащих во втором положении циклическую алкиламиногруппу

Производные бензимидазола представляют крайне перспективный класс соединений для поиска и создания лекарственных препаратов вследствие наличия широкого спектра фармакологической активности. У данной группы соединений продемонстрированы антигистаминная, антиоксидантная, противосудорожная, анальгетическая, антиаритмическая, антисеротониновая, антиагрегантная, антитромботическая, гемореологическая, местноанестезирующая [1–3] антибактериальная, противопаразитарная, противогрибковая, противотуберкулезная, противоопухолевая [7] активности.

Так, O. E. Owen с соав. (1985) продемонстрировали, что противогельминтный препарат – Мебендазол, производное 5-бензоилбензимида-зол-2-карбомата оказывает гипогликемическое действие за счет повышения секреции инсулина β-клетками, что послужило началом поиска препаратов для терапии сахарного диабета (СД) и его осложнений среди производных бензимидазола [10]. В связи с этим были проведены исследования по выявлению антидиабетических свойств среди производных бензимидазола [2, 5, 6].

* Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №14-25-00139).

* Работа частично финансировалась в рамках проектной части государственного задания в сфере научной деятельности, проект № 4.196.2014/ К и выполнена с использованием оборудования ЦКП «Молекулярная спектроскопия» Южного федерального университета.

Современный уровень научных исследований этиологии и патогенеза СД позволяет находить новые мишени для антидиабетических соединений и создавать новые классы препаратов для пероральной сахароснижающей терапии. Следует отметить разнонаправленность поиска лекарственных препаратов: так, восстановление инсулиносекреторной функции β-клеток поджелудочной железы, посредством ингибирования дипептидилпептидазы 4-го типа (ДПП-4) является одним из перспективных подходов в терапии СД 2-го типа [9, 12]. M. B. Wallace с соав. синтезировали серию не ковалентных ингибиторов ДПП-4 на основе N-метилбензимидазола, среди которых найдено соединение с высоким уровнем ингибирующей активности (IC50 = 8 нМ) [14].

Применение ингибиторов гликогенфосфо-рилазы (ГФ) было предложено в качестве одной из терапевтических стратегий терапии СД 2-го типа. Ингибирование данного фермента будет препятствовать гликогенолизу, обеспечивая снижение производства глюкозы в печени и снижение уровня глюкозы крови, обеспечивая тем самым потенциально новый метод лечения СД 2-го типа [13].

Помимо этого необходимо отметить важность поиска и доклинического исследования ингибиторов не ферментативного гликозилирования белков (ингибиторов реакции Мейларда) и препаратов с антиоксидантной активностью, как средств ранней патогенетической коррекции осложнений СД. На сегодняшний день нет соединений, специфически угнетающих образование конечных продуктов гликирования, применяемых в клинической практике [11]. Интерес к данной проблеме и поиску лекарственных средств, способных тормозить реакцию Мейларда, снижать образование конечных продуктов гликирования и предотвращать развитие осложнений СД, неуклонно растет. Таким образом, мишень-ориентированный поиск новых антидиабетических средств является актуальным направлением в современной диабетологии.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы 5-замещен-ные бензимидазолы I–V, содержащие во втором положении циклическую алкиламиногруппу. Данные соединения были синтезированны сотрудниками НИИ ФОХ ЮФУ.

III

IV                               V

I R=H (a), Me (б), МеО (в); III R=H (a), Me (б), Cl (г); IV R= Me (б), Сl (г); V R = H (a), Me (б), MeO (в).

Для оценки способности соединений ингибировать дипептидилпептидазу 4-го типа (ДПП-4) по Yogisha S. (2010) с модификацией смешивали 10 мкл раствора исследуемого соединения в концентрации 0,1 мМ с 50 мкл 0,1 М Трис-HCl буфера (pH 8,4) и 40 мкл плазмы человека. Анализируемую смесь преинкубировали при 37 °С в течение 5 мин. После преинкубации добавляли 100 мкл 1 мМ субстрата реакции – Гли-Про-p-нитроанилида (Sigma, США) и полученную смесь инкубировали при 37 ° С в течение 15 мин. Развитие желтого окрашивания из-за высвобождения 4-нитроанилина определяли при 405 нм, используя прибор для считывания планшетов (ELx800, Bio Tec, США) [15]. В качестве препарата сравнения был выбран ситаглиптин (Sigma, США).

Для оценки ГФ ингибиторной активности in vitro 100 мкл 50 мМ HEPES буфера с pH 7,2 содержащего 100 мМ хлорид калия, 2,5 мМ хлорид магния, 0,5 мМ глюкозо-1-фосфата (Sigma, США), 1 мг/мл гликогена, преинкубировали с мышечной гликогенфосфорилазой α кролика (Sigma, США) и исследуемыми соединениями при 30 °С 30 минут. После преинкубации количество высвобожденного неорганического фосфата измеряли через 20 минут после добавления 150 мкл 1 М раствора HCl, содержащего 10 мг/мл молибдата аммония и 0,38 мг/мл малахитового зеленого. Развитие окрашивания определяли при 620 нм, используя прибор для считывания планшетов (ELx800, Bio Tec, США) [16]. В качестве вещества сравнения был выбран CP316819 (Sigma, США). Для определения ингибирующей концентрации (IC50) разведения соединении и CP316819 в 14 % ДМСО в концентрации от 10 мМ добавляли в реакционную смесь, при этом в контрольную смесь без ингибитора вносили ДМСО в аналогичной концентрации.

Реакцию гликирования белков моделировали в реакционной смеси, содержащей глюкозу (500 мМ), бычий сывороточный альбумин (БСА) (1 мг/мл), растворенные в фосфатном буферном растворе (рН 7,4) [8]. В экспериментальные образцы добавляли растворы изучаемых веществ в конечной концентрации 1 мМ, в контрольные образцы – фосфатный буферный раствор в эквивалентном объеме (50 мкл). В качестве препарата сравнения использовали Аминогуанидин. Образцы инкубировали при температуре 60 ° С в течение суток. По истечении срока инкубации на спектрофлуориметре MPF-400 (Hitachi, Япония) при длине волны возбуждения 370 нм и испускания 440 нм проводили определение специфической флуоресценции гликированного БСА. Антигликирующую активность рассчитывали по отношению к показателю флуоресценции контрольных образцов.

Антиоксидантное действие соединений определяли in vitro на модели аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов (ПОЛ) печени крыс [4]. О скорости окисления судили по накоплению малонового диальдегида, определяемого с помощью тиобарбитуровой кислоты. Вещества изучали в концентрации 1 мкМ. Для оценки эффективности соединений рассчитывали процент ингибирования реакции. Действие веществ сравнивали с активностью дибу-нола (Merck, Германия).

Статистическую обработку данных проводили с использованием U-критерий Манна–Уитни с использованием пакета программ Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd, UK).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯИ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе представлены результаты ми-шень-ориентированного поиска новых соединений с антидиабетическим действием в группе 5-замещенных бензимидазолов I–V, содержащих во втором положении циклическую алкиламиногруппу. Среди изученных производных бензимидазола у соединений Ia, II, Va ДПП-4 ингибирующая активность была ниже, чем у препарата сравнения ситаглиптина в 1,3 раза (см. табл.).

ДПП-4 ингибирующая, ГФ ингибирующая, антигликирующая и антиоксидантная активность соединений I–V

Шифр	ДПП-4 ингибирующая активность (0,1 мМ), Δ % ингибирования	ГФ ингибирующая активность(0,1 мМ), Δ % ингибирования	Антигликирующая активность (1 мМ), Δ % ингибирования флуоресценции БСА	Антиоксидантная активность (модель аскорбат-зависимого ПОЛ, 1 мкМ), Δ % ингибирования
I a	67,1 ± 18,5		–	26,9 ± 2,8*◊
I б				36,1 ± 4,2*
I в	41,7 ± 20,6	18,3 ± 7,8	–	–
II	65,8 ± 8,8		11,68 ± 5,98◊	24,5 ± 5,3*
III a	34,8 ± 5,0		0,43 ± 0,43◊	32,1 ± 3,1*
III г	42,1 ± 2,7	14,6 ± 5,5	14,53 ± 5,60*◊	–
III б	58,3 ± 11,3	19,0 ± 3,7	–	–
IV г	54,6 ± 18,5	20,9 ± 4,7	14,81 ± 5,90◊	–
IV б	59,0 ± 4,4	16,4 ± 7,3	–	28,2 ± 3,6*
V а	65,4 ± 5,3		–	24,5 ± 3,2*◊
V б	52,4 ± 17,4	28,3 ± 4,3	–	–
V в	38,2 ± 19,0	23,8 ± 3,1	–	–
Аминогуанидин			70,68 ± 5,71*
Дибунол				38,2 ± 1,0*
Ситаглиптин	88,0 ± 1,6
CP316819		81,2 ± 4,0*

П р и м еч а н и я:

* данные достоверны по отношению к контролю, U-критерий Манна–Уитни (p < 0,05);

◊ данные достоверны по отношению к показателям препарата сравнения, U-критерий Манна–Уитни (p < 0,05);

… – не исследовалось;

«–» – отсутствие эффекта;

БСА – бычий сывороточный альбумин; ГФ – гликогенфосфорилаза; ДПП-4 – дипептилпептидаза 4-го типа;

ПОЛ – перекисное окисление липидов.

Следует отметить, что данные вещества во втором положении бензимидазола имеют метилпиперазиновый, гидроксиэтилпиперазино-вый и морфолиновый радикалы.

Однако введение в пятое положение базовой структуры метильного радикала или хлора приводит к снижению эффективности ингибирования ДПП-4. Так, соединения IIIб, IVг, Vб, содержащие пирролидиновый, пиперидиновый и мофо-линовый заместитель во втором положении, уступали по активности препарату сравнения в 1,6 раза. Iв, IIIа, IIIг, Vв продемонстрировали низкий уровень активности.

Ингибирование гликогенолиза является одним из перспективных фармакологических подходов в терапии СД 2-го типа. Ингибиторы ГФ снижают распад гликогена и повышенную продукцию глюкозы печенью и воздействуют на один из основных патогенетических факторов, что позволяет корректировать гипергликемию и не приводит к гипогликемии. В данном исследовании все соединения по уровню активности значительно уступали соединению CP 316819, которое является высокоактивным ингибитором индол-карбоксиамидного сайта ГФ.

Помимо этого необходимо отметить важность поиска и доклинического исследования ингибиторов неферментативного гликирования белков (ингибиторов реакции Мейларда) и препаратов с антиоксидантной активностью как средств ранней патогенетической коррекции осложнений СД.

В результате изучения антигликирующей активности установлено, что вещества II, IIIг и IVг снижают специфическую флуоресценцию гликированного БСА на 11,7; 14,5 и 14,8 % соответственно, уступая препарату сравнения Аминогуанидину. Остальные соединения не оказывают влияния на образование КПГ.

При исследовании антиоксидантной активности были выявлены соединения Iв и IIIа, которые по своей способности тормозить процессы ПОЛ в тест-системе in vitro сопоставимы с препаратом сравнения Дибунолом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, у производных бензимидазола I–V выявлено ДПП-4 ингибирующее и антиоксидантное действия, а представленные базовые структуры могут быть использованы для оптимизации и создания высокоактивных соединений.