Поиск природных изолятов Bacillus thuringiensis для создания экологически безопасных биологических препаратов

В настоящей работе впервые получены изоляты ВtН1 ¹ 17 и ВtН10 ¹ 56, которые могут использоваться при создании полифункциональных биологических пестицидов.

Нашей целью было выделение из природных субстратов, идентификация и отбор бактерий Вacillus thuringiensis — перспективных продуцентов биопрепаратов против вредителей и болезней растений.

Методика . Сбор 30 образцов из различных субстратов (почвы, листьев ботвы картофеля, личинок и имаго колорадского жука) проводили в 1063

Ленинградской области на картофельных полях. Для выделения микроорганизмов 1 г почвы, листовую пластинку или насекомых (больных и трупы), фламбированных над пламенем спиртовки и растертых в ступке, помещали в пробирку с 5 мл стерильного физиологического раствора, встряхивали в течение 1 мин и 1 каплю полученной взвеси вносили в чашки Петри на рыбный агар (РА) методом истощающегося мазка. При выделении из насекомых (больных, живых, трупов) их предварительно фламбировали над пламенем спиртовки, стерильным пестиком тщательно растирали в ступке и переносили в пробирки с 5 мл физиологического раствора. После минутного встряхивания каплю суспензии наносили на поверхность РА методом истощающегося мазка. Чашки инкубировали в термостате при 28 ° С. Через 7 сут изучали морфологический тип колоний и при микроскопировании (микроскоп Laboval 4, «Carl Zeiss Jena», Германия, увеличение *900) учитывали образование кристаллов 5 -эндотоксина и спор. Колонии, отобранные по морфологическим признакам, характерным для Bt, пересевали штрихами на РА в чашки Петри, разделенные для на 8 секторов.

На этом же этапе готовили и просматривали мазки, окрашенные по В.А. Смирнову (19) с использованием черного анилинового красителя.

Предварительный скрининг изолятов осуществляли по признакам энтомоцидности, идентификацию — согласно схемам для В . thuringiensis по H. De Barjac и A. Bonnefoi (20) и О. Lysenko (21).

При изучении биохимических свойств микроорганизмов взамен жидких дифференциально-диагностических сред использовали системы индикаторных бумажных (СИБ) дисков (НПО «Микроген» МЗРФ, Россия) с определенным количеством субстрата в сочетании с соответствующим индикатором, стабилизированных пленкообразующим покрытием (поливиниловый спирт). При определении способности использовать углеводы в 0,3 мл стерильного 0,85 % раствора NaCl (pH 7,3±0,1) суспендировали содержимое одной микробиологической петли суточной агаровой культуры, выращенной при температуре 29±1 ° С, и в нее погружали диск с соответствующим углеводом (контролем — диски, погруженные в стерильный 0,85 % раствор NaCl). Учет проводили через 5-18 ч. Аналогичным образом с применением СИБ оценивали индолообразование, уреазную активность, усвоение сероводорода, образование ацетилметилкарбинола (АМК).

Продуктивность изолятов определяли на дрожже-полисахаридных средах при выращивании глубинным способом в колбах Эрленмейера на качалке с аэрацией (220 об/мин) в течение 72 ч при 29 ° С до образования спор и кристаллического эндотоксина. Титр клеток учитывали общепринятым методом серийных разведений с высевом на РА.

Энтомоцидную активность, выраженную в ЛК₅₀ для личинок колорадского жука ( Leptinotarsa deсemlineata Say) природной популяции, а также содержание экзотоксина как ЛК₅₀ для личинок комнатной мухи ( Musca domestica Linnaeus) определяли согласно описанию (22).

Антифунгальную активность оценивали методом агаровых блоков (23). Для этого тест-культуры грибов ( Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum ) выращивали на картофельном агаре в чашках Петри сплошным газоном в течение 7 сут. В расплавленный и охлажденный до 40 ° С картофельный агар вносили культуру изолятов Bt с соответствующим титром в количестве 10 % к объему среды, перемешивали и разливали в чашки Петри. На поверхность застывшего агара с Bt помещали блоки (диаметром 1 см), вырезанные из 7-суточного газона тест-культуры гриба. Контролем служила среда без Bt. Чашки помещали в термостат при 28 ° С. Через 7 сут измеряли диаметр колоний гриба. Процент ингибирования роста колоний гриба рассчи-1064

тывали по формуле W.S. Abbot (24) как (Д к - Д о ) • Д_к ^{- 1} • 100, где Д к и Д о — диаметр колоний гриба соответственно в контроле и опыте, см.

Селекцию Bt осуществляли в несколько этапов: рассев культуры на РА методом истощающегося мазка, отбор типичных для Bt колоний (серо-вато-белыго цвета, округлые или неправильной формы с мелкошероховатой поверхностью), микроскопический анализ культуры с учетом образования 5 -эндотоксина и спор в соотношении 1:1, оценка на технологичность при культивировании глубинным методом и на содержание экзотоксина по ЛК₅₀, мкл/г корма для личинок Musca domestica.

Полученные данные обрабатывали с помощью стандартного метода дисперсионного анализа (25). Рассчитывали средние ( M ) и стандартные ошибки средних (±SEM). Статистическую значимость различий оценивали по t -критерию Стьюдента при доверительном интервале 95 % (р < 0,05).

Результаты. Из разных субстратов были получены 30 образцов и исследованы на микрофлору. Рассевы проводили на рыбном агаре (РА). Из проанализированных более чем 3500 колоний по морфологическим признакам, цвету, форме и консистенции были отобраны 86 изолятов рода Bacillus. После рассева культур через 7 сут при 26-28 ° С происходит лизис спорангиев и высвобождение спор и кристаллов эндотоксина. При рассеве образовывались серые или кремовые плоские матовые колонии с неправильными контурами, по консистенции мягкие, мелкозернистые. По морфолого-культуральным признакам (табл. 1) мы отобрали 12 изолято, относящихся к BtH₁ и BtH_10.

1. Морфолого-культуральные признаки изолятов Вacillus thuringiensis ssр., выделенных из природных субстратов в Ленинградской области

Признак	BtH 1	BtH 10
Окрашивание по Граму	Грамположительные	Грамположительные
Форма и размер вегетативных клеток	Ровные или слегка извилистые палоч-	Палочковидные клетки размером
	ки размером 2,5-3,0½0,8-0,9 мкм	1,2-1,5½2,5-4,5 мкм
Подвижность	Перитрихиальное жгутикование	Перитрихиальное жгутикование
Соединение клеток	Короткие цепочки	Единичные или короткие цепочки
Образование спор	Субтерминальное	Субтерминальное
Форма и размер спор	Овальные 0,8-0.9½1,1-1,3 мкм	Овальные 0,8-1,4 мкм
Форма и размер кристалличе-	Правильная ромбовидная с четки-	Тетрагональная, бипирамидальная
ского белкового эндотоксина	ми гранями, 1,2-4,5½0,5-2,3 мкм	или овоидная, 0,2-0,6½0,3-0,8 мкм
Диаметр	0,8-1,5 см	0,4-0,8 см
Поверхность	Мелкошероховатые	Шероховатые
Профиль	Плоские	Плоские
Оптические свойства	Матовые	Непрозрачные, матовые
Окраска колоний	Серо-белые	Серовато-белые
Окраска субстрата	Не изменяется	Не изменяется
Край	Неровный	Неровный
Структура	Мелкозернистая	Мелкозернистая
Консистенция	Мягкая	Мягкая

Рост колоний выделенных изолятов В. thuringiensis H 1 (слева ) и В. thu-ringiensis H 10 (справа) на рыбном агаре.

Вид колоний на рыбном агаре у изолятов несколько различался (рис.). Микроскопия показала, что они наряду со спорами образуют кристаллы эндотоксина разной формы.

При изучении основных физиолого-биохимических признаков было установлено (табл. 2), что из 12 отобранных изолятов 5 относятся к Ba- cillus thuringiensis var. thuringiensis (ВtH1) и 7 — к Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis (ВtH10). Из источников азота они использовали пептон, мясной и рыбный бульон, дрожжи белковые кормовые, расщепляли глюкозу, маннозу, левулезу, мальтозу, целлобиозу, не использовали галактозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу, лактозу, раффинозу, маннит, дульцит, сорбит, инулин, инозит. Эти изоляты разжижали желатин, пептонизировали молоко, гидролизовали крахмал, использовали цитраты, образовывали ацетилметилкарбинол. Образование пигмента и уреазы у них не отмечали. Индол и сероводород они не использовали, редуцировали нитраты в нитриты. Изоляты ВtH1, в отличие от изолятов BtH10, образовывали лецитиназу, расщепляли сахарозу, салицин, глицерин. В остальном по биохимическим признакам они были схожими (см. табл. 2).

• 2.    Основные физиолого-биохимические свойства изолятов ВtH₁ и BtH₁₀, выделенных из природных субстратов в Ленинградской области

  ¹ изолята	1 1 1	2	1 3 1	4	1 5	1 6 1	7 1	8 1	9	1 10 1	11
  5          +     +      -      +     +     +     +     +      +      +     + 17         +     +      -      +     +     +     +     +      +      +     + 28         +     +      -      +     +     +     +     +      +      +     + 46         +     +      -      +     +     +     +     +      +      +     + 82         +     +      -      +     +     +     +     +      +      +     + BtH1 (эталон)       +     +      -      +     +     +     +     +      +      +     + 12          +      -      -      +     +      -      +       -      -       +     + 15          +      -      -      +     +      -      +       -      -       +     + 32          +      -      -      +     +      -      +       -      -       +     + 35          +      -      -      +     +      -      +       -      -       +     + 39          +      -      -      +     +      -      +       -      -       +     + 48          +      -      -      +     +      -      +       -      -       +     + 56          +      -      -      +     +      -      +     +       -       +     + BtH10 (эталон)       +       -      -       +      +       -       +      +        -        +      + П р и м еч а ни е. «+» и « - » — проявление или отсутствие признака; 1, 2, 3, 4, 5 — образование соответственно ацетилметилкарбинола, лецитиназы, пигмента, экзотоксина, пленки на мясопептонном бульоне (МПБ), 6, 7, 8, 9 — использование соответственно сахарозы, маннозы, глицерина, салицина, 10 — расщепление крахмала, 11 —протеолиз мясопептонного желатина.

• 3.    Биологическая характеристика изолятов ВtH₁ и ВtН₁₀, выделенных из природных субстратов в Ленинградской области ( М ±SEM)

У отобранных изолятов сравнили технологичность, экзотоксинооб-разование и антифунгальную активность (табл. 3).

¹ изолята	Титр спор в культуральной жидкости, ½109/мл	Содержание экзотоксина, ЛК 50 , мкл/г корма для Musca domestica	Ингибирование роста колоний, %
			Botrytis cinerea	Fusarium oxysporum
5	2,0±0,3	6,7±0,2	13,9 ±1,2	11,2 ±0,9
17	2,5±0,2	5,0±0,2	18,2 ±1,9	13,4 ±1,1
28	1,7±0,2	7.6±0,3	15,3 ±1,8	12,4 ±1,2
46	1,3±0,4	8,4±0,2	11,8 ±0,9	9,7 ±1,5
82	1,7±0,3	8,1±0,1	12,7 ±1,1	8,2 ±0,8
BtH1 (эталон)	2,5±0,2	4,1±0,2	18,8 ±1,4	12,1 ±1,2
12	1.4±0,1	6,9±0,2	50,5 ±1,9	37,4 ±1,4
15	2,3±0,3	6,1±0,1	61,9 ±1,8	57,4 ±1,7
32	1,7±0,2	7,5±0,3	52,1 ±2,0	40,9 ±1,6
35	1,9±0,1	7,8±0,2	48,4 ±1,6	38,1 ±1,3
39	1,5±0,1	8,1±0,2	58,4 ±1,8	42,3 ±0,9
48	1,9±0,2	6,3±0,1	60,3 ±2,1	52,1 ±1,6
56	2,4±0,2	4,9±0,2	72,3 ±1,7	65,3 ±1,2
BtH10 (эталон)	2,6±0,1	3,9±0,2	73.3 ±1,9	66,1 ±2,0

Прим еч ани е. Данные обрабатывали методом дисперсионного анализа при доверительном интервале 95 %.

Выделенные штаммы Вtв дополнение к инсектицидной активности обладали антифунгальным действием, но у штаммов ВtH1 она была значительно ниже, чем у ВtH10. По нашим данным (15, 17), механизм антифун-гального действия Вt связан с несколькими факторами. Бактерии продуцируют и выделяют во внешнюю среду литические ферменты, в частности протеазу и хитиназу, которые лизируют клеточные стенки фитопатогенных грибов. При лизисе содержимое гиф гриба становится источником питания и энергии для бацилл (26).

Выполненный анализ производственно значимых показателей позволил отобрать штаммы ВtH₁ ¹ 17 и ВtН₁₀ ¹ 56, продемонстрировавших наилучшие результаты. Так, по технологичности и содержанию экзотоксина штамм ВtH₁ ¹ 17 превосходил остальные соответственно в 1,25-1,90 и в 1,34-1,68 раза, штамм ВtH₁₀ ¹ 56 — в 1,23-1,70 и в 1,28-1,65 раза. С целью улучшения этих признаков у изолятов ВtH₁ ¹ 17 и ВtН₁₀ ¹ 56 мы провели их селекцию. Через 7 сут роста после высева методом истощающего мазка из 50 колоний каждого изолята методом микроскопии отобрали по 25 вариантов с образованием кристаллического эндотоксина и спор в соотношении 1:1. Далее при глубинном культивировании отобрали по 10 вариантов с титром не менее 3½10⁹ КОЕ/мл и оценили у них содержание экзотоксина и энтомоцидную активность (22). У изолята ВtH₁ ¹ 17 титр спор (½10⁹/мл культуральной жидкости) в результате составил 3,3±0,2 против исходного 2,5±0,2 (на 32,0 % технологичнее), содержание экзотоксина (ЛК₅₀, мкл/г корма для Musca domestica ) — 3,8±0,2 против 5,0±0,2 (на 24,0 % больше); у ВtН₁₀ ¹ 56 эти показатели равнялись соответственно 3,8±0,2 против 2,4±0,2 (на 58,3 % технологичнее) и 2,9±0,2 против 4,9±0,2 (на 40,8 % больше) (различия статистически значимы при p < 0,05).

Энтомоцидная активность изолятов ВtH1 ¹ 17 и ВtH10 ¹ 56, выраженная в ЛК50 для личинок колорадского жука 2-го возраста, была высокой — соответственно 0,26 и 0,24 % (при определении использовали культуральную жидкость Вt в концентрациях 5; 1; 0,25 %; контроль — вода).

В заключение следует отметить, что изучение потенциала использования и механизмов действия штаммов Bt, поиск и описание свойств вновь выделяемых изолятов как возможных агентов в биоконтроле вредителей и болезней растений остаются крайне актуальными (27-29). Полученные нами результаты указывают на перспективность штаммов ВtH₁ ¹ 17 и ВtH₁₀ ¹ 56 в качестве продуцентов биопрепаратов, причем ВtН₁₀ ¹ 56 обладает одновременно энтомоцидной и антифунгальной активностью, то есть полифункциональностью (на этот штамм подана заявка на изобретение). Эти данные согласуются с результатами выполненных ранее исследований полифукциональной активности бактерий В. thuringiensis , у которых, наряду с биоинсктицидыми свойствами, нами обнаружены антифунгальный и ростстимулирующий эффекты (26).

Таким образом, наши исследования в очередной раз подтверждают, что энтомопатогенные кристаллообразующие бациллы Bacillus thuringiensis встречаются в почве, листьях, больных насекомых и их трупах, в местах обитания насекомых. Идентификация и биотестирование показали, что выделенные нами изоляты, относящиеся к серовариантам Bacillus thuringiensis var. thuringiensis и B. thuringiensis var. darmstadiensis , по биологическим свойствам и практической значимости близки к типовым штаммам. Очевидно, что с помощью аналитической селекции, подбора питательных сред и режимов культивирования можно усилить практически ценные свойства этих изолятов и с успехом использовать их в качестве продуцентов биопрепаратов с энтомоцидными и антифунгальными свойствами для контроля численности вредных насекомых и фитопатогенов. Особый интерес представляют изоляты с множественной активностью, отнесенные к серо-варианту BtH_l0. Микробные препараты полифункционального действия могут составить конкуренцию химическим пестицидам не только с точки зрения экологической безопасности, но и по экономическим показателям, учитывая защитный эффект против вредителей и болезней.