Показатели групповой стресс-резистентности у интактных крыс при воздействии физиологического стрессора

Известно, что стресс – это возможность организма неспецифическим образом адаптироваться и приобрести устойчивость к воздействию любых факторов необычного характера, интенсивности или продолжительности действия [6].

Индивидуальная стрессоустойчивость, с одной стороны, определяется особенностями центральных и периферических стресс-реализующих механизмов, таких как нейрохимические и электрофизиологические изменения в нервной системе. К значимым эффекторным механизмам относят базальный уровень выработки в гипоталамусе кортикотропин-рилизнг-гормона и адренокортикотропного гормона в гипофизе, состояние аргинин-вазопрессиновой системы; общий уровень симпатикотонии и высокая реактивность адренергической системы в центральных и периферических структурах стресс-системы; активность периферической продукции кортикостероидов и катехоламинов. С другой стороны, устойчивость к стрессу зависит от состояния стресс-лимитирующих механиз- мов: состояния ГАМК-ергической системы; активности опиодергической системы с выработкой эндогенных опиатов, β-эндорфинов и энкефалинов; центрального и периферического синтеза субстанции Р; состояния дофаминергической, серотонинергической и глицинергиче-ской систем; синтеза адениннуклеотидов и простагландинов; состояния антиоксидантной системы клеток; общего уровня активности парасимпатической нервной системы и уровня ацетилхолина; общего состояния активности NO-ергической системы и, соответственно, базальной и стимулированной продукции оксида азота; локальной резистентности периферических тканей и органов, которые находятся под большим риском их стрессового поражения, например тканей пищеварительного тракта [5].

На клеточном уровне механизмы стрессовых изменений реализуются за счет активности белка p53 и мРНКp53, способных инициировать репарацию поврежденной ДНК или включение механизмов апоптоза [10]; сохранения клеточного протеостаза при активации «Развернутого белкового ответа» (UPR) в эндоплазматическом ретикулуме; инициации транскрипционного ответа через ядерный фактор NF-kB [7]; прекращения ресурсоемкого синтеза рибосомной РНК (рРНК) с помощью длинных некодирующих РНК (lncRNAs) [9].

Экспериментальное изучение индивидуумов с разной прогностической устойчивостью к стрессу дает возможность устанавливать показатели групповой стресс-резистентности, прогнозировать возникновение повреждений стрессового характера и предотвращать их появление своевременным назначением патогенетической терапии.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Определить показатели теста «Открытое поле» у экспериментальных крыс с разной устойчивостью к стрессу, с одновременным измерением содержания ионизированного кальция (Са2+) и магния (Mg2+) в эритроцитах и плазме крови из подключичной вены (Vs), иммуногистохимических показателей интенсивности экспрессии эндотелиальной нитроксидсинтазы (eNOS) в слизистой оболочке желудка.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Белых крыс линии Вистар разделили на две подгруппы (стрессоустойчивых и стрессонеустойчивых) по показателям теста «Открытое поле».

Тест «Открытого поля» проводился внутри квадратной белой площадки размерами 1 м2 (100 × 100 см) с непрозрачными бортами высотой 40 см. На белом полу вольера была нанесена черная координатная сетка, делящая поле на 25 (5 × 5) равных квадратов. Помимо этого, красным цветом была выделена центральная зона (внутренние 9 квадратов в центре арены). В центрах пересечения основных линий были сделаны отверстия. Экспериментальный вольер освещался лампой мощностью 50 Вт, расположенной на высоте 150 см над центром поля. Тестирование проводилось в тихой комнате в течение 3 минут и начиналось с помещения лабораторного животного в центральную зону. Наблюдение за животным велось через зеркало, закрепленное над площадкой, в котором отражалась поведенческая активность лабораторных крыс. Регистрировались следующие показатели:

• -    горизонтальная активность (ГА) определялась как число пересеченных квадратов в площадке «открытое поле» всеми четырьмя лапами крысы через разделяющую линию;

• -    вертикальная активность (ВА) устанавливалась как число подъемов животного на зад-

• ние лапы со свободными передними конечностями или вставаний с опорой на стенку арены;

• -    поисковая активность (ПА) подсчитывалось при засовывании головы животным внутрь отверстий на пересечении разграничивающих линий «по глаза» или число обнюхиваний краев этих отверстий;

• -    центральная зона (ЦЗ) – регистрировалось количество выходов крысы в центральный сектор площадки «открытого поля», выделенный красной краской;

• -    груминг (Г) – оценивались быстрые непродолжительные движения лап вокруг носа и морды животного (короткий груминг) и длительный груминг (умывание области глаз, зоны за ушами и умывание всей головы, лап, туловища, боков, области ануса и гениталий, а также хвоста);

• -    болюсы (Б) – подсчитывалось число болюсов, оставленных в экспериментальной установке животным по окончании тестирования.

После тестирования каждой крысы арену протирали влажной губкой.

Для определения макроэлементного состава у животных под нембуталовым наркозом (40 мг/кг массы) производили забор крови из подключичной вены (Vs).

Содержание Mg2+ в эритроцитах крови определяли по В. С. Камышникову [1].

Уровень Mg2+ в плазме крови определяли реактивами набора фирмы «Лахема»; содержание Са2+ – с помощью наборов фирмы «Оль-векс диагностикум» (Россия).

После этого у всех экспериментальных животных забирали ткани из препилорического отдела желудка с последующей идентификацией моноклональных антител к эндотелиальной нитроксидсинтазе («Novocastra», Великобритания). Оценка реакции проводилась полуколиче-ственным методом с учетом интенсивности окрашивания и удельного числа антиген-позитивных клеток в слизистой оболочке желудка (СО).

Иммуногистохимическая реакция оценивалась как негативная – «0» (нет реакции), слабопозитивная – «1» (слабо окрашенные клетки), умеренно-позитивная – «2» (клетки средней интенсивности окраски) и сильнопозитивная или сверхэкспрессия – «3» (клетки высокой интенсивности окраски) [2].

Для статистической обработки результатов исследования при нормальном распределении использовался t-критерий Стьюдента (M ± m), при распределении отличном от нормального использовали T-критерий Уилкоксона при уровне значимости Q < 0,05 (Me [25 и 75 перцентили]).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯИ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты представлены в таблице. Тестирование животных методом «Откры- того поля» [7] позволяет оценить поведение животных в ответ на стимулы стрессового характера и определить устойчивость экспериментальных животных к воздействию стресса.

Содержание макроэлементов в крови из Vs (M ± m), удельное число и интенсивность экспрессии eNOS-позитивных клеток слизистой оболочки желудка и показатели теста «Открытое поле» у стрессоустойчивых и стрессонеустойчивых крыс в исходном состоянии (Me[25 и 75 перцентили])

Показатель	Стрессоустойчивые крысы	Стрессонеустойчивые крысы
Mg2+ в эритроцитарной массе крови из V s , ммоль/л	1,42 ± 0,101	1,91 ± 0,074 ###
Mg2+ в плазме крови из Vs, ммоль/л	0,83 ± 0,022	0,88 ± 0,012 #
Са2+ в плазме крови из Vs, ммоль/л	1,62 ± 0,036	1,64 ± 0,037
Интенсивность экспрессии eNOS-позитивных клеток	1 [1;1]	2 [2;2] *
Удельное число eNOS-позитивных клеток	65 [50;82,5]	17,5 [10;25] *
Вертикальная активность в тесте «Открытое поле»	16 [12,5;17]	19 [18;20]
Горизонтальная активность в тесте «Открытое поле»	66 [61;70]	42 [39,5;46,5] *
Поисковая активность в тесте «Открытое поле»	5 [3;6]	2 [1,5;3,5]
Центральная зона в тесте «Открытое поле»	2 [0,5;2]	1 [0,5;1,5]
Болюсы в тесте «Открытое поле»	0 [0;1]	0 [0;0]
Груминг в тесте «Открытое поле»	8 [4,5;9,5]	3 [1;6]

٭ – Q < 0,05 – достоверность различий между показателями интенсивности и удельного числа eNOS-позитивных клеток в СО желудка и показателями в тесте «Открытое поле» у стрессоустойчивых и стрессонеустойчивых крыс;

# – Р < 0,05;

### – Р < 0,001 – достоверность различий между содержанием магния в эритроцитарной массе и плазме крови у стрессоустойчивых и стрессонеустойчивых крыс.

Необычность и новизна ситуации (помещение крысы в ярко освещенную непривычную камеру, которая значительно больше, чем клетка, где живет крыса; белый цвет и открытость площадки) воспринимается животным как стрессовый фактор и сопровождается кратковременной реакцией замирания и «убегания» в зависимости от уровня стрессоустойчивости животного [4]. Такое поведение в природных условиях имеет адаптивный характер, так как кратковременная неподвижность уменьшает возможность зрительного или акустического обнаружения животного хищниками и дает возможность сориентироваться в необычной ситуации с последующим убеганием из зоны риска.

Исследование крысой центральной зоны арены «Открытое поле» является признаком уменьшения страха, сопровождающего развитие стресса. Уровень дефекации отражает изменение эмоционального восприятия стрессовой ситуации и позволяет оценить активность вегетативной функции. Вертикальные стойки отражают уровень исследовательской активно- сти, чувствительный к уровню тревожности. Короткий и продолжительный груминг оценивается как «смешанный» индекс поведенческой активности, сопровождающий снижение двигательной активности [3].

Таким образом, малоподвижных крыс отнесли к стрессонеустойчивым и предрасположенных к развитию стресса. Стрессоустойчивых животных оценивали, как крыс с высоким уровнем двигательной активности, так как подвижное и активное поведение дает возможность избегать потенциальной или реальной опасности и выживать в естественной среде.

У стрессоустойчивых крыс горизонтальная двигательная активность в тесте «открытое поле» (66[61;70]) достоверно выше (q < 0,05) по сравнению со стрессонеустойчивыми животными (42[39,5;46,5]). Вертикальная активность у стрессоустойчивых крыс недостоверно ниже, а поисковая активность, выход в центральную зону и груминг – выше, чем у стрессонеустойчивых животных. Одновременно определено, что в исходном состоянии у стрессоустойчивых животных по отношению к стрессонеустойчивым крысам содержание Mg2+ в плазме и эритроцитарной массе крови из Vs ниже на 6,6 % (р < 0,05) и на 25,9 % (р < 0,001) соответственно.

Значимой разницы в содержании Са2+ в плазме крови из Vs между группами не выявлено, что, очевидно, отражает значимую роль Са2+ в механизмах реализации стресса, в связи с чем его концентрация в плазме поддерживается практически на одном уровне референтных значений за счет мобилизации из депо. Чрезмерность вхождения в клетку и вследствие этого активация кальций-зависимых механизмов ее повреждения, инактивируется, нейтрализуется Mg2+. При этом Mg2+ постоянно мобилизуется из депо, включая эритроциты крови.

Сравнительное исследование иммуногистохимических показателей у интактных животных с разной устойчивостью к стрессу выявило у стрессонеустойчивых крыс более высокую (умеренно-позитивную) реакцию в меньшем числе eNOS-позитивных клеток в слизистой оболочке препилорического отдела желудка по сравнению со стрессоустойчивыми животными, у которых наблюдалось менее интенсивная экспрессия большего числа eNOS-позитивных клеток в СОЖ (Q < 0,05). Значительно большее число антиген позитивных клеток, очевидно, обеспечивает более стабильную функцию вазодилатации, что в условиях гипоксии любого генеза является оптимальной защитно-приспособительной реакцией организма.

Таким образом, поведенческую активность животных в тесте «Открытое поле» можно расценивать как отражение реализации центральных механизмов устойчивости к стрессу, зависящих от уровня нейротрансмиттеров в центральной нервной системе.

Тканевые механизмы стрессоустойчивости в данном случае представлены на клеточном и биохимическом уровне в виде активности экспрессии фермента местного вазодилятатора NO, и, таким образом, влияющего на резистентность тканей ЖКТ к воздействию стресс-факторов.

На гуморальном уровне система крови отражает мобильность накопительных (где эритроциты выступают мобильным депо магния и кальция) и перераспределительных (плазма крови) системных механизмов, значимых для организма в условиях стресса. При этом важно подчеркнуть, что магний выступает фактором, оптимизирующим условия для активации внутриклеточных энергозависимых ферментов, в том числе и таких, как нитроксидсинтазы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По данным проведенного исследования можно сделать вывод, что низкая устойчивость к стрессу малоподвижных крыс сопровождается более высоким уровнем накопления магния в эритроцитах и плазме крови из подключичной вены и более интенсивной экспрессией нитрок-сидсинтазы в меньшем числе eNOS-позитивных клеток в слизистой оболочке желудка даже в условиях минимального стрессового воздействия на животных.