Показатели клеточного, гуморального и мукозального компартментов иммунной системы у больных раком полости рта

Заболеваемость раком орофарингеальной зоны отличается тенденцией неуклонного роста, с 1995 г. она возросла на 25 %, составив в 1998 г. по РФ 3,93 на 100 тыс. населения. Рак слизистой оболочки полости рта занимает в России по распространенности 6-е место у мужчин и 8–9-е место у женщин. Удельный вес злокачественных заболеваний слизистой полости рта и прилежащих областей в структуре общей онкологической заболеваемости Челябинской области также достаточно высок, составляя 2,9–12 %. Частота запущенных форм этой локализации рака остается высокой, более 60 % таких больных поступают на лечение с III–IV стадиями заболевания [4].

Полость рта является сложным анатомическим образованием, которое включает ряд органов (язык, слюнные железы) и соседних анатомических образований (нижнюю и верхнюю челюсть, щека, ткани дна полости рта, мукозоассоциированная лимфоидная ткань и др.). Довольно часто опухоль носит местно-распространенный характер, большинство таких больных обращается к врачу, когда процесс захватывает две и более анатомические области в полости рта, несмотря на доступность клиническому осмотру и хорошую визуализацию этой области. Принято считать, что развитие опухоли любой локализации контролируется иммунной системой, между тем работ, оценивающих состояние разных отделов иммунной системы и, в частности, ее мукозального компартмента, очень немного [1, 2, 5].

Целью настоящего исследования является анализ показателей клеточного, гуморального и мукозоассоциированного компартментов иммунной системы у больных раком полости рта в сопоставлении с контрольной группой здоровых лиц для определения характера иммунного ответа в разных отделах системы при возникновении опухолевого процесса на слизистой мембране ротовой полости.

Материал и методы

Исследование проходило на базе ЧООД в отделениях патологии головы и шеи и радиологическом отделении. В исследование было включено 87 человек с раком слизистой оболочки ротовой полости. Мужчин – 69 %, женщин – 31 %. Средний возраст составил 56 лет. Рак язы- ка встречался чаще всего и составил – 62,5 %, слизистой щек – 23,7 %, слизистой альвеолярного отростка – 5,8 %, дна полости рта – 5 %, мягкого неба – 3 %. Распределение больных по клиническим стадиям заболевания было следующим: I–II стадии – 25 %, III стадия – 36 %, IV стадия – 39 % больных. Морфологическая верификация диагноза получена во всех случаях. При этом 98,8 % представлены плоскоклеточным ороговевающим раком, 1,2 % – carcinoma in situ. Клинически мы выявили у 36,4 % пациентов экзофитную форму рака, у 64,6 % – эндофитную форму.

Группа контроля, в которой были определены показатели клеточного, гуморального и секреторного иммунитета слюны, была представлена 30 практически здоровыми лицами, из них женщин – 25,5 %, мужчин 74,5 %. Средний возраст – 56,7 года.

У всех больных на момент госпитализации, до проведения лечебных мероприятий были определены иммунные показатели крови и слюны. В крови определяли общее число лейкоцитов, лимфоцитов, а также популяционный и субпопуляционный спектр лимфоцитов с помощью непрямого иммунофлюоресцент-ного метода с применением моноклональных антител серии ICO НПО «Препарат» (Нижний Новгород). Морфологическую оценку апоптоза лимфоцитов проводили с помощью прижизненной окраски клеток ядерным красителем HOECHST 33 342 (Vermes I., 2000) на основе выявления фрагментации ядра. В сыворотке крови определяли уровень TNF-α, INF-γ, АТ к IFN-γ, лактоферрин, общий IgG, а также его субклассы IgG1-G4, с помощью стандартных тест-систем для проведения непрямого ИФА ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Учет результатов производили на «Multiscan plus» (фирма Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм. Уровни конечных стабильных метаболитов оксида азота определяли с помощью модифицированного метода Гриса (Емченко М.Л., 1994) в модификации Э.Н. Коробейниковой (2002) [3, 6].

Статистическая обработка проводилась с помощью пакета прикладных программ «Statistica. vers 6.0». Данные таблиц представлены в виде средних арифметических (М) и ошибки средней (m). Достоверность различий верифицирована c применением однофакторного дисперсионного анализа ANOVA, LSD-теста, Чеффе-теста.

Результаты и обсуждение

При анализе абсолютного и относительного уровня основных популяций лимфоцитов крови у пациентов и в контрольной группе установлено, что у больных раком слизистой оболочки полости рта достоверных отличий по абсолютному количеству лейкоцитов, лимфоцитов и основных популяций лимфоцитов крови от группы здорового контроля не обнаружено. Выявлен достоверный рост относительного содержания общего числа лимфоцитов и В-лим-фоцитов крови. Рост процентного содержания клеток без изменения их абсолютного числа отражает перераспределительные изменения количества клеток крови, связанные с миграцией из центральных и периферических органов иммунной системы в область патологического очага (табл. 1).

Далее был проведен анализ субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих маркеры ранней (СD25) и поздней (CD71, HLA-DR) позитивной активации, а также маркеры негативной активации (CD95), проведена оценка морфологических признаков апоптоза иммуноцитов. Из табл. 2 видно, что у пациентов с раком слизистой оболочки ротовой полости процентное содержание лимфоцитов, несущих маркеры ранней (СD25) активации, т.е. рецептор к IL-2, а также процентное и абсолютное содержание лимфоцитов, экспрессирующих маркер поздней активации – рецептор к трансферрину (CD71), достоверно превышают содержание этих клеток у здоровых лиц, что может свидетельствовать об активационном ответе иммунной системы на наличие опухолевого очага в организме. Наряду с усилением процессов позитивной активации лимфоцитов у пациентов с раком данной локализации выявлено достоверное снижение процентного содержания лимфоцитов с морфологическими признаками фрагментации ядра, характерными для апоптоза.

Изменение процессов позитивной и негативной активации лимфоцитов обычно сопряжено с изменением цитокин- и нитроксидергической регуляции, в связи с чем нами определено содержание TNF-α, INF-γ, АТ к IFN-γ, а также NO 2,

Т.Ю. ЧУКСИНА

Популяционный спектр лимфоцитов у больных раком слизистой оболочки полости рта (M±m)

Таблица 1

Показатели	Больные до лечения, n=87	Здоровые лица (контрольная группа), n=30	р
Лейкоциты (абс. ч.)	6,66 ± 0,45	6,08 ± 0,31
Лимфоциты (%)	30,17 ± 1,62	17,55 ± 1,88	0,001
Лимфоциты (абс. ч.)	2,05 ± 0,20	2,18 ± 0,13
CD3 (%)	58,71 ± 1,44	57,50 ± 1,61
СВ3 (абс. ч.)	1,20 ± 0,13	1,28 ± 0,07
CD4 (%)	35,13 ± 0,85	35,32 ± 1,36
CD4 (абс. ч.)	0,72 ± 0,07	0,75 ± 0,05
CD8 (%)	22,00 ± 0,59	21,95 ± 0,84
CD8 (абс. ч.)	0,45 ± 0,05	0,47 ± 0,03
CD4/CD8	1,60 ± 0,03	1,61 ± 0,05
CD22 (%)	19,63 ± 0,68	16,32 ± 1,19	0,002
CD22 (абс. ч.)	0,40 ± 0,04	0,35 ± 0,03
CD16 (%)	16,79 ± 0,47	17,13 ± 1,50
CD16 (абс. ч.)	0,34 ± 0,04	0,37 ± 0,05

Примечание: p – достоверность различий при p<0,005, ANOVA, LSD-тест, Чеффе-тест.

NO3 NOх в сыворотке крови у больных раком слиз, истой оболочки ротовой полости (табл. 3). У данной группы онкологических больных уровень TNF-α достоверно, на порядок повышен в сопоставлении с показателями контрольной группы. Уровень конечных стабильных метаболитов оксида азота у больных с раком ротовой полости отличался от группы здоровых более низкими значениями количества нитратов, но более высокими значениями суммарных метаболитов оксида азота.

Некоторые показатели гуморального звена иммунной системы (уровень лактоферрина, количество иммуноглобулина вторичного иммунного ответа и его субклассов, активность компонентов системы комплемента) у обследуемых пациентов представлены в табл. 4. У больных раком слизистой полости рта наблю-

Таблица 2

Показатели	Больные до лечения, n=87	Здоровые лица (контрольная группа), n=30	р
CD25 (%)	13,58 ± 0,61	10,64 ± 1,35	0,001
CD25 (абс. ч.)	0,28 ± 0,03	0,25 ± 0,03
CD71 (%)	15,38 ± 0,79	7,91 ± 0,56	0,001
СВ71 (абс. ч.)	0,31 ± 0,03	0,16 ± 0,01	0,002
HLA-DR (%)	20,83 ± 0,59	20,00 ± 1,16
HLA-DR (абс. ч.)	0,43 ± 0,05	0,37 ± 0,04
CD95 (%)	13,04 ± 0,61	13,77 ± 2,18
CD95 (абс. ч.)	0,28 ± 0,04	0,30 ± 0,05
Апоптоз (%)	3,75 ± 0,33	7,59 ± 0,67	0,002
Апоптоз (абс. ч.)	1,32 ± 0,12	1,45 ± 0,18	0,001

Примечание: p – достоверность различий при p<0,005, ANOVA, LSD-тест, Чеффе-тест.

Таблица 3

Базовый уровень цитокинов и конечных стабильных метаболитов оксида азота в крови у больных раком слизистой оболочки ротовой полости

Показатели	Больные до лечения, n=87	Здоровые лица (контрольная группа), n=30	р
TNF-ά (пг/мл)	17,45 ± 3,54	1,46 ± 0,18	0,002
IFN-γ (пг/мл)	5,53 ± 1,24	14,4 ± 2,08
АТ к IFN-γ (пг/мл)	2,19 ± 0,41	1,66 ± 0,67
NO2 (мкмоль/л)	5,01 ± 0,44	5,69 ± 0,6
NO3 (мкмоль/л)	5,01 ± 0,44	13,5 ± 1,55	0,003
NOх (мкмоль/л)	24,45 ± 1,14	19,07 ± 1,16	0,002

Примечание: p – достоверность различий при p<0,005, ANOVA, LSD-тест, Чеффе-тест.

Субпопуляционный спектр и признаки апоптоза лимфоцитов у больных раком слизистой полости рта

дается достоверные повышение уровня общего IgG, отражающего формирование вторичного иммунного ответа со снижением уровня IgG4 по отношению к контрольной группе. Уровень активности начального компонента С4 оказался выше при опухолевом процессе.

В наибольшей степени представляет интерес характер иммунного ответа при раке слизистой оболочки ротовой полости на уровне секреторного иммунитета (табл. 5). При этом изменения на уровне показателей секреторного иммунитета слюны при раке слизистой оболочки ротовой полости в сопоставлении со здоровыми лицами были минимальными. У больных достоверно ниже, примерно в 4 раза, оказался уровень INF-γ. Учитывая высокую значимость INF-γ в противоопухолевой защите, следует особо выделить это отличие, отражающее, по всей вероятности, дефект локальной продукции данного цитокина иммунными клетками больных.

Таким образом, проведенными исследованиями установлены нарушения иммунного гомеостаза на системном уровне у больных с раком слизистой оболочки полости рта в сравнении со здоровыми лицами того же возраста в виде увеличения относительного уровня лимфоцитов и В-лимфоцитов, а также лимфоцитов с маркерами ранней позитивной активации (CD25), роста

Таблица 4

Показатели	Больные до лечения, n=87	Контрольная группа, n=30	р
Лактоферрин (нг/мл)	3425,4 ± 239,2	2883,6 ± 369,7
IgG (мг/мл)	11,4 ± 0,303	10,6 ± 0,69	0,003
IgG1 (мг/мл)	8,01 ± 0,44	6,43 ± 0,7
IgG2 (мг/мл)	3,41 ± 0,52	3,87 ± 0,501
IgG3 (мг/мл)	1,04 ± 0,14	1,37 ± 0,19
IgG4 (мг/мл)	0,32 ± 0,4	0,51 ± 0,18	0,001
CH50 (у.е.)	49,36 ± 1,91	55,59 ± 4,5
C1 (х108 ед. эффект. молекул)	56,91 ± 3,7	55,8 ± 7,1
C2 (х108 ед. эффект. молекул)	58,12 ± 3,66	56,4 ± 2,97
C3 (х108 ед. эффект. молекул)	52,62 ± 3,15	60,8 ± 4,69
C4 (х108 ед. эффект. молекул)	67,87 ± 3,25	50,4 ± 3,4
C5 (х108 ед. эффект. молекул)	52,16 ± 5,29	50,8 ± 6,05	0,0001

Примечание: p – достоверность различий при p<0,005, ANOVA, LSD-тест, Чеффе-тест.

Показатели гуморального звена иммунной системы у больных раком слизистой оболочки полости рта

Таблица 5

Показатели секреторного иммунитета слюны у больных раком слизистой полости рта

Показатели	Больные до лечения, n=87	Контрольная группа, n=30	р
TNF-ά (пг/мл)	3,25 ± 1,34	2,44 ± 0,38	0,063
IFN-γ (пг/мл)	3,45 ± 1,43	14,33 ± 1,04	0,002
АТ к IFN-γ (пг/мл)	2,91 ± 1,4	4,84 ± 2,41
Лактоферрин (нг/мл)	1038,2 ± 260,4	1201,6 ± 261,2
IgG (мг/мл)	2,71 ± 0,37	2,76 ± 0,37
IgG1 (мг/мл)	0,60 ± 0,20	0,73 ± 0,23
IgG2 (мг/мл)	1,83 ± 0,39	1,86 ± 0,27
IgG3 (мг/мл)	0,76 ± 0,27	0,91 ± 0,37
IgG4 (мг/мл)	0,23 ± 0,15	0,16 ± 0,07
NO2 (мкмоль/л)	4,87 ± 0,84	3,48 ± 0,68
NO3 (мкмоль/л)	19,87 ± 3,87	23,89 ± 2,9
NOх (мкмоль/л)	24,7 ± 3,7	27,37 ± 2,3
CH50 (у.е.)	37,01 ± 3,5	33,54 ± 2,08
C1 (х108 ед. эффект. молекул)	11,8 ± 3,6	9,30 ± 2,39
C2 (х108 ед. эффект. молекул)	10,7 ± 2,07	10,12 ± 2,23
C3 (х108 ед. эффект. молекул)	11,61 ± 1,81	12,12 ± 2,63
C4 (х108 ед. эффект. молекул)	12,43 ± 2,27	9,50 ± 1,83
C5 (х108 ед. эффект. молекул)	14,20 ± 1,06	8,38 ± 2,3

Примечание: p – достоверность различий при p<0,005, ANOVA, LSD-тест, Чеффе-тест.

относительного и абсолютного количества лимфоцитов, экспрессирующих маркеры поздней активации (CD71) со снижением абсолютного числа лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза, нарастанием уровня общего IgG и активности компонента комплемента С4. На уровне секреторного иммунитета слизистой ротовой полости установлено четырехкратное снижение количества INF-γ, предположительно отражающее один из возможных механизмов ухода опухоли от иммунного контроля.