Показатели метаболизма коллагена при оперативном лечении врожденных укорочений нижних конечностей у детей и подростков

Содержание коллагена в организме млекопитающих составляет 20-25% от общего количества белков [7]. В работах отечественных и зарубежных ученых было показано, что ряд заболеваний опорно-двигательного аппарата сопровождается нарушениями в метаболизме коллагена [1, 10, 11, 13]. Известно, что специфическим маркером коллагена является аминокислота гидроксипролин [9, 11]. Исследование содержания в крови гидроксипролина и его фракций: свободного, пептидного и белковосвязанного – доступный способ оценки состояния обмена коллагена [11, 16].

У детей в возрасте 6-12 лет при ахондроплазии и врожденном укорочении голени выявлено ускоренное созревание коллагена костной ткани при нормальном уровне неколлагеновых белков [6]. При удлинении голеней у больных ахондроплазией отмечено максимальное выделение с мочой метаболитов коллагена к 6-7-ому месяцу после начала лечения, когда исследователями отмечается усиление процессов образования органического матрикса костной ткани и его минерализации [5].

Отсутствие данных о динамике показателей обмена коллагена в крови при удлинении конечностей у детей и подростков побудило нас провести исследование содержания пептидного и свободного гидроксипролина, а также их соотношения в процессе оперативного лечения врожденных укорочений нижних конечностей.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили у 28 пациентов с врожденным укорочением нижних конечностей в возрасте от 6 до 16 лет (в среднем 12,2±0,65 лет). Пациентам осуществлялся дистракцион- ный остеосинтез аппаратом Илизарова. В 11 случаях удлиняли бедро, у 14 пациентов – голень, у остальных больных (три человека) был выполнен бисегментарный дистракционный остеосинтез. Величина удлинения колебалась от 3 до 7,5 см, длительность остеосинтеза аппаратом Илизарова не превышала 5 месяцев.

Кровь забирали утром натощак из локтевой вены. При этом были соблюдены условия, необходимые при исследовании содержания гидроксипролина [1]. Использовали фотометрический метод определения гидроксипролина и его форм, основанный на его окислении в слабокислой среде и выявлении окисленного продукта по цветной реакции с n-диметиламинобензальдегидом (реактивом Эрлиха) [18].

Все биохимические исследования выполнены старшим научным сотрудником Л.С. Кузнецовой. Исследования проводили до операции, на 30 и 45 день дистракции, 10-14, 30 и 45-60 день фиксации, в первые 2-3 дня после снятия аппарата внешней фиксации.

Все результаты в таблице представлены в виде М±т, где М - среднее арифметическое выборки, m - ошибка среднего, достоверность различий оценивалась с помощью критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изменения содержания фракций свободного и пептидного гидроксипролина в крови в процессе удлинения конечностей носят однонаправленный характер, что отражено в таблице 1. В процессе дистракции происходит постепенное увеличение их содержания в крови. Максимальные значения свободного и пептидного гидро- ксипролина определялись к концу периода дистракции (45-50-ый день) у всех пациентов, когда они достигали 23,0±2,36 мкмоль/л и 13,2±0,99 мкмоль/л соответственно.

В последующем, в период фиксации, наблюдалось постепенное снижение содержания в крови обеих фракций гидроксипролина. Так, к 10-14 дню после окончания удлинения содержание свободного гидроксипролина составляло 19,1±2,19 мкмоль/л, пептидного - 11,8±2,58 мкмоль/л. А через месяц после прекращения дистракции - 17,2±1,28 мкмоль/л и 8,5±0,87 мкмоль/л соответственно. К 45-60 дню периода фиксации содержание гидроксипролина определяли лишь у пациентов с удлинением 6 см и более, так как у прочих аппарат к данному сроку был уже снят. На 2-3-ий день после демонтажа внешнего фиксатора отмечается незначительное увеличение содержания как свободного, так и пептидного гидроксипролина.

Динамика соотношения пептидного и свободного гидроксипролина крови представлена

Таблица 1

Содержание свободного, пептидного и белкового гидроксипролина в крови при удлинении нижних конечностей;

мкмоль/л (М±т)

на рисунке 1. Здесь максимальные значения этого показателя отмечаются в конце дистракции (0,58±0,04) и начале периода фиксации (0,6±0,01), когда имеются достоверные различия по сравнению с дооперационными значениями (p<0,05). В дальнейшем происходит постепенное снижение соотношения.

Рис. 1. Динамика соотношения пептидного и свободного гидроксипролина в крови при удлинении нижних конечностей

Что касается белковосвязанного гидроксипролина (таблица 1), то его максимальное содержание в крови на 30-ый день периода дистракции (74,6±4,7 мкмоль/л) сменяется последующим постепенным снижением до исходных цифр к концу фиксации.

Фракции гидроксипролина	Сроки исследования
	до операции (n=28)	Д 30* (n=25)	Д 45-50* (n=13)	Ф 10-14** (n=23)	Ф 30** (n=20)	Ф 45-60** (n=12)	после снятия (n=19)
свободный	21,2±5,14	21,7±2,64	23,0±2,36	19,1±2,19	17,2±1,283	17,9±1,69	20,4±2,27
пептидный	8,2±1,66	10,8±1,11	13,2±0,99v	11,8±2,58	8,5±0,873	10,0±2,03	9,9±0,813
белковосвязанный	57,7±4,71	74,6±2,71 1	70,2±2,11 1	67,6±4,19 1	57,2±3,593	63,5±5,37	57,3±3,923

Примечание: * - дни периода дистракции, ** - дни периода фиксации, 1 - достоверные различия по сравнению с дооперационным уровнем, 2 - достоверные различия по сравнению с предыдущим сроком исследования, 3 - достоверные различия по сравнению с концом периода дистракции.

ОБСУЖДЕНИЕ

Гидроксипролин - аминокислота, содержащаяся только в коллагене (13-14%), что и придает определению ее содержания в биологических жидкостях важное диагностическое значение при различных заболеваниях опорно -двигательного аппарата. Известно, что рост свободного гидроксипролина в крови или моче отражает ускорение распада коллагена, в то время как нормальное его содержание свидетельствует об отсутствии нарушений в терминальной стадии распада коллагена [11]. Пептидный коллаген крови и мочи на 65% представлен продуктами неполного распада нерастворимого коллагена, т.е. коллагена уже сформированных коллагеновых волокон, а на 35% - из вновь синтезированного коллагена, еще растворимого, еще не входившего в состав сформированных коллагеновых волокон [7, 11]. Резкое увеличение соотношения пептидного и свободного гидроксипролина расценивается как результат активизации фибриллогенеза в соединительной ткани [9, 11]. Белковосвязанный гидроксипролин крови на 80-90% представлен коллагеноподобным белком - компонентом С1 классического пути системы комплемента [11].

Исследование суточной экскреции общего гидроксипролина, 90% которого имеет костное происхождение, у детей и подростков позволяет выявить нарушения в метаболизме коллагена, а в ряде случаев помочь в дифференциальной диагностике при заболеваниях костной ткани. Известно, что 90% костного гидроксипролина образуются в результате разрушения, а 10% - в результате созидания кости, так что этот показатель представляет собой лишь меру разрушения кости остеокластами [12, 13]. Определение экскреции фракций гидроксипролина имеет большее диагностическое значение, т.к. их сопоставление позволяет судить в некоторой степени о распаде и скорости биосинтеза коллагена [11].

При удлинении конечностей происходит активное образование коллагеновых волокон как в зоне дистракционного регенерата, так и в мягких тканях удлиняемой конечности [3, 4]. Однако исследование продуктов метаболизма коллагена были выполнены лишь у больных с врожденным укорочением голени и ахондроплазией. На основании лишь определения экскреции общего гидроксипролина в моче авторы пришли к выводу, что у детей в возрасте 6-12 лет при ахондроплазии и врожденном укорочении голени созревание коллагена костной ткани ускорено при нормальном уровне неколлагеновых белков [5]. При удлинении голеней у больных ахондроплазией отмечено максимальное выделение с мочой метаболитов коллагена к 6-7-ому месяцу после оперативного вмешательства, ко- гда исследователями было отмечено усиление процессов новообразования коллагена и его минерализации [6].

Полученные нами данные о содержании фракций гидроксипролина в крови при оперативном удлинении врожденно укороченных нижних конечностей у 28 детей и подростков позволили показать, что период дистракции сопровождается как активным биосинтезом коллагена, так и его распадом. Происходит синхронное увеличение содержания и свободного, и пептидного гидроксипролина. Максимальных значений эти показатели достигают к 45-50-ому дню дистракции, т.е. к окончанию данного периода лечения. Также в это время продолжает расти соотношение пептидного и свободного гидроксипролина. С началом периода фиксации снижение содержания фракций гидроксипролина не сопровождается снижением их соотношения, наоборот, продолжается дальнейшая активизация фибриллогенеза в соединительной ткани в течение первых дней периода фиксации. На наш взгляд, этот факт отражает продолжающуюся регенерацию, происходящую под влиянием напряжения растяжения [2]. Известно, что спад дистракционных усилий на 50% происходит на протяжении именно двух недель после окончания дистракции, в последующем отмечается более медленное снижение дистракционных усилий [8].

Через месяц периода фиксации происходит снижение активности фибриллогенеза, а также значительно замедляется распад коллагена. В данное время, как известно, происходит активная минерализация на протяжении всего дистракционного регенерата. Содержание гидроксипролина на 45-60-ый день фиксации отражает процессы созревания дистракционного регенерата и изменения в мягких тканях оперированной конечности у пациентов с удлинением 6 см и более, т.к. у прочих аппарат к данному сроку был уже снят. На 2-3-ий день после демонтажа внешнего фиксатора отмечается незначительное увеличение содержания как свободного, так и пептидного гидроксипролина, что, по-видимому, отражает процесс заживления ран после удаления спиц аппарата внешней фиксации.

Таким образом, полученные данные о содержании гидроксипролина в крови можно интерпретировать следующим образом. В процессе удлинения конечностей существует фаза активного фибриллогенеза в соединительной ткани. Продолжительность ее определяется действием напряжения растяжения. После исчезновения дистракционных усилий созревание дистракционного регенерата и изменения в мягких тканях удлиненной конечности сопровождаются постепенным снижением коллагенообразования. Определение фракций гидроксипролина и их соотношения отражает состояние фибриллоге- неза в процессе удлинения врожденно укороченных нижних конечностей.