Полиамины повышают толерантность Escherichia coli к нетилмицину

Поиск и синтез новых антибактериальных препаратов неизбежно сопровождается совершенствованием адаптивных механизмов микроорганизмов С целью выживания в условиях действия новых стрессовых факторов. Эго приводит к тому, что ус тойчивость бактерий к антибиотикам продолжает расти и является серьезной угрозой здоровью человечества, В связи с этим понимание механизмов бактериальной устойчивости к действию антибиотиков является необходимым условием для даль не Кашеварова Н. М., Ткаченко А. Г., 2016

нейшей разработки новых, более эффективных способов борьбы с патогенными бактериями.

Нетилмицин - полу синтетический антибиотик широкого спектра действия, ОТНОСЯЩИЙСЯ К Группе аминогликозидов - бактерицидных антибиотиковк мишенью которых является 30S-субъединица бактериальной рибосомы. Антибактериальное действие аминогликозидов обусловлено тем. что они: 1) ингибируют белковый синтез; 2) приводят к синтезу нефункциональных белков, нарушая правильность считывания генетического кода и повышая количество ошибок при трансляции; 3) в больших концентрациях снижают барьерные функции клеточных мембран [Jana, Deb, 20061; 4) вызывают окислительный стресс в результате стимуляции образования гидроксильных радикалов [Kohanski et al. ,2007].

В формировании резистентности к аминогликозидам выделяют следующие механизмы: 1) ферментативная инактивация аминогликозидов путем присоединения к молекуле антибиотика остатка уксусной кислоты, фосфорной кислоты или аденина, что приводит к потере его способности связываться с рибосомами и подавлять биосинтез белка; 2) снижение их концентрации внутри клетки в результате изменения проницаемости наружной мембраны, сниженного транспорта через внутреннюю мембрану; активного выброса из клетки; 3) модификации мишени антибиотика - мутационные (16S рРНК и рибосомальных белков) или химическая (в результате метилирования сайта связывания антибиотика (молекулы 16S рРНК) в специфических позициях с использованием ферментов метила з и метилтрансфераз) [Jana, Deb, 2006; Shaki! et aL 2008].

Помимо вышеперечисленных механизмов ан-тнбиогикорезисгентносги, которые функционируют. когда клетки находятся в активном состоянии, существует альтернативная стратегия выживания. При ее реализации бактерии избегают легального действия антибиотиков, находясь в состоянии, которое характеризуется замедлением скорости роста и метаболических функций [Gcfcn, Balaban. 2009; Dorr. Vulic, Lewis, 2010]. Лишь относительно небольшая часть клеток популяции способна «персистировать» (выживать) в условиях пролонгированного действия летальных концентраций антибиотика благодаря тому, что мишень антибиотика находится В неактивном СОСТОЯНИИ, недоступном ДЛЯ его повреждающего воздействия. Такие медленно растущие или нерастущие (дормантные) клетки -персисторы - генетически идентичны остальной чувствительной к антибиотикам части популяции, но проявляют фенотипическую толерантность к антибиотикам [Lewis, 2010]. Количество персисто-ров в популяции определяется фазой роста периодической культуры.

В настоящее время в литературе имеется много данных о вовлеченности полиаминов (путресцина, кадаверина, спермидина) в разнообразные клеточные процессы. Эти биогенные полпкатионы участвуют в формировании адаптации бактериальных клеток к различным стрессовым факторам посредством регуляции транспортных процессов, улавливания свободных радикалов. компактизации ДНК, регуляции экспрессии глобальных транскрипционных регуляторов и адаптивных генов [Tabor, Tabor. 1985; Igarashi, Kashiwagi, 2006]. Целью данной работы является исследование роли полиаминов в повышении толерантности бактерий £s- chenchia cob к аминогликозиду нетилмицину,

Материалы и методы исследования

Использованные в работе штаммы Е. со И приведены в таблице.

Бактериальные штаммы» использованные в работе

Штаммы Е. cob	Генотип	Источник или ссылка
BW25141	F-, d(araD-ar^B)567, AlacZ4787(: :rmB-3)t A(phoB-phoR)58 Я\ galU95t zhMdA3::pir\ recAL endA9(del-ins): :FRT, rph-L A(rhaD-rhcB)568y bdR5I4	Datsenko. Wanner, 2000
МС4100	F-,c7raD139, ^4argF-lac\ U169, deoCl^ rpsIASVb reLil РЬВЗЗОЬ ptsF25s rbsR	Coli Genetic Stock Center (CGSC)
SHT03	F-, thr-b сгаС14^ ЛяреОУВ, A(gpt-prnA)62, tacY /,gMA^^AS), #сЖ2(Ос), Я', A(speB-speA)97> A(speC-glcB)63: rpsL25(stiR\ xylAS^ mtl-L thiEb omK^p-L cadA2, lacZ- ШЕЗ XRZ5rpoS742::tacZfhvbr	Лабораторный музей
SHT03pSOPR	Как SHT03, но трансформирован плазмидой SOPR	Лабораторный музей

Штаммы Е. cob культивировали на минеральной среде М-9, содержащей 0.4% глюкозы, в колбах объемом 250 мл в термостатируемом шейкере (37°С. 120 об/мин) или в 96-лу ночных иммунологических планшетах (Медполимер, Россия) в мультимодальном планшетном ридере «Тесан» (Швейцария). При работе с полиаминзависимыми штаммами Е. cob SHT03 и SHT03pSOPR к среде М-9 добавляли 1 мкг/мл тиамина, 100 мкг/мл пролина и 1 мкг/мл пантотената (Sigma, Germany). Нетил-мицин (Верофарм, Россия) и полиамины путресцин, спермидин и кадаверин (Sigma, Switzerland) вносили в культуры в экспоненциальной фазе роста в концентрациях, указанных в подписях к рисункам.

В экспериментах по изучению влияния путресцина на выживаемость клеток Е. coli BW25141 при обработке сублетальными концентрациями (СЛК)

антибиотика ночную культуру разводили в среде М-9 до ODy)o=0405. разливали в лунки планшета по 200 мкл и культивировали в мультимодальном планшетном ридерс «Тссап» е периодическим встряхиванием. При 006(Ю=0.08-0.09 вносили СЛК нетилмицина (0.8: 1.0; 1.4 мкг/мл). За 10 мин. до добавки антибиотика и спустя 20. 40 и 60 мин. в соответствующие лунки вносили 5 мМ путресцина. После 3 ч. воздействия антибиотика пробы разводили в растворе NaCl (0.9%) и делали высев на чашки с LB-агаром, Через 24 ч. подсчитывали выросшие колонии (КОЕ).

С целью изучения динамики персистообразова-ния ночные культуры полиаминпрофицитных штаммов Е> coli BW25141 и МС4100 разводили в свежей среде М-9 до OD^f 0.1. Пробы отбирали каждые 2 ч. в течение первых 8 ч.. а далее с 24-часовыми интервалами для определения общего числа культивируемых клеток и персисторов, толерантных к 2.8 мкг/мл нетилмицина. Определение числа персисторных клеток осуществляли на основе протокола, представленного в статье [Keren et al., 2004]. Для этого пробы разводили в соотношении 1:1 в свежей среде М-9, содержащей антибиотик (2 к). После 3-часовой обработки со встряхиванием пробы отмывали от антибиотика, делали разведения б физиологическом растворе и высевали по 10 цл на чашки с LB-агаром. Через 24 ч. культивирования производили подсчет выросших клонов персисторных клеток. Частоту персистооб-разования определяли как отношение числа персисторов к общей численности культивируемых клеток на момент отбора образцов. Культуру полкам индефицитного мутанта Е coli SHT03. предварительно истощенного на среде М-9, разводили в свежей среде М-9 и культивировали ночь (15-17 ч.) до экспоненциальной фазы роста. При ОПб1Ю= 0.5 вносили разные концентрации полиаминов и далее отбирали пробы каждые 2 ч., затем через 24 и 48 ч. с момента добавки полиаминов для определения общего числа культивируемых клеток и частоты персистообразования.

В серии экспериментов изучали влияние путресцина на выживаемость клеток полна минза ви-енмого штамма Е. coli SHTOSpSOPR, обработанных в течение 5, 24 и 48 ч. возрастающими концентрациями нетилмицина в диапазоне от субингибиторных до летальных (0.01; 0.1; 0.4; 1.0 мкг/мл), которые вносились в культуру в логарифмической фазе роста. С целью оценить содержание псрсисторов в культуре в момент добавки антибиотика и после 5-. 24- и 48-часовой обработки НИЗКИМИ концентрациями аминогликозида клетки далее подвергали дополнительному’ 3-часовому’ воздействию более высокой концентрации антибиотика (2.8 мкг/мл). Культуру полиаминдефицит-ного штамма Е. cob SHTOSpSOPR, предварительно истощенного на минеральной среде М-9, разводили в соотношении 1:250 в свежей среде М-9 и разливали по 200 мкл в лунки планшета, далее куль тивировали ночь в мультимодальном планшетном ридерс «Тесан» с периодическим встряхиванием. 5 мМ путресцина и нетилмицин (0.01—1.0 мкг/мл) вносили при достижении экспоненциальной фазы роста (ODtioi^O.06-0.07). В образцах культуры, отобранных в момент внесения нетилмицина и спустя 5, 24 и 48 ч. действия антибиотика, определяли содержание клеток, выживших после обработки НИЗКИМИ концентрациями аминогликозида (жизнеспособных клеток), и персисторов, толерантных к 2.8 мкг/мл нетилмицина.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета стандартных программ Statistica 6.0 («StatSoft Inc.», 2001).

Результаты и их обсуждение

В экспериментах со штаммом Е. colt BW25I41 в экспоненциальную культуру вносили сублетальные концентрации нетилмицина. а также 5 мМ путресцина в разное время с момента добавки антибиотика. Результаты проведенных нами исследований показали, что эффективность положительного действия путресцина на выживаемость клеток зависела от времени его внесения в культуру относительно добавки антибиотика (рис. 1) Внесение путресцина, предшествующее добавке антибиотика, наиболее эффективно снимало бактерицидный эффект. Однако положительное действие полиамина ослабевало пропорционально удлинению временного интервала его внесения после

Рис. L Влияние путресцина на выживаемость Е. coli BW25141 в зависимости от времени его внесения в культуру и концентрации нетилмицина.

Нетилмицин (НМ) вносили в сублегальных концентрациях (0.8; 1.0; 1.4 мкг/мл). Добавку 5 мМ путресцина делали за 10 мин. до, через 20, 40 и 60 мин. после внесения нетилмицина Черные столбцы - культуры без добавки путресцина, заштриховатшые - культуры с добавкой путресцина

Изучение динамики численности бактерий, толерантных к 2.8 мкг/мл нетилмицина. в периодических культурах полиаминпрофицитных штаммов E.coh MC4I00 и BW2514I, растущих на синтети- ческой среде М-9, выявило их низкое содержание в экспоненциальной фазе роста и дальнейшее возрастание их числа (на 4-5 порядков) по мере уве личения плотности культуры и перехода ее в стационарную фазу (рис. 2), Следует отметить штам-моспецифичность динамики персистообразования изученных полиаминпрофицитных штаммов.

Рис. 2, Динамика персистообразования в периодических культурах разных штаммов Е. соН на минеральной среде М-9.

Полна минпрофицитные штаммы Е. colt МС4100 и BW25141 культивировали без добавки полиаминов. 11олиаминзависимый мутант SH ГОЗ -контроль без полиаминов (ПА ) (сплошная линия) и с добавлением разных концентраций спермидина (0.01; 0,025; 0,05 мМ СД) (пунктирные линии)

Б то же время в контрольной культуре поли-аминдефицитного мутанта Е.соН SHTO3, не содержащей полиаминов, на протяжении всего периода культивирования число толерантных бактерий варьировало в пределах одного порядка. Однако добавка в среду^г культивирования разных концентраций спермидина (0.01; 0,025; 0.05: ОД мМ) вызывала концентрационно-зависимое возрастание числа толерантных клеток при переходе в стационарную фазу роста (рис. 2). При этом при концентрациях 0,05 и 0.1 мМ отмечался уже одинаковый эффект (рис, 3), Таким образом, максимальный эффект спермидина, который повышал частоту⁷ персисторных клеток полиаминзависимого штамма ДО уровня полиаминпрофицитных ШТамМОВк проявлялся при концентрации 0,05 мМ.

Ранее нами было показано, что добавка путресцина в концентрациях 0.1: 1,0; 5.0 мМ в экспоненциальную культуру полиаминзависимого штамма на среде М-9 приводила к концентрационнозависимому' возрастанию числа клеток, толерантных к 2,8 мкг/мл нетилмицина, при переходе культуры в стационарную фазу роста [Tkachenko et aL 2014], Путресцин в концентрациях 1,0 и 5.0 мМ проявлял одинаковый по силе эффект на динамику частоты персистенции в культуре E.coli SHT03h которая соответствовала этому показателю в поли-аминпрофицитном штамме МС4100, Следователь но, эффективность действия путресцина на частоту персистенции примерно в 20 раз ниже таковой спермидина, Также нами были проведены исследования по влиянию кадаверина на частоту' персистообразования, однако его эффект был значительно ниже такового для спермидина и путресцина и проявлялся только в стационарной фазе. Таким образом, эффективность действия полиаминов на частоту персистенции снижалась в ряду7: спермидин —* путресцин —* кадаверин (рис. 3).

лиаминов на частоту⁷ персистообразования в культу ре полиаминдефицитного штамма Е.

coli SHT03 на синтетической среде М-9 спустя 24 ч, после внесения пол нам инов,

Черный столбец - контрольная культура SHT03 без полиаминов (ПА); светлые столбцы - с добавкой спермидина СД (0.01; 0.025; 0.05:0.1 мМ); заштрихованные - путресцина ПТ (0. к кО; 5,0 мМ); серые - кадаверина КД (1.0; 2,5; 5,0 мМ). Для сравнения приведена частота персистенции в стационарной (24-часовой) культуре полиами! [профицитного штамма МС4100 (без добавки псыиа\гинов)

Эксперименты с полиаминзависимым штаммом Е* со И SHT03pSOPR, в экспоненциальную культуру которого вносились возрастающие концентрации нетилмицина в диапазоне от субингибиторных до летальных (0.01; 0.1; 0.4; 1.0 мкг/мл), показали концентрационно-зависимое отмирание чувствительных клеток (рис. 4А). При субингибиторной концентрации нетилмицина (0.01 мкг/мл) количество культивируемых клеток не отличалось от их числа в контрольной культуре. При сублетальных концентрациях (0.1 и 0.4 мкг/мл) наблюдалась двухфазная модель отмирания, характерная для получения персисторных клеток [Lewis, 2007]: после 5-часовой обработки антибиотиком наблюдалась гибель основной массы (0.1 мкг/мл) или всех (0,4 мкг/мл) чувствительных клеток. Оставшиеся фракции толерантных клеток показали дальнейший незначительный рост к 48 ч, действия нетилм ицина, Концентрация ам иногликозида 1,0 мкг/мл оказалась летальной, при которой постепенное отмирание привело к полной гибели всех клеток б результате 4 8-часового воздействия антибиотика.

Добавка 5 мМ путресцина в экспоненциальную культуру пород внесением аминогликозида ПОЛНОСТЬЮ снимала отрицательное действие антибиотика на выживаемость клеток при субингибиторной и суб летальных концентрациях. Летальная концентрация (1.0 мкг/мл). при которой в ПТ"-культуре после 48-часового воздействия антибиотика живые клетки отсутствовали, в присутствии путресцина давала снижение числа КОЕ относительно контроля на 1-1.5 порядка (рис. 4Б).

Высокую выживаемость бактериальных клеток при одновременном внесении путресцина с антибиотиком можно объяснить рядом причин. Одна из них - способность полиаминов повышать антибио-тикорезистентность штамма, о чем судят по изменению минимальной ингибиторной концентрации [Tkachenko et al., 2012]. Защитный эффект полиаминов на уровне мишени антибиотика проявляет ся за счет конкурентного связывания полиаминов с рибосомами. поскольку' как полиамины. так и аминогликозиды имеют поликатионную природу. К тому же. поликатионная структура полиаминов позволяет ИМ функционировать в качестве ловушек активных форм кислорода. Ингибирование белкового синтеза аминогликозидами сопровождается развитием окислительного стресса в результате повышения продукции гидроксильных радикалов, что усиливает бактерицидный эффект антибиотика [Kohanski et al. 2007]. Было показано, что в условиях повреждающего действия аминогликозидов по л намины проявляют антиоксидантные и ДНК-протекторные свойства, выступая в качестве ловушек свободных радикалов и благодаря способности полиаминов связываться с ДНК и компакгизи-ровать ее структуру [Tkachenko et al., 2012]. Эти свойства полиамннов обусловливают повышение выживаемости клеток при действии аминогликозидов.

Рис. 4. Кривые отмирания/роста клеток, обработанных возрастающими концентрациями нетилмицина (НМ) (0.01; 0.1; 0.4; 1.0 мкг/мл), в культуре полиаминдефицитного штамма Е. colt SHT03pSOPR без добавки (А) и в присутствии 5 мМ путресцина (Б)

Рис. 5, Динамика псрсистерных клеток, толерантных к 2.8 мкг/мл нетилмицина. в культуре Е. coli SHT03pSOPR. предварительно обработанных низкими концентрациями нетилмицина (0.1 - 1.0 мкг/мл), без добавки (А) и в присутствии 5 мМ путресцина (Б)

С целью выяснения как изменяется содержание персисторов в контрольной и обработанных разными концентрациями (0.1-1.0 мкг/мл) аминогликозида культурах (ПТ" и ПТ+) после 5-? 24- и 4 8-часового воздействия антибиотика, из лунок часового воздействия антибиотика, из лунок планшета параллельно с высевом на подсчет жизнеспособных клеток отбирали аликвоты для определения персисторов. Дополнительная 3-часовая обработка клеток высокой концентрацией нетилмицина (2.8 мкг/мл) сопровождалась дальнейшим отмиранием чувствительных к данной концентрации клеток (рис. 5). В культурах без добавки путресцина (ПТ-) в момент внесения антибиотика количество персисторов к 2.8 мкг/мл нетилмицина было примерно одинаково (МО3 клеток). В контрольной культуре и культуре, подвергнутой субингибиторной концентрации антибиотика (0.01 мкг/мл), в экспоненциальной фазе роста (0-5 ч.) число толерантных клеток к 2.8 мкг/мл нетилмицина сохранялось на одном уровне с последующим возрастанием их количества при переходе в стационарную фазу (24-48 ч). При этом в контрольной культуре наблюдалось их незначительное превышение. В культурах. обработанных су б л стальным и концентрациями нетилмицина (0.1; 0.4 мкг/мл). дополнительное стрессирование высокой концентрацией антибиотика выявило похожую картину, как и в случае с предварительной обработкой С ЛК (рис. 4): число клеток, толерантных к су б летальным концентрациям после 5-часовой обработки. снизилось на порядок после дополнительного воздействия 2.8 мкг/мл аминогликозида и далее сохранялось на этом же уровне (0.4 мкг/мл) или даже показало незначительный рост (0.1 мкг/мл). В популяции клеток, толерантных к 1.0 мкг/мл нетилмицина после 24-часовой обработки, персисторов к 2.8 мкг/мл антибиотика не оставалось. Полученные нами результаты согласуются с гипотезой о гетерогенности бактериальных популяций. содержащих различные персисторные субпопуляции. для каждой из которых характерны свойственные им уникальные механизмы толерантности [Allison, Brynildsen. Collins. 2011]. что обусловлено, в свою очередь, разнообразием генов. принимающих участие в формировании пер-систорного фенотипа [Amato el aL 2014].

Количество персисторных клеток, толерантных к 2.8 мкг/мл нетилмицина. в культурах с добавлением путресцина (ПТ⁺) было на 1-2 порядка выше, чем в ПТ"-культурах в экспоненциальной фазе роста. достигая максимального различия (до 7 порядков) в стационарных культурах. Различия в содержании персисторов в ПТ" и ПТ⁺-культурах в нулевой точке (момент внесения полиамина и антибиотика в экспоненциальной фазе), предположительно, можно объяснить тем. что добавка полиаминов повышает антибиотикоре зистентность по лиам ин-дефицитного штамма Е. coli SHT03pSOPR.

Следует отметить, что динамика персисгообра-зования в ПТ -культурах, предварительно стрессированных нетилмицином в диапазоне концентраций от субингибиторной до летальной, полностью отражает таковую в контрольной культуре с возрастанием числа персисторов до максимума в стационарной фазе роста. При этом число персисто ров в контроле и в культурах, обработанных субингибиторной (0.01 мкг/мл) и суб летальной (0.1 мкг/мл) концентрациями антибиотика, достигало максимума уже в 24-часовых культурах и к 48 ч. не изменялось, что соответствовало числу жизнеспособных клеток, высеваемых до дополнительного стрессирования высокой концентрацией нетилмицина (рис. 4Б). Таким образом, добавка путресцина в экспоненциальной фазе роста способствовала переходу' всех культивируемых клеток (в том числе жизнеспособных, выживающих после предварительной обработки 0.01 и 0.1 мкг/мл нетилмицина) в персисторное состояние, обеспечивающее толерантность к 2.8 мкг/мл нетилмицина во время вступления б стационарную фазу. В культурах, стрессированных су б летальной (0.4 мкг/мл) и летальной (1.0 мкг/мл) концентрациями нетилмицина. отмечалось пропорциональное концентрационно-зависимое снижение числа персисторов по отношению к контролю. Однако динамика персисто-образования в этих культурах также, как и в описанных выше, показала стабильное возрастание числа персисторов до максимума к 48 ч. Максимальное содержание персисторов в стационарных ку льтурах. когда происходит замедление клеточного метаболизма, свидетельствует в пользу того, что в процессе персистообразования принимают участие гены, продукты которых накапливаются в стационарной фазе роста.

Заключение

Таким образом, полиамины вызывают повышение выживаемости бактерий при действии аминогликозида нетилмицина в диапазоне от субингибиторных до летальных концентраций. В культуре полнаминзависимого мутанта добавка полиаминов приводит к концентрационнозависимому возрастанию персистообразования до уровня профицитных штаммов.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ (проект № 16-44-5 90279-р_а).