Полифункциональная модификация биологически активных веществ

Известно, что стрептокиназа [К.Ф.3.4.99.22] – бактериальный белок, обладающий тромболитической активностью [6].

Ранее подробно описан процесс химической модификации стрептокиназы окисленным декстраном [2].

В некоторых случаях тромболитической терапии целесообразно сочетать такой курс

лечения с применением вазодилятаторов. Так, аденозин оказывает отчетливое сосудорасширяющее действие. Аденозин участвует в обменных процессах, усиливает ресинтез АТФ в миокарде при ишемии, оказывает коронаро-расширяющее действие, что позволяет рекомендовать аденозин в качестве гипотензивного антиаритмического средства [5].

Представляло интерес осуществить такую модификацию стрептокиназы, которая бы позволила сочетать в препарате тромболитическую активность и гипотензивное действие.

В качестве модифицирующего агента мы выбрали окисленный олигосахарид. Взаимодействие белков с окисленными декстранами – хорошо изученный процесс [3]. Здесь мы выбрали в качестве олигосахарида д -циклодекст-рин, являющийся циклическим олигосахаридом с молекулярной массой равной 1298 Да. Циклодекстрины способны включать в свою внутреннюю полость малые молекулы.

Нами использован метод иммобилизации при включении в д -циклодекстрин аденозина (Ад). Предварительно д -циклодекстрин ( д -ЦД) окисляли периодатом калия и затем химически связывали с белком стрептокиназой (СК) в условиях, аналогичных тем, в которых была изучена химическая модификация стрептокиназы окисленным декстраном [1].

В водном растворе СК представляет глобулу с радиусом Стокса равным 31,1 А^о. Концентрацию белка СК в растворе определяли по оптической плотности в ультрафиолетовой области спектра, используя приведенные значения удельного коэффициента поглощения е ¹ 2 280 =8,8 и е 0277 = 0,98 [4]. Спектральные характеристики растворов исследовали с помощью спектрофотометра Hitachi U-2900 производства Японии.

В качестве олигомера-модификатора использовали д -ЦД фирмы «Pharmatec. Jnc.»

Количество ковалентных связей в конъюгатах, образованных между стрептокиназой и окисленным д -циклодекстрином, определяли по убыли свободных аминогрупп в конъюгатах по сравнению с нативным белком.

д -циклодекстрин окисляли периодатом калия. Реакцию проводили в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Количество пери-одата калия, необходимое для окисления ЦД, рассчитывали по уравнению реакции:

д -ЦД + JO " ₄ ® д -ЦД (окисленный) +

+ JO. - НСОО - НО

• ³ + ^{+ 2}

Активация ЦД заключалась в окислении его глюкопиранозных звеньев с образованием свободных альдегидных групп с помощью калия йоднокислого мета. Перед проведением реакции химического связывания активированного ЦД со СК проводили его очистку от избытка ионов окислителя JQ. и образовавшихся ионовJQ3.

Для этой цели использовали слабоосновный анионит типа АРА. Анионит предварительно переводили в ацетатную форму с помощью 0,5 М раствора уксусной кислоты.

Определение содержания альдегидных групп в окисленном ЦД, а также в восстановленных препаратах основано на реакции этих групп с солянокислым гидроксиламином. При этом взаимодействии выделяется соляная кислота, которую оттитровывают стандартным раствором NaOH и по количеству щелочи, пошедшей на титрование, рассчитывают содержание альдегидных групп [1].

Контроль за степенью модификации СК осуществляли с помощью метода гель-хро-матографии. Хроматографию проводили на стеклянной колонке объемом 100 мл, заполненной гелем Сефадекс G-200 в качестве неподвижной фазы.

В качестве элюента на колонку подавался физиологический раствор со скоростью 5 мл/час. Под действием потока подвижной фазы вещества, нанесенные на колонку, перемещаются вдоль нее с различными скоростями, величины которых обратно пропорциональны коэффициенту распределения ( K_av ) хроматографируемых веществ, причем чем меньше размер молекулы, тем больше К_av .

Для калибровки колонки использовали набор фирмы Serva со стандартизованными белками известной молекулярной массы (Мм).

Коэффициент распределения определяли по формуле:

к- V V

К av , av _{m 0}

где V_m – максимальный объем удерживания, соответствующий веществу полностью включенному в гранулы геля (фенилаланин, V_m =100 мл); V ₁ – объем удерживания исследуемого вещества; V ₀ – свободный объем данной колонки, определяемый веществом, полностью исключенным из гранул геля (голубой декстран, V ₀ =40 мл);

В таблице 1 приведены результаты калибровки колонки с Сефадексом G-200. На рисунке 1 приведена зависимость Кav от величины lg (Мм).

За степень окисления g -ЦД принимали величину, численно равную количеству пар альдегидных групп, приходящихся на 100 элементарных звеньев a -D-глюкозы.

Определение количества свободных аминогрупп и степени модификации белка (a) проводили спектрофотометрически с помощью 2,4,6-тринитробензолсульфокислоты (ТНБС). Калибровочную прямую строили по растворам глицина. Степень модификации рассчитывали на основе 3–5 измерений оптической плотности растворов с различными концентрациями белка. Результаты измерений a рассчитывали как долю аминогрупп, вступивших в реакцию образования ковалентных связей с олигомерной матрицей от общего числа свободных аминогрупп исходной СК.

При определении концентрации вещества в растворе спектрофотометрическими методами погрешность определения составляла < 5 %.

Содержание альдегидных групп по результатам иодометрического титрования определяется с погрешностью 10 %. Погрешность определения степени модификации СК с помощью ТНБС составляет 3–5 %.

Погрешность определения молекулярных масс по данным гель-хроматографии составила 15 %.

Модификацию стрептокиназы окисленным очищенным ЦД проводили в 0,5 М содовом буферном растворе при рН 9,5 в течение

Таблица 1

Объемы удерживания и коэффициенты распределения веществ с известной молекулярной массой на колонке с Сефадексом G-200 в 0,9 % NaCl, объем геля V = 100 мл

№	Наименование	Молекулярная масса (Мм), Да	Объем удерживания, мл	К аv	lg (Мм)
1	Голубой декстран	2 000 000	40	–	–
2	Бычий сывороточный альбумин	66 000	65	0,42	4,8
3	Стрептокиназа	47 300	69	0,49	4,7
4	Химотрипсиноген	25 000	77	0,62	4,4
5	Цитохром С	12 400	84	0,73	4,1
6	Фенилаланин	165	100	–	–

Рис. 1. Зависимость коэффициента распределения белков ( К_аv ) с известной молекулярной массой от величины lg (Мм)

• 1    часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании. В результате взаимодействия e -аминогрупп лизиновых остатков белка с альдегидными группами окисленного g -ЦД образуется высокомолекулярный продукт СК-ЦД, содержащий неустойчивые двойные С=N-связи (основание Шиффа).

Для восстановление двойных связей С=N вносили в реакционную смесь двукратный молярный избыток боргидрида Na или К. При этом происходит стабилизация двойных связей с превращением их в одинарные, а непрореагировавших (избыточных) альдегидных групп декстрана в спиртовые.

Очистку, деминерализацию и концентрирование модифицированного раствора СК проводили на ультрафильтрационной установке Vivaflow 200, используя мембранный модуль 5 кДа HYS.

Деминерализацию проводили 4 раза десятикратным объемом очищенной воды. Контроль за степенью очистки вели спектрофотометрически по оптической плотности (D₂₃₅) при длине волны l = 235 нм, добиваясь ее значения ниже 0,25 в кювете 1 см.

Для исследования связывания СК с окисленным г-циклодекстрином использовали препарат g-ЦД со степенью окисления 10,1 %. В таблице 2 приведены исходные соотношения СК и окисленного g-ЦД в реакционной среде и характеристика полученного продук- та модифицированной СК. В последнем столбце приведены рассчитанные молекулярные массы модифицированной СК. При максимальном молярном трехсоткратном избытке g-ЦД в реакционной среде молекулярная масса конъюгата достигает 65 кД, причем на одну макромолекулу СК оказывается присоединенным до 14 остатков g-ЦД. Объемы удерживания полученных продуктов систематически снижаются при увеличении степени модификации СК, но это снижение не очень сильно выражено.

Получение тройного комплекса СК-ЦД-Ад проводили с модифицированной СК, полученной при десятикратном массовом избытке g -ЦД (см. табл. 2, строка 1).

Полученную на первом этапе модифицированную СК-ЦД после очистки высушивали лиофильно. Включение Ад в полученный препарат модифицированной СК проводили, растворяя 100 мг препарата СК-ЦД в 10 мл 0,01 М Na2CO3 при рН = 11,05. Затем в полученный раствор внесли 0,2 ммоль (54,3 мг) аденозина. Смесь выдерживали 1 час при температуре 20 ± 2 оС и хроматографировали на колонке с сефадексом G-10. 100 мг препарата СК-ЦД соответствует 1,53 ∙ 10-3 ммоль модифицированной СК, причем ЦД в этом препарате содержится 0,02 ммоль. Таким образом избыток Ад по отношению к количеству ЦД в растворе составляет 0,2 ммоль

Таблица 2

Условия химической модификации стрептокиназы окисленным g -циклодекстрином

№ п/п	Исходное соотношение СК и γ-ЦД в реакционной среде СК : ЦД		Объем удержания ( V мл ), мл	Соотношения в конечном продукте СК : ЦД, моль/моль	Степень модификации ( α ), %	К аv	Рассчитанная молекулярная масса
							Мм	lg (Мм)
	мг/мг	моль/моль
1	1 : 10	1 : 364	66	1 : 14	44	0,43	65 472	4,82
2	1 : 5	1 : 182	66	1 : 14	44	0,43	65 472	4,82
3	1 : 1	1 : 36	68	1 : 8	25	0,45	57 684	4,76
4	1 : 0,5	1 : 18	68	1 : 6	19	0,49	55 088	4,74
5	1 : 0	1 : 0	69	1 : 0	0	0,49	47 300	4,70

Примечание. CК – стрептокиназа; g -ЦД – циклодекстрин; V _мл – объем удерживания модифицированной СК.

Таблица 3

Характеристика модельной смеси модифицированной СК в присутствии Ад в соотношении СК-ЦД 0,003 ммоль/л : Ад 0,044 ммоль/л (1:14)

Название вещества	Концентрация вещества С, моль/л	Оптическая плотность D *	Оптическая плотность D **
Стрептокиназа	0,003	0,050	0,050
Аденозин	0,044	0,695	0,695
Стрептокиназа + аденозин	0,003 : 0,044	0,735	0,685
γ-ЦД	0,044 ***	0	0

Примечание . D* – оптическая плотность при l =259 нм; D** – оптическая плотность с учетом плотности стрептокиназы при l =259 нм; *** – концентрация g -ЦД (рассчитано из молекулярной массы 1 звена).

Ад на 0,02 ммоль ЦД, входящего в структуру СК-ЦД.

Колонка с Сефадексом G-10 диаметром 1,3 см и высотой 15 см содержала 64 мл набухшего геля G-10. Скорость элюции составляла 26,5 мл/час ∙ см2. Объем удерживания голубого декстрана составлял 27 мл, тирозина – 60 мл. На колонку с Сефадексом G-10 нанесли 10 мл приготовленного ранее раствора СК-ЦД-Ад в содовом буфере. Собрали высокомолекулярную фракцию, соответствующую объему удерживания голубого декстрана, в объеме 30 мл.

Если предположить, что потери модифицированной СК при хроматографии на колонке с Сефадексом G-10 отстутствовали, то ее концентрация составила в собранной фракции 0,51∙10-4 ммоль/мл.

Спектр поглощения СК в указанной концентрации показан на рисунке 2 (1). Спектр g -ЦД приведен на рисунке 2 (2). На рисунке 2 (3) приведен спектр Ад. Видно, что в зоне максимума поглощения Ад при длине волны l =259 нм СК и полиглюкин практически не вносят заметный вклад в оптическую плотность.

Таким образом, замерив оптическую плотность раствора модифицированной СК и Ад можно при длине волны l =259 нм определить концентрацию Ад в растворе высокомолекулярной фракции, то есть рассчитать количественно Ад, включенного в модифицированную СК. Предварительно определив оптическую плотность контрольного раствора Ад, расчетным путем нашли, что соотношение Ад и СК-ЦД в полученном растворе соответствует одному молю Ад, включенному в один моль ЦД (см. табл. 3).

Рис. 2. Спектральные характеристики модифицированной стрептокиназы (1), g -ЦД (2) и аденозина (3)

В заключение можно отметить, что циклодекстрин, связанный с белком стрептокиназой в результате взаимодействия окисленных глюкопиранозных звеньев с аминогруппами белка, сохраняет способность поглощать малые молекулы в свою внутреннюю полость.