Полиморфизм ДНК, генетическая оригинальность и идентификация популяций и ремонтно-маточных стад стерляди (Acipenser ruthenus)

Сохранение генетических ресурсов ценных промысловых видов рыб является в настоящее время актуальной задачей. Резкое сокращение численности осетровых рыб вызвано нерациональным браконьерским промыслом, причинением ущерба местам их обитания, а также нарушением условий

их размножения и нагула [Сытова, 2016]. Весь отряд осетрообразных рыб внесен в списки Конвенции о международной торговле видами дикой фауны и флоры (CITES – Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora), находящимися под угрозой исчезновения [Rаymаkers, 2006], а также семейство Acipenseri-dae внесено в различные категории Международной Красной книги [Birstein et аl., 1997, Rаymаkers, 2002]. Стерлядь ( Acipenser ruthenus Linnaeus) является редким видом современной фауны, охрана которого осуществляется как на законодательном уровне в Российской Федерации [Об утверждении …, 2020], так и за рубежом [Raymarkers, 2006].

Генетические исследования осетровых рыб являются одним из эффективных инструментов мониторинга воспроизводства и сохранения естественных популяций и стад в условиях аквакультуры [Dudu, 2011; Козлова и др., 2013, Fopp-Bayat, 2015]. Именно в искусственных условиях часто разводятся виды или даже их гибриды из других регионов, что усложняет их корректную видовую идентификацию [Мюге, 2008]. Молекулярногенетическая идентификация важна как для определения генотипов рыб, выпускаемых в водотоки и водоемы с целью восполнения численности рыб в популяциях, уменьшенной при антропогенной деятельности, а также при разведении стерляди в аквакультуре. Генетическое разнообразие естественных популяций и ремонтно-маточных стад A. ruthenus изучено недостаточно.

Цель данной работы – сравнительный анализ генетического разнообразия и генетической оригинальности групп естественных популяций и ремонтно-маточных стад стерляди из Приволжского федерального округа, а также молекулярногенетическая идентификация стерляди на основании полиморфизма межмикросателллитных маркеров.

Материал и методы

Объектами для исследования полиморфизма фрагментов ДНК и генетической оригинальности явились три естественные популяции стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, Acipenseridae) из Приволжского федерального округа: Ar_Km– из среднего течения р. Камы Волжского речного бассейна (Пермский край); Ar_Su– из нижнего течения р. Сухоны Северо-Двинского речного бассейна (Вологодская обл.); Ar_Sh– из среднего течения р. Вятки Волжского речного бассейна (Кировская обл.); а также три ремонтно-маточных стада стерляди, расположенных в разных регионах Приволжского федерального округа: Ar_Ks – из рыбоводного хозяйства Костромской обл., Ar_Sr– из Саратовского филиала ФГБНУ «ВНИРО» («Сара- товНИРО»); Ar_Ah – из рыбоводного хозяйства «ООО Тополь» Пермского края.

Выборка стерляди из р. Камы ( Ar_Km) была отловлена на участке, расположенном в 2 км ниже Воткинской ГЭС. В Пермском крае популяции верхнекамской стерляди присвоена III категория редкости [Красная книга Пермского края, 2018]. Данная популяция не относится к верхнекамской стерляди и, соответственно, не занесена в Красную книгу региона, в связи с чем отлов стерляди для сбора плавников был официально разрешён. Естественная популяция стерляди ( Ar_Su ) была отловлена на участке р. Сухоны, расположенном между населёнными пунктами Тотьма и Полдарса. В Вологодской обл. A. ruthenus присвоена II категория редкости [Красная книга Вологодской области, 2010]. Выборка стерляди ( Ar_Sh ) была отловлена в нижнем течении р. Вятки около населённого пункта Шурма. В Кировской обл. стерляди присвоена II категория редкости, однако вятская популяция не занесена в Красную книгу данного региона [Красная книга Кировской области, 2014].

Ремонтно-маточное стадо Ar_Ks из рыбоводного хозяйства Костромской обл. было частично отловлено из р. Волги. Выборка из Саратовского филиала ФГБНУ «ВНИРО» Ar_Sr была также частично отловлена из р. Волги. Ремонтно-маточное стадо стерляди из «ООО Тополь» Ar_Ah было закуплено на ЦВР Пермской ГРЭС. Целью создания ремонтно-маточных стад вышеуказанных рыбоводных хозяйств является восполнение численности естественных популяций, а также товарное выращивание.

В каждой из изученных естественных популяций и в каждом ремонтно-маточном стаде было исследовано по 30 особей A. ruthenus . Для генетического анализа отбирались фрагменты грудных плавников с последующим выпуском рыбы в водоём, так как стерлядь относится к числу редких видов рыб [Об утверждении Перечня объектов животного мира…, 2020]. Фиксация материала была проведена сразу же после взятия проб в 96%-ном спирте. Хранение материала до выделения ДНК проводилось при температуре +4ºС.

Анализ полиморфизма ДНК проведен в группе естественных популяций и в группе ремонтноматочных стад стерляди, при этом каждая группа включала по 3 выборки и насчитывала по 90 рыб. ДНК выделялась по методике С. Роджерса и А. Бендиха [Rogers, Bendich, 1985], которая была модифицирована с использованием в качестве сорбента PVPP (polyvinylpolypyrrolidone). ДНК была выделена из тканей плавников 180 особей стерляди. Навеска составляла 100 мг. Качественные характеристики и концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре «NanoDrop 2000» (Thermo Fisher Scientific, США). Для ПЦР концентрацию вы- равнивали до 10 нг/мкл. Генетический полиморфизм изучен у 180 проб ДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с пятью эффективными ISSR-праймерами, установленными ранее [Комарова и др., 2015]. В данном исследовании применен метод межмикросателлитного анализа (ISSR – Inter Simple Sequence Repeats) полиморфизма ДНК [Zietkiewicz et al., 1994]. Реакционная смесь для ПЦР включала в себя 2 единицы Tag-полимеразы, 2.5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР, 25 пМ праймера, 2.5 мМ Mg2+, 0.25 мM dNTP, а также 5 мкл матричной ДНК. ПЦР проведена в термоциклере «My Cycler» (Bio-Rad, USA). При этом использован типичный для ISSR-метода протокол: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72°С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.; t отжига, 5 сек.; 72°С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин. при 72ºС. В зависимости от G/С-состава праймеров температура отжига изменялась от 56 до 64°С. При отрицательном (К-) контроле вместо матрицы в реакционную смесь добавляли 5 мкл деионизированной воды. ПЦР повторяли не менее двух раз. В шести выборках стерляди проанализирован полиморфизм 115 ISSR-PCR маркеров.

Электрофорез ампликонов проведен в 2%-ном агарозном геле в 1х ТВЕ буфере. Фрагменты ДНК в гелях окрашивали бромистым этидием, а после этого фотографировали в системе Gel-Doc XR («Bio-Rad», USA) в проходящем ультрафиолетовом свете. Длину фрагментов ДНК определяли с помощью маркера молекулярной массы (100 bp +1.5 + 3 Кb DNA Ladder; «ООО-СибЭнзим-М», Москва), а также при помощи программы Quantity One в системе гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», USA).

Фрагменты ДНК были представлены в виде матрицы бинарных данных. Полиморфизм по интенсивности не брали в расчет. Для компьютерного анализа использованы программа POPGENE1.31 и специализированный макрос GenAlEx6 для MS-Excel, с помощью которых определены общепризнанные показатели генетического разнообразия. Типичные и специфичные маркеры были установлены в соответствии с мeто-дикой определения коэффициента гeнeтичeской оригинальности – КГО [Потокина, Александрова, 2008].

Генетическая структура популяций и стад была установлена и представлена в виде следующих параметров [Nei, 1975]: во всей популяции ожидаемая доля гетерозиготных генотипов ( Н Т ) как мера общего генного разнообразия; в отдельной популяции ожидаемая доля гетерозиготных генотипов ( H s ) как мера ее внутрипопуляционного разнообразия. Кроме того, установлен показатель подразделенности популяций, или G ST , который показывает долю межпопуляционного генетического разнообразия в общем генетическом разнообразии.

Молекулярно-генетическая идентификация выполнена по методике С.В. Боронниковой [2008]. Для проверки идентификационных маркеров опыт повторяли дважды. Для выявления идентификационных маркеров, общих для видов одного рода, так называемых «родовых» использовали пробы ДНК осетра сибирского ( Acipenser baerii Brandt). Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием стандартных для популяционно-генетических исследований методов в программе STATISTICA 6.0.

Результаты и их обсуждение

При определении генетического полиморфизма у всех особей из группы естественных популяций A. ruthenus было выявлено 103 ISSR-PСR маркера (табл. 1), из них 96 оказались полиморфными ( P 95 = 0.932). В группе же ремонтно-маточных стад A. ruthenus было установлено 106 ISSR-PСR маркеров, из них полиморфными оказались 90 ( P 95 = 0.849). Итак, доля полиморфных локусов незначительно выше в группе естественных популяций стерляди. Число выявленных ISSR-PCR маркеров A. ruthenus в группе естественных популяций изменялось в зависимости от праймера от 18 (CR-212 [(CT) 8 TG)]) до 24 (X11 [(AGC) 6 G]. Число установленных ISSR-PCR маркеров A. ruthenus в группе ремонтно-маточных стад изменялось больше, а именно – от 16 (CR-212 [(CT) 8 TG)]) до 26 (X11 [(AGC) 6 G]. Размеры выявленных ISSR-PCR маркеров (табл. 1) в обеих исследованных группах варьировали в диапазоне от 200 (ISSR-9) [(ACG) 7 G] до 1500 п.н. (X9) [(ACC) 6 G].

Таблица 1

Характеристика ISSR-PCR маркеров группы естественных популяций и группы ремонтноматочных стад A. ruthenus

ISSR-праймеры	Нуклеотидная последовательность (5'→ 3')	Длина маркеров, п.н	Общее число полиморфных ISSR-PCR маркеров (их частота)
			Группа естественных популяций ( Ar_Km , Ar_Su , Ar_Sh )		Группа ремонтно-маточных стад ( Ar_Ks , Ar_Sr , Ar_Ah )
			всего	полиморфных	всего	полиморфных
CR-212	(CT) 8 TG	230-960	18	16 (0.889)	16	16 (1.000)
X11	(AGC) 6 G	280-1000	24	22 (0.917)	24	21 (0.875)
CR-215	(CA) 6 GT	210-1000	19	17 (0.895)	19	17 (0.895)

Окончание табл. 1

ISSR-праймеры	Нуклеотидная последовательность (5'→ 3')	Длина маркеров, п.н	Общее число полиморфных ISSR-PCR маркеров (их частота)
			Группа естественных популяций ( Ar_Km , Ar_Su , Ar_Sh )		Группа ремонтно-маточных стад ( Ar_Ks , Ar_Sr , Ar_Ah )
			всего	полиморфных	всего	полиморфных
ISSR-9	(ACG) 7 G	200-800	20	20 (1.000)	21	14 (0.667)
X9	(ACC) 6 G	200-1500	22	21 (0.955)	26	22 (0.846)
Всего ISSR-PCR маркеров			103	96 (0.932)	106	90 (0.849)

Примечание. Группа естественных популяций включает Ar_Km – из р. Камы; Ar_Su –из р. Сухоны; Ar_Sh –из р. Вятки; группа ремонтно-маточных стад включает Ar_Ks – из рыбоводного хозяйства Костромской обл.; Ar_Sr – из Саратовского филиала ФГБНУ «ВНИРО» («СаратовНИРО»), Ar_Ah –из «ООО Тополь»; CR-212, X11, CR-215, ISSR-9, X9 – обозначения праймеров.

Ожидаемая гетерозиготность (HE) в группе естественных популяций A. ruthenus (HE = 0.294) также незначительно выше (табл. 2), чем в другой группе (HE = 0.269). Эффективное число установленных аллелей на локус (ne) оказалось выше в первой группе, то есть у естественных популяций, и составило 1.477. В обеих группах обнаружено по три редких аллеля (табл. 2). При сравнении уста- новленных показателей генетического разнообразия, группы естественных популяций (P95 = 0.932; HE = 0.294; ne = 1.477) и группы ремонтноматочных стад (P95 = 0.849; HE = 0.269; ne = 1.434), с использованием традиционных критериев Фишера и Стьюдента, установлено, что их разница незначима (табл. 2).

Таблица 2

Генетическое разнообразие группы естественных популяций и группы ремонтно-маточных стад A. ruthenus

Группа	Показатели генетического разнообразия
	P 95	H E	h	n e
Группа естественных популяций	0.932	0.294 (0.015)	0.293 (0.148)	1.479 (0.312)
Группа ремонтно-маточных стад	0.849	0.269 (0.015)	0.269 (0.156)	1.433 (0.311)
Критерий	Фишера ( F)			Стьюдента (t)
Значение критерия	F =1.815	F =0.373	F =0.207	t= 0.100
Сравнение с F st или t st	1.815 <1.96	0.373 <1.96	0.207 < 1.96	0.100 < 1.98

Примечание. P 95 - доля полиморфных локусов; H e - ожидаемая гетерозиготность; n e - эффективное число аллелей на локус; h – доля редких морф; в скобках даны стандартные отклонения; состав групп естественных популяций и ремонтно-маточных стад указаны в табл. 1.

Доля редких морф h (в нашем случае редких фрагментов ДНК) указывает, что сбалансированность структуры генетического разнообразия в группе естественных популяций по сравнению с группой ремонтно-маточных стад различается незначительно.

Коэффициент генетической оригинальности из 6 изученных выборок выше у ремонтно-маточного стада Костромской обл. (КГО = 1.439). Это означает, что генофонд данной выборки стерляди имеет тенденцию к специфичности, а генофонд выборки из естественной популяции р. Сухоны (КГО =0.615) менее гетерогенен и несет больше типичных аллелей. Одной из причин низкой генетической гетерогенности может быть тот факт, что исследуемые особи родственны между собой, как было показано в другом исследовании стерляди на основании анализа изменчивости нуклеотидных последовательностей фрагмента локуса cyt b мтДНК [Слынько и др., 2017]. Вместе с тем КГО выше в группе естественных популяций и равен 2.040, чем в группе ремонтно-маточных стад

A. ruthenus (КГО=1.928). Это означает, что генофонды естественных популяций в своем составе содержат больше специфичных аллелей, а генофонды ремонтно-маточных стад – больше типичных аллелей. Таким образом, установленные показатели генетического разнообразия и новой характеристики генетической оригинальности (КГО) оказались незначительно выше в первой группе естественных популяций, по сравнению с этим показателем во второй группе ремонтно-маточных стад стерляди.

Анализ выявленной генетической структуры у группы естественных популяций и у группы ремонтно-маточных стад A. ruthenus показал, что в так называемой общей популяции ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HT), а также в отдельной группе ожидаемая доля гетерозиготных генотипов по всем локусам (HS) незначительно выше в первой группе естественных популяций, чем во второй группе ремонтно-маточных стад. Коэффициент генетической подразделенности (GST), так же незначительно выше в группе естественных попу- ляций и равен 0,377 (табл. 3).

Наибольшая дифференциация в группе естественных популяций A. ruthenus установлена с использованием праймера X11 [(AGC) 6 G]. В группе ремонтно-маточных стад праймер CR-212 [(CT) 8 TG] выявил наибольшую степень дифференциации среди исследованных выборок (табл. 3). Коэффициент подразделенности популяций, как итоговый показатель ( G ST ), показывает, что на

Таблица 3

Генетическая структура группы естественных популяций и группы ремонтно-маточных стад A. ruthenus

Выборка	Показатель	ISSR-PCR праймер					На группу
		CR-212	X11	CR-215	ISSR-9	X9
Группа есте-	H t	0.309 (0.019)	0.307 (0.025)	0.338 (0.023)	0.265 (0.023)	0.330 (0.026)	0.310 (0.023)
ственных по-	H S	0.201 (0.009)	0.162 (0.015)	0.190 (0.008)	0.196 (0.012)	0.220 (0.015)	0.193 (0.012)
пуляций	G st	0.348	0.474	0.438	0.259	0.331	0.377
Группа ре-	H t	0.312 (0.019)	0.293 (0.025)	0.334 (0.021)	0.244 (0.043)	0.270 (0.025)	0.288 (0.027)
монтно-маточ-	H S	0.169 (0.011)	0.173 (0.012)	0.229 (0.014)	0.148 (0.019)	0.188 (0.017)	0.181 (0.015)
ных стад	G st	0.456	0.407	0.313	0.392	0.305	0.370

Примечание. H T – доля гетерозиготных генотипов; H S – доля гетерозиготных генотипов внутри выборки; G ST – показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения; состав групп естественных популяций и ремонтно-маточных стад указаны в табл. 1; CR-212, X11, CR-215, ISSR-9, X9 – обозначения праймеров.

Молекулярно-генетическая идентификация проведена с использованием молекулярных маркеров и их характеристик, определенных на основании частот аллелей, полученных при молекулярногенетическом анализе шести выборок стерляди. На основе ISSR-спектров A. ruthenus , полученных при электрофорезе продуктов ПЦР с пятью эффективными праймерами, удалось установить идентификационные маркеры или их сочетания для трёх изученных популяций и трёх ремонтно-маточных стад этого вида.

При сравнении спектров амплификаций стерляди ( A. ruthenus ) и близкородственного вида осетра сибирского ( A. baerii ) были выявлены мономорфные родовые ISSR-PCR маркеры, характерные для обоих видов: ACIP r 230 ISSR9 ; ACIP r 380 CR212 ; ACIP r 250 CR212 ; ACIP r 430 CR215 ; ACIP r 210 CR215 ; ACIP r 170 X11 .

Для изученных выборок A. ruthenus установлены пять видовых ISSR-PCR маркеров, выявленных у всех изученных рыб: Ar v 1030 CR215 ; Ar v 730 CR215 ; Ar v 250 CR215 ; Ar v 660 X11 ; Ar v 450 X11 . Также, при молекулярно-генетической идентификации, были установлены полиморфные фрагменты или их сочетания для каждой выборки, встречающиеся с частотой от 0.05 до 0.95.

Для апробации подходов идентификации изученных выборок A. ruthenus была проведена анонимная идентификация проб ДНК неизвестной выборки на основании анализа идентификационных маркеров. Процедура анонимной идентификации составила несколько этапов:

межпопуляционную компоненту в первой группе естественных популяций приходится 37.7% всего генетического разнообразия. Почти идентичный показатель в группе ремонтно-маточных стад – 37.0%. Итак, в двух изученных группах стерляди степень дифференциации выборок оказалась выше среднего значения и почти одинаковой у этих двух групп.

• 1)    проведение ISSR-анализа полиморфизма ДНК: с 30 пробами ДНК неизвестной выборки была поставлена ПЦР с 5 эффективными ISSR-праймерами для A. ruthenus (СR-212, Х11, СR-215, ISSR-9, X9);

• 2)    компьютерный анализ: полученные ISSR-спектры неизвестного образца сравнивались с ISSR-профилями изученных ранее выборок A. ruthenus . При сравнении полученных ISSR-профилей четко были выявлены мономорфные фрагменты, соответствующие видовым фрагментам A. ruthenus – Ar v 320 ISSR9 ; Ar v 1030 CR215 ; Ar v 730 CR215 ; Ar v 250 CR215 ; Ar v 660 X11 ; Ar v 450 X11 ; следовательно, можно сделать вывод, что данная ДНК неизвестного образца принадлежит стерляди;

• 3)    для идентификации выборки, к которой принадлежит неизвестный образец ДНК, было проведено сравнение полиморфных ISSR-PCR маркеров. На электрофореграмме неизвестного образца стерляди с праймерами X11 и X9 присутствуют фрагменты 760 X11 , 870 X9 с частотой более 0.500, которые встречаются только у естественной популяции Ar_Sh из р. Вятки. При дальнейшей процедуре сравнения ISSR-паттернов исследованной ранее популяции Ar_Sh и неизвестного образца, четко прослеживалось совпадение всех маркеров, ам-плифицированных в ПЦР с пятью ISSR-праймерам, а следовательно, данный неизвестный тестируемый образец принадлежит естественной популяции Ar_Sh из р. Вятки A. ruthenus .

Таким образом, для A. ruthenus были установлены шесть общих для двух видов рода Acipenser, то есть идентификационных родовых фрагментов; а также пять видовых фрагментов.

По результатам проведенного исследования были разработаны следующие рекомендации для рыбоводных хозяйств:

• 1.    Для сохранения и восстановления генетических ресурсов A. ruthenus рекомендуется использовать естественную популяцию из р. Вятки ( Ar_Sh ), так как у нее выявлены самые высокие среди установленных показатели генетического разнообразия ( P 95 = 0.776; H E = 0.181; n e =1.313).

• 2.    С целью сохранения типичных для региона исследований аллелей рекомендуется использовать естественную популяцию стерляди из р. Сухоны (КГО = 0.615).

• 3.    Для обоснования выпуска молоди в р. Каму, Вятку или Сухону также рекомендуется проведение молекулярно-генетической идентификации с обобщением в виде генетических паспортов и с указанием генетического сходства на основании полиморфизма установленных молекулярных маркеров.

Заключение

В ходе молекулярно-генетического анализа в группе естественных популяций A. ruthenus было выявлено 103 ISSR-PСR маркера, из которых 96 оказались полиморфными ( P 95 = 0.932), а в группе ремонтно-маточных стад – 106 ISSR-PСR маркеров, из которых 90 оказались полиморфными ( P 95 = 0.849). Итак, доля полиморфных локусов незначительно выше в группе естественных популяций стерляди.

Установленные показатели генетического разнообразия оказались незначительно выше в первой группе естественных популяций по сравнению с показателями второй группы ремонтно-маточных стад стерляди. Коэффициент генетической оригинальности (КГО) также выше в группе естественных популяций A. ruthenus . Это означает, что генофонд естественных популяций стерляди имеет тенденцию к специфичности, а генофонд ремонтно-маточных содержит больше типичных аллелей.

Проведенный анализ генетической структуры двух групп (естественных популяций и ремонтноматочных стад) A. ruthenus показал, что коэффициент подразделенности так же незначительно выше ( G ST = 0.377) в группе естественных популяций. Как и в других исследованиях [Побединцева, 2016], полученные данные свидетельствует о сложной популяционной структуре изученных выборок стерляди.

Для A. ruthenus были установлены шесть идентификационных родовых ISSR-PCR маркеров; пять видовых ISSR-PCR маркеров, а также перечень и сочетаемость полиморфных маркеров для молекулярно-генетической идентификации изученных выборок. Проведена анонимная идентификация проб ДНК неизвестной выборки стерляди, которая подтвердила эффективность выполненной молекулярно-генетической идентификации. Полученные данные о генетическом разнообразии групп естественных популяций и ремонтно-маточных стад могут быть использованы для сохранения генофондов стерляди, характерных для того или иного региона.

Работа выполнена в рамках государственного задания по науке ФГАОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» № FSNF-2020-0008 (регист. номер АААА-А20-120081990069-3).