Полиморфизм гена ТР53 у пациентов с раком желудка в популяционном проспективном и клиническом исследованиях

Индивидуальная генетическая чувствительность к заболеванию, в основе которой лежит полиморфизм ключевых генов, ответственных за защиту организма от возникновения опухолевых клеток, также влияет на развитие РЖ. В процессах канцерогенеза важная роль отводится гену опухолевой супрессии ТР53, локализованному на коротком плече 17 хромосомы и содержащему 11 экзонов. Ген ТР53 кодирует белок р53, играющий критическую роль в регуляции транскрипции ДНК и клеточного цикла и запускающий программируемую гибель клеток при генетических нарушениях, вызывающих злокачественную трансформацию, тем самым предотвращая возникновение опухоли [8]. Нарушения гена ТР53, такие как потеря гетерозиготности и соматические мутации (чаще всего в экзонах 5–8), приводят к дисфункции белка р53 с утратой супрессорной функции. В настоящее время известно более 20 000 мутаций в гене ТР53 [9]. Наиболее частыми типами мутаций в клетках опухоли, приводящими к аминокислотным заменам с изменением функции белка, являются точечные мутации в ДНК, или миссенс-мутации [8]. В октябре 2006 г. в базе данных Международного агентства по изучению рака (IARC) было отмечено, что в 31,2 % случаев РЖ имеется точечная мутация гена ТР53 [10]. В результате полиморфизма кодона 72 в экзоне 4 гена ТР53 белок синтезируется в нескольких вариантах в зависимости от аминокислотного состава (Arg – аргинин или Pro – пролин), с нарушением его супрессорной функции, что связано с риском развития некоторых видов рака. Считается, что Pro вариант молекулы р53 функционально менее активен в апоптозе, чем Arg вариант, поэтому носители этого аллеля могут быть более предрасположенными к раку [8, 11]. Частота встречаемости Pro аллеля зависит от географического региона, популяционной и расовой принадлежности. В частности, в Японии отмечается самая высокая частота встречаемости этого аллеля в мире.

Необходимо отметить, что на функциональную активность р53 оказывают влияние другие факторы, такие как распространённые в популяции и способные инактивировать своими белками белок р53 инфекционные агенты, а также неблагоприятное сочетание с аллелотипами других функционально связанных генов [12, 13]. Более того, мутантный р53 может инактивировать «дикий» тип р53 и нарушать его взаимодействие с другими белками.

Цель исследования – изучить ассоциации генотипов и аллелей Arg72Pro полиморфизма 4 экзона гена ТР53 с РЖ и биомаркерами атрофии слизистой у пациентов с РЖ в популяционном проспективном и клиническом исследованиях «случай-контроль» в сибирской популяции.

Материал и методы

Эпидемиологический фрагмент работы выполнен в рамках многоцентровой программы HAPIEE (Health, Alcohol and Psychosocial Factors In Eastern Europe - «Детерминанты сердечно-сосудистых заболеваний в Восточной Европе: многоцентровое когортное исследование»), проведен с 2003 по 2005 г. с обследованием выборки населения обоего пола (n=9360), в возрасте 45-69 лет из общей популяции в двух типичных районах г. Новосибирска. Был создан банк биоматериалов, образцы сыворотки и ДНК хранились при –70ºС. В 2012 г. был проведён перекрёстный анализ базы данных HAPIEE с данными популяционного регистра рака НИИ терапии СО РАМН, фиксирующего все случаи злокачественных новообразований (ЗНО), зарегистрированных впервые в текущем году на территории тех же двух административных районов, с выявлением новых случаев РЖ. К каждому случаю РЖ методом случайных чисел из базы данных HAPIEE был подобран совпадающий по полу и возрасту, а также району жительства контроль в соотношении 1:2. В итоге доступных для анализа образцов сыворотки крови оказалось 156 (основная группа – 52, контрольная группа – 104), мужчины составили 61,7 и 60,3 % в этих группах соответственно.

Исследование уровня биомаркеров проводилось в группах «случай» и «контроль» в проспективном исследовании. Все образцы сыворотки тестировали с помощью набора диагностикумов «ГастроПанель» компании Biohit Plc (Helsinski, Finland) для иммуноферментного анализа (ПГI, ПГII, гастрина-17 и антител класса IgG к H. рylori ). Фундальную атрофию определяли как выраженную, если уровень ПГI был ниже 30 мкг/л и/или соотношение ПГI/ПГII менее 3, концентрация ПГII ниже 3 мкг/л также оценивалась как низкая. Выраженную антральную атрофию предполагали при уровне гастрина-17 ниже 1 пмоль/л. Тест на наличие IgG антител к H. рylori считали положительным при уровне >42 EIU.

Выделение ДНК из венозной крови проводилось методом фенол-хлороформной экстракции [21]. Прогенотипировано 146 образцов ДНК (50 пациентов с РЖ и 96 – контроль) из популяционного исследования и 167 образцов ДНК (80 пациентов с РЖ и 87 – контроль) из клинической группы. Генотипирование для оценки полиморфизма Arg72Pro в 4 экзоне TP53 осуществлялось методом ПЦР с последующим ПДРФ анализом [22].

Статистическая обработка проведена с помощью программы SPSS (версия 11.0). Анализировалось распределение признаков и их числовых характеристик (средние, стандартные отклонения). Значимость различий для средних величин оценивали по критериям Фишера (F) и Стьюдента (t). Критерием статистической значимости был уровень p<0,05. Статистическая обработка результатов включала расчет частот генотипов, аллелей и тестирование их распределения на соответствие равновесию Харди – Вайнберга (РХВ) с использованием критерия Χ-квадрат. Отношение шансов (OШ) c доверительным интервалом (95 % ДИ) рассчитывали по таблице сопряженности.

Программа исследования рассмотрена и одобрена комитетом по этике НИИ терапии СО РАМН (протокол № 41 от 30.10.12), каждый пациент подписал информированное согласие на участие в исследовании.

Результаты

Всего в исследование вошло 130 пациентов с РЖ и 183 человека из контрольной группы. По полиморфизму Arg72Pro 4 экзона гена ТР53 в контрольной группе частота генотипов соответствовала равновесию Харди – Вайберга (χ2=0,09). Частота аллеля Рro составила 33,3 %, а аллеля Аrg 66,7 %. Не выявлено разницы между частотами генотипов у пациентов с РЖ из эпидемиологического и клинического исследований. Распределение частот генотипов и аллелей гена ТР53 в группе с РЖ и в контроле статистически значимо не различалось (табл. 1).

В табл. 2 представлены средние показатели сывороточного пепсиногена ПГI и соотношения ПГI/ПГII при разных генотипах гена ТР53 в группе с РЖ и в контрольной группе (проспективное исследование). Средний показатель соотношения ПГI/ПГII оказался достоверно ниже в группе с РЖ, чем в контрольной группе, независимо от варианта генотипа ТР53, наиболее выражены различия при гомозиготном варианте pro/pro – 1,8 ± 1,7 vs 5,4 ± 2,6 (р=0,025).

В проспективном исследовании в группе «случай» средний показатель ПГI у носителей генотипа pro/pro оказался в 2 раза меньше (33,1 ± 40,3 мкг/л), чем у носителей гомозиготного варианта arg/arg (70,9 ± 77,1 мкг/л), однако из-за малочисленности группы (pro/pro), разница оказалась статистически незначимой.

Гетерозиготный генотип связан с тяжестью клинического течения процесса: среди больных РЖ III–IV стадии он выявлен у 66,7 % больных, в то время как у пациентов с РЖ ранних стадий он встречался в 25 % случаев (табл. 3). У носителей объединённого варианта генотипа ТР53 (pro/ pro+pro/arg) диагноз РЖ установлен на поздних

Таблица 1

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма Arg72Pro гена ТР53 в группах «случай» и «контроль» (проспективное и клиническое исследование)

Генотипы ТР53	РЖ (n=50)	Контроль (n=96)	ОШ (95 % ДИ)	р
Проспективное исследование
pro/pro	4 (8,0 %)	10 (10,4 %)	0,75 (0,22-2,52)	0,638
pro/arg	20 (40,0 %)	44 (45,8 %)	0,79 (0,39-1,58)	0,500
arg/arg	26 (52,0 %)	42 (43,8 %)	1,39 (0,70-2,77)	0,343
Arg аллель	72 (72,0 %)	128 (66,7 %)	1,29 (0,76-2,18)	0,352
Pro аллель	28 (28,0 %)	64 (33,3 %)	0,78 (0,46-1,32)
Клиническое исследование
Генотипы ТР53	РЖ (n=80)	Контроль (n=87)	OШ (95 % ДИ)	р
pro/pro	4 (5,0 %)	10 (10,5 %)	0,45 (0,14-1,49)	0,179
pro/arg	36 (45,0 %)	46 (48,4 %)	0,87 (0,48-1,58)	0,651
arg/arg	40 (47,1 %)	39 (41,1 %)	1,44 (0,79-2,62)	0,236
Arg аллель	116 (72,5 %)	124 (65,3 %)	1,40 (0,89-2,22)	0,146
Pro аллель	44 (27,5 %)	66 (34,7 %)	0,71 (0,45-1,13)

Таблица 2

Генотипы ТР53	РЖ (n=50)	Контроль (n=96)	р
Средние значения ПГI, мкг/л
pro/pro	33,1 ± 40,3	99,7 ± 104,5	0,248
pro/arg	68,9 ± 46,3	90,1 ± 49,6	0,110
arg/arg	70,9 ± 77,1	98,5 ± 51,5	0,081
Средние значения соотношения ПГI/ПГII
pro/pro	1,8 ± 1,7	5,4 ± 2,6	0,025
pro/arg	4,6 ± 3,1	6,3 ± 3,2	0,048
arg/arg	3,3 ± 2,1	6,8 ± 3,0	<0,001

Таблица 3

Генотипы ТР53	pro/pro (1)	pro/arg (2)	arg/arg (3)	р1–2	р1–3	р2–3
Стадия заболевания
I–II	1 (6,3 %)	4 (25,0 %)	11 (68,7 %)	0,2	0,001	0,2
III–IV	1 (3,0 %)	22 (66,7 %)	10 (30,3 %)	<0,001	0,004	0,004
Гистотип опухоли
Интестинальный РЖ	4 (6,9 %)	25 (43,1 %)	29 (50,0 %)	<0,001	<0,001	0,5
Диффузный РЖ	-	11 (50,0 %)	11 (50,0 %)	<0,001	<0,001	1,0

стадиях заболевания (III–IV) в 82,1 % случаев и в 17,9 % при РЖ I–II стадии (р<0,001). У пациентов с РЖ III–IV стадий заболевания в два раза чаще встречался вариант (pro/pro + pro/arg), чем гомозиготный arg/arg генотип (69,7 % против 30,3 %, р=0,002). У пациентов с I–II стадиями РЖ, напротив, в 68,7 % выявлен arg/arg генотип и в 31,3 % объединённый вариант с редким аллелем Pro (р=0,04) (табл. 3).

Так как диффузный тип РЖ, который не всегда ассоциирован с фундальной атрофией, обычно представлен недифференцированной карциномой и перстневидно-клеточным раком, по результатам морфологического исследования было выделено 2 группы: 1-я группа (58 человек) – интестинальный РЖ (аденокарциномы разной степени дифференцировки) и 2-я группа (22 человека) – диффузный РЖ (низкодифференцированная опухоль с перстневидными клетками, перстневидноклеточный рак и недифференцированная опухоль). Различий по частотам генотипов и аллелей между пациентами с разными гистотипами рака не обнаружено (табл. 3).

Обсуждение