Полиморфизм межмикросателлитных повторов у видов лука

Развитие или поиск эффективных ДНК маркеров для лука является основной задачей для контролируемой селекции и получения межвидовых гибридов. ДНК анализ, основанный на ПЦР (такие как RAPD, SSR, AFLP), широко применяли для таксономической классификации и идентификации различных видов, сортов, гибридов и линий лука. RAPD маркеры были использованы рядом исследователей для типирования генотипов лука, выявления интрогрессий, для маркирования хромосом лука шалота (Tanikawa T., и др. 2002; Shigyo M., и др., 1997a). AFLP техника была применена для построения более точных генетических карт на основе межвидовых скрещиваний между A. cepa и А. roylei (A.W. van Heusden, 2000)

ISSR-ПЦР метод основывается на использовании мик-росателлитных праймеров (простые повторы), как правило, в 17-20 нуклеотидных пар (Zietkiewicz E и др. 1994). Простые повторы в геноме являются высокоспецифичным признаком, в том числе таксономическим и филогенетическим. Более того, ограничено количество литературных источников, описывающих применение ISSR-ПЦР метода на генотипах лука.

Данное исследование поможет найти и оценить специфические локусы в геноме различных видов лука, которые могут послужить молекулярными маркерами в роде Allium. На молекулярном уровне необходимо подтвердить «гиб-ридность» полученных растений лука, научно обосновать и определить генетические дистанции как полученных форм, так и их родителей.

Материалы и методы исследований

Для исследований было взяты различные виды и образцы лука из коллекции лаборатории генетики и цитологии ВНИИССОК (табл. 1).

1. Виды и селекционные образцы лука, взятые для исследования

Вид	Количество образцов	Вид	Количество образцов
A. altaicum	4	A. tuberosum	1
A. odorum	3	A. subhirsutum	1
A. fistulosum	2	A.roylei,	1
A. nutans	1	A.auctum	1
A. schoenoprasum	1	A.rupestre	1
A. altissimum	1	A.vavilovii	1
A.proliferum	1	A.cepa	1
F 1 A.cepa x A.nutans	2	BC 2 F 5 (А.сера x A. fistulosum)	2
		Апомикт A0BC2F5	1

Рис. 1. Спектры геномной ДНК видов лука, полученные в результате ISSR анализа.

Справа налево дорожки 1 – 4 A. altaicum;

5 – 7 A. odorum; 8 A. subhirsutum; 9, 10 A. fistulosum;

11 A. nutans; 12 A. schoenoprasum;

13 A. altissimum; 14 A. tuberosum

Для выделения ДНК использовали метод с использованием CTAB-буфера (Dellaporta, 1983) и двукратной депротеинизацией хлороформом. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием реагентов и праймеров производства компании «СИНТОЛ» Москва.

Для проведения ISSR анализа подбирали оптимальную температуру отжига микросателлитных праймеров на ДНК матрице в диапазоне от 46 до 520С. ISSR фрагменты разделяли в 2% агарозном геле SFR высокого разрешения (Amresco, США) и окрашивали бромистым этидием. Размеры амплифицированных фрагментов определяли в сравнении с маркером молекулярных масс 100 bp DNA ladder (MBI FERMENTAS, Латвия).

Анализ результатов проводили с использованием программ GenStat ver. 6 и TREECON. Коэффициент Жаккарда был использован для построения матрицы генетической схожести.

Результаты исследований

Для исследования генетической изменчивости среди видов лука на данном этапе было отобрано пять ISSR праймеров из пятнадцати протестированных.

Среднее количество продуктов амплификации, приходящихся на 1 праймер, составляло 10,5. Фрагменты были представлены большим спектром длины от 350 до 2000 н.п. 53 ISSR локуса были получены в результате амплификации, из которых 40 были полиморфными, т.е. с использованием пяти ISSR праймеров ((ggat)4, (ag)8yt, (ca)8rg, (ca)8rc, (ga)8yt) удалось выявить 76 % полиморфизма среди представленных видов лука. Обнаруживалось сходство в спектрах у одинаковых видов разной репродукции, однако наблюдались отличия в отдельных спектрах между образцами A. odorum. Все три представителя вида A. altaicum оказались генетически сходными между собой (рис. 1.)

В то же время, было выявлено генетическое родство между видами A. altaicum и A. fistulosum , что подтверждалось другими работами по молекулярной систематике. Как известно, A.altissimum генетически близок к А.schoenoprasum, что также подтвердилось в нашем исследовании с использованием ISSR маркеров. Внешнее сходство A. subhirsutum и A. nutans подтверждалось в наших исследованиях их генетической близостью, однако по данным других авторов, эти два вида лука достаточно далеки друг от друга (Klaas, Friesen, 2002). Чем больше генетическая дистанция между исследуемыми видами, тем меньше у них общих продуктов амплификации. Поэтому, в спектрах геномной ДНК некоторых видов лука можно было определить специфичные продукты амплификации, так, например, у вида A. schoenoprasum с праймером (ag) 8 yt были обнаружены фрагменты 540 и 590 н.п.; у вида A.altissi-mum специфический фрагмент массой 460 н.п., ампли-фицировавшийся с тем же праймером. Выявленные ампликоны, присущие только одному конкретному виду лука, при сравнении с другими видами могут оказаться видоспецифичными.

Маркеры, позволяющие выявлять генетические отличия между различными видами луков, были использованы далее при оценке гибридных комбинаций.

В дендрограмме (рис.2) обращает на себя внимание кластер с формами, полученными в процессе гибридизации и последующим беккроссировани-ем (F5) А.сера и A. fistulosum 92/2 и 92/3, и форма, полученная в результате апомиксиса A0 BC2 F5, все эти генотипы совместно с A.cepa, выступающим как материнская форма, сгруппировались вместе, т.е. были генетически сходными.

Гибриды между A. nutans и A.cepa располагались ближе к кластеру A.cepa . А вид A. nutans , который выступал в качестве отцовской линии, имел коэффициент схожести с кластером A.cepa и гибридной формой 0,52 и 0,49 соответственно.

В данном исследовании было показано, что молекулярные маркеры, полученные на основе полиморфизма меж-микросателлитных локусов, могут быть потенциально использованы для оценки селекционного материала лука, используемого для межвидовых скрещиваний. Универсальность этой техники дает возможность проверять достаточно большое количество комбинаций скрещиваний и форм, полученных в результате беккроссирования.

A.auctum А.сера Fl 92/2 F1.92/3 -

A.apomictei -A.vavilovll -

A.prollferum -

F1A-cepa, A.nutani FIA-cepa, A-nutans -A.nipestre A.altalcum -

A-fistuloeum -A-nutans

A-schoenoprasum A.roy1el