Полиморфизм микросателлитных локусов у сортов черной смородины ( Ribes nigrum L.) из коллекции ВНИИСПК

На долю черной смородины в России приходится половина площадей, занятых под ягодниками (1). На 2013 год в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию, вошло 170 сортов этой важнейшей ягодной культуры (2). Совершенствованием ее сортимента в России занимается около 20 научных учреждений. Селекционные исследования направлены на улучшение биохимического состава ягод, создание продуктивных стабильно плодоносящих сортов, устойчивых к болезням и вредителям, пригодных к механизированной уборке урожая и др. (1). Во Всероссийском НИИ селекции плодовых культур (ВНИИСПК) к настоящему времени в государственное сортоиспытание переданы 26 сортов, из них 12 включены в Государственный реестр сортов, до- пущенных к использованию. Собрана обширная коллекция сортообраз-цов, включающая более 100 интродуцированных сортов и более 700 форм собственной селекции.

Успех селекционных исследований во многом зависит от изучения, подбора и систематизации исходного материала (3). Черная смородина имеет диплоидный набор хромосом ( n = 7), что в определенной степени облегчает изучение ее генома по сравнению с геномами полиплоидных видов. Пионерами в использовании ДНК-маркеров для анализа генетического полиморфизма при работе с генетическими ресурсами черной смородины и других представителей рода Ribes L. стали ученые из Шотландского института селекции сельскохозяйственных культур (Scottish Crop Research Institute, Invergowrie, Dundee, Scotland, Великобритания), применившие RAPD (random amplified polymorphic DNA), AFLP (amplified fragment length polymorphism), ISSR (inter-simple sequence repeat), SNP (single nucleotide polymorphism) и другие маркеры (4, 5). В результате на основании микросателлитных, SNP- и AFLP-маркеров впервые построена генетическая карта черной смородины (6), разработан и применяется метод маркер-опосредованного отбора генотипов, имеющих ген устойчивости к почковому клещу Се (7). В России ДНК-маркирование для оценки генетической коллекции представителей рода Ribes используется сравнительно недавно (8).

В настоящее время наблюдается тенденция к применению высоковоспроизводимых кодоминантных SSR- и SNP-маркеров. SSR (микро-сателлитные) маркеры используются как в фундаментальных исследованиях для оценки генетического полиморфизма, изучения филогенетических отношений, построения генетических карт для групп сцепления, так и в прикладных целях — для проверки родословных, при разработке систем идентификации и паспортизации, поиске маркеров, ассоциированных с хозяйственно полезными признаками, при маркер-опосредованном отборе интересующих генотипов на ранних стадиях развития растений (9). SSR-маркеры применялись для оценки разнообразия генетических коллекций Ribes в Италии и Северной Европе (10, 11).

Мы впервые использовали микросателлитные маркеры для оценки межсортового полиморфизма, определения генетического сходства между сортообразцами, проверки родословных у форм черной смородины из российской коллекции ВНИИСПК, что позволило обсуждать перспективы применения полиморфизма микросателлитных локусов в работе с генетическими ресурсами этой ягодной культуры.

Цель представляемой работы заключалась в изучении полиморфизма микросателлитных локусов у сортов черной смородины из коллекции ВНИИСПК.

Методика. Объектом исследования были 27 сортов черной смородины из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур, в том числе 16 сортов селекции ВНИИСПК — Ажурная, Грация, Гамма, Дачница, Орловский вальс, Монисто, Орловия, Искушение, Чудное мгновение, Очарование, Сластена, Черная вуаль, Экзотика, Блакестон, Зуша, Кипиа-на, а также сорта других оригинаторов — Оджебин, Титания, Шаровидная, Селеченская, Минай Шмырев, Ртищевская, Консорт, Бинар, Говтва, Канахама, Ядреная. Кроме того, сорта Лентяй и Орловская серенада были проанализированы не по всем использованным локусам. Результаты, полученные по этим сортам, учитывались только при анализе соответствия распределения аллелей между родственными сортами и данных по родословным (распределение аллелей между родственными сортами сверяли по всем полиморфным локусам, для которых имелись такие данные).

ДНК выделяли из молодых листьев СТАВ-методом (12).

Всего нами были проанализированы 14 микросателлитных локусов — e1-O01, e1-O21, e3-B02, e4-D03, g1-B02, g1-E03, g1-K04, g1-M07, g2-B20, g2-H21, g2-J08, g2-L17, g2-G12, MS06g03 (13). ПЦР-анализ проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 1Х ПЦР буфер, 200 мкМ нуклеотидов, 2 мкМ прямого праймера, 2 мкМ обратного праймера, 0,3 ед. Taq ДНК-полимеразы и 10 нг ДНК, в термоциклере GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США). Реакцию амплификации осуществляли в следующем режиме: предварительная денатурация — 5 мин при 94 °С; денатурация — 30 с при 94 °С, отжиг праймера (при температуре, подобранной для каждого маркера, см. раздел «Результаты»), синтез ДНК — 30 с при 72 °С (всего 35 циклов); завершающая элонгация — 10 мин при 72 °С.

При анализе полиморфизма микросателлитных локусов использовали электрофоретическое разделение амплификатов в 6 % денатурирующем полиакриламидном геле (ПААТ) в камере Sequi-Gen GT System (38x50 см) («Bio-Rad», США) с последующим окрашиванием нитратом серебра (14). Размеры фрагментов определяли, сравнивая с маркером молекулярных масс 10 bp DNA Ladder («Invitrogen™», США).

Частоту аллеля рассчитывали как сумму частот гомозиготного генотипа и полусумму частот гетерозиготных генотипов, содержащих этот аллель (15). Ожидаемую гетерозиготность вычисляли как H_e = 1 - p i² , где p i — частота i -го аллеля. Для оценки наблюдаемой гетерозиготности (H_o) в соответствующем локусе число гетерозиготных образцов делили на общее число образцов. Редким считали аллель с частотой 0,2 и менее. При определении частоты аллеля, вероятности идентичности в соответствии с законом Харди-Вайберга HW P(ID) и вероятности идентичности при анализе сибсов Sib P(ID) использовали программу GENECAP (16). Частоту ноль-аллеля (r) вычисляли по формуле r = (H_e - H_H . )/(1 + H_о . ). Расчет коэффициентов сходства Жаккара (Jaccard similarity coefficient) (17) и построение дендрограммы осуществляли с помощью программы PAST (18). Дендрограмму строили методом кластерного анализа UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) (19) с использованием коэффициента Жаккара, число репликаций — 1000.

Результаты . При анализе 14 микросателлитных локусов (табл. 1) у 27 сортообразцов смородины были выявлены имеющие от 1 (MS06g03) до 8 (e4-D03) аллелей, что в среднем составило 4,9 аллеля на локус. При этом все локусы, кроме MS06g03, оказались полиморфными.

Для всех локусов, кроме MS06g03, у черной смородины известно расположение на генетической карте групп сцепления (в частности, локусы, включенные в анализ, расположены в семи различных группах сцепления) (6). Праймеры для локуса MS06g03 были первоначально разработаны на основании сиквенса ДНК яблони и картированы в 10-й группе сцепления в семье от скрещивания сортов Фиеста x Дискавери, MS06g03 рассматривается как мультилокусный маркер — у яблони при его амплификации образуются фрагменты ДНК размером 154-190 п.н. (13), а у смородины у всех сортообразцов наблюдается фрагмент длиной 140 п.н. Вероятно, локус находится в весьма консервативной части генома смородины черной.

В большинстве случаев у каждого генотипа для конкретного локуса было выявлено не более двух фрагментов, но в некоторых локусах у ряда образцов амплифицировались три фрагмента (у сорта Ядреная — в локусе g2-B20, Селеченская — e1-O01, у сортообразцов Гамма, Грация, Орловия, Черная вуаль, Шаровидная, Зуша, Кипиана — в e3-B02). В литературе есть сообщения об амплификации более чем двух аллелей в некоторых микросателлитных локусах у диплоидных форм, что связано с дупликацией микросателлитных локусов на одной и той же или на разных хромосомах (20).

• 1.    Обозначения и режимы амплификации микросателлитных локусов, по которым были проанализированы сортообразцы черной смородины ( Ribes nigrum L.) из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур

• 2.    Характеристика 13 полиморфных микросателлитных локусов, выявленных у

• 27 сортообразцов черной смородины (Ribes nigrum L.) из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур

Локус Группа сцепленияа Прямой праймер Обратный праймер Т, °C e1-O01 6 CCT TTC CAG AGA AAA CTC AAA CA AAG TAT GGG AAC AAC GGC AG 52 e1-O21 4 TCT CTC CAA CTG AGA AGG AAA A GAT TTG TTC TTG TGC AGC GA 50 e3-B02 5 AAG ACG AAG ACG ACG ACG AT CTG ATC TTT GCC GAA TGG TT 52 e4-D03 3 CCC AAA AGC AAA TIT AGG GT GTG AGG CAT GGA ACC ACT TT 56 g1-B02 2 CGA CTT CAT CGC TCT CCT CT CCA TTG ATT TGG TGA GGG T 50 g1-E03 1 TAA CTG CGG GGT TCC TAC AG CCA CCG CTA CCA ATA ACC AT 56 g1-K04 1 TGT TCC CTG TTT CCT TCA AAA GGA CGT GGA CGA TGA GAG TT 52 g1-M07 1 TCC CGT TAC TGG AGT GGT GT CCA TGG TTT TCC GAT TTG TT 52 g2-B20 3 CTC CAT CAA ATC CCT CGT TT TCT TGC TTC CCA AAC AGT ATC A 52 g2-H21 4 TGC CCT ITT TGG TCA 111' TC CAA TCG TCG ATG AAG GTC TG 50 g2-J08 2 CGC CGA GCT CTA ATC ACT GT ATA GCC CAT GCC CAT ATT CA 54 g2-L17 4 TTT GGA AAA CCT CCC CTT TT GAG CTG TTG CTG TTG CCA TA 50 g2-G12 7 GTG ACC CAC CTA AAC CGT CC GGA GTG GAG GGT TGG AAA AT 52 MS06g03 б CGG AGG GTG TGC CGA AG GCC CAG CCC ATA TCT GCT 52 Приме ч а н и е. Т — температура отжига; а — на генетической карте Ribes nigrum (6), б — локус у чер- ной смородины не картирован.

На основе микросателлитных профилей у 27 сортообразцов мы проанализировали распределение аллелей для 13 из использованных полиморфных локусов (табл. 2).

Локус |	n	1	Размер		аллеля	, п.н. (	частота)			1 Не |	| Н о	r	1 а, Б
e1-O01	6	138а	140аб	142	145а	147	149а			0,737	0,769	- 0,019	0,402,
		(0,093)	(0,023)	(0,419)	(0,163)	(0,209)	(0,093)						0,101
e1-O21	3	288 аб	292	294						0,423	0,407	0,011	0,639,
		(0,029)	(0,714)	(0,257)									0,402
e3-B02	4	188	191	193а	194а					0,655	0,800	- 0,088	0,467,
		(0,486)	(0,257)	(0,200)	(0,057)								0,177
e4-D03	8	197а	201а	205а	207аб	210а	212а	217а	224а	0,840	1,000	- 0,087	0,342,
		(0,180)	(0,100)	(0,160)	(0,020)	(0,200)	(0,200)	(0,100)	(0,040)				0,046
g1-B02	3	203	205	207						0,610	0,590	0,016	0,495,
		(0,231)	(0,513)	(0,256)									0,216
g1-E03	7	232аб	235	237	239а	245а	249аб	270а		0,726	0,593	0,077	0,416,
		(0,025)	(0,400)	(0,275)	(0,175)	(0,075)	(0,025)	(0,025)					0,118
g1-K04	4	285аб	290	295	298а					0,560	0,556	0,003	0,530,
		(0,026)	(0,605)	(0,237)	(0,132)								0,250
g1-M07	7	200а	204а	207а	209	212а	217а	222 аб		0,739	0,704	0,020	0,405,
		(0,140)	(0,140)	(0,047)	(0,442)	(0,140)	(0,070)	(0,023)					0,097
g2-B20	5	147а	168а	178	181а	185а				0,720	0,556	0,096	0,420,
		0,189	0,135	0,432	0,189	0,054							0,119
g2-H21	3	265а	267	273а						0,361	0,259	0,075	0,680,
		(0,156)	(0,781)	(0,063)									0,443
g2-J08	4	158а	160	162а	164а					0,514	0,444	0,046	0,562,
		0,083	0,667	0,167	0,083								0,274
g2-L17	6	150а	152а	154а	161	168а	171а			0,580	0,296	0,180	0,510,
		(0,063)	(0,063)	(0,094)	(0,625)	(0,094)	(0,063)						0,200
g2-G12	7	190аб	195а	203а	207а	209а	212	215		0,997	0,926	0,035	0,355,
		(0,022)	(0,178)	(0,089)	(0,089)	(0,156)	(0,244)	(0,222)					0,058
Средн<	ее									0,652	0,608		0,192,
													0,479

Примечание. А — Sib P(ID) (вероятность идентичности при анализе сибсов), Б — HW P(ID) (вероятность идентичности в соответствии с законом Харди-Вайберга); n — число аллелей, а — редкие аллели, б — уникальные аллели, амплифицируемые у одного сортообразца из 27 изученных.

Ожидаемая гетерозиготность варьировала от 0,361 в локусе g2-H21

до 0,997 в локусе g2-G12 (в среднем 0,652), в то время как наблюдаемая гетерозиготность — от 0,259 в локусе g2-H21 до 1 в локусе e4-D03 (в среднем 0,608). Таким образом, средние значения для наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности не сильно различались, что обусловлено природой изучаемого объекта. Как известно, перекрестноопыляемые растения, к которым относится черная смородина, характеризуются большей гетерозиготностью по сравнению с самоопыляемыми (15). К тому же вегетативное размножение плодово-ягодных культур позволяет закрепить гетерозиготное состояние генотипа независимо от того, насколько стабильным будет проявление признаков в первом поколении. Поэтому к отличительным особенностям таких культур относится высокая гетерозиготность, которую только усиливает использование метода отдаленной гибридизации и при влечение различных видов в селекцию.

3. Сортоспецифичные фрагменты, амплифи-цируемые в микросателлитных локусах у черной смородины ( Ribes nigrum L.) из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур

Сортообразец	| Локус/размер фрагмента
Орловия	g1-K04/285 п.н., g1-E03/232 п.н.
Оджебин	g1-M07/222 п.н.
Монисто	e4-D03/207 п.н.
Минай Шмырев	e1-O21/288 п.н.
Бинар	e1-O01/140 п.н.
Титания	g1-E03/249 п.н.
Шаровидная	g2-G12/190 п.н.

В трех локусах (e1-O01, e3-B02 и e4-D03) наблюдаемая гетерозиготность превысила ожидаемую. В остальных девяти локусах, наоборот, ожидаемая гетерозиготность была выше наблюдаемой, что указывает на наличие гомозиготных генотипов или присутствие неампли-фицируемого ноль-аллеля. Теоретическая частота ноль-аллеля оказалась положительным зна чением для всех локусов, кроме e1-O01, e3-B02, e4-D03, и варьировала от -0,088 до 0,180.

Вероятность идентичности двух генотипов HW P(ID) варьировала от 0,046 по локусу e4-D03 до 0,443 по локусу g2-H21 (в среднем 0,203), вероятность идентичности двух сибсов Sib P(ID) — от 0,342 по локусу e4-D03 до 0,680 по локусу g2-H21 (в среднем 0,489).

Из 68 фрагментов, амплифицированных в 14 локусах, 45 (66 %) соответствовали редким аллелями с частотой, равной или менее 0,2. Также были обнаружены восемь уникальных фрагментов, амплифицированных только на ДНК одного из протестированных сортообразцов (табл. 3).

По сочетанию аллелей в локусе можно было различить от 3 (g2-H21, e1-O21) до 15 (g2-G12) генотипов. Например, в локусе g1-K04, в котором амплифицируется 4 аллеля, наблюдались пять сочетаний аллелей (генотипов), при этом сорт Орловия имел уникальный аллель размером приблизительно 285 п.н. (рис. 1).

Минимальный набор из четырех локусов (e4-D03, g1-M07, g1-E03, g2-B20) позволил различить все протестированные сортообразцы, то есть для каждого образца был получен уникальный мультилокусный профиль.

На основе SSR-спектров мы построили дендрограмму сходства для 27 сортообразцов черной смородины (рис. 2). Полученные коэффициенты попарного генетического сходства варьировали от 0,11 (между сортами Оджебин и Шаровидная) до 0,95 (между сортами Говтва и Ртищевская) и в среднем составили 0,346.

В дендрограмме выделились несколько кластеров с высокой бутст-реп-поддержкой (БП). На близком генетическом расстоянии вместе кластеризовались сорта Говтва и Ртищевская (БП 100 %) на несколько большем генетическом расстоянии объединились сорта Чудное мгновение и Экзотика (БП 60 %), у которых материнские формы — это сеянцы из од- ной семьи; к ним примкнул сорт Кипиана (БП 90 %), для которого отцовской формой служил сорт Экзотика. Сорта Гамма и Грация, полученные отбором из той же гибридной семьи, что и сорт Кипиана, кластеризовались отдельно от сортов Экзотика и Кипиана. По данным RAPD-анализа, также наблюдалась кластеризация сортов Гамма и Грация с высоким значением БП, в то время как сорт Кипиана в этот кластер не вошел (8). Вероятно, подобное свидетельствует о том, что сорта Гамма и Грация генетически более сходны друг с другом, чем с сортами Кипиана и Экзотика. Отдельный кластер также сформировали выведенные в Швеции сорта Титания и Оджебин (БП 66 %), имеющие в родословной скандинавский подвид смородины черной.

Рис. 1. Электрофореграмма фрагментов амплификации микросателлитного локуса g1-K04 у 27 изученных сортообразцов черной смородины ( Ribes nigrum L.) из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур: 1-5 — условные генотипы по локусу; M — маркер молекулярных масс (10 bp DNA Ladder, «Invitrogen™», США; справа указаны размеры фрагментов).

Анализ потока аллелей через родословные родственных проанализированных сортов показал, что в большинстве случаев распределение аллелей между ними не противоречило родословным. Так, родительский сорт Лентяй и его производные в первом поколении (сорта Ажурная, Орловский вальс, Сластена) имели хотя бы один общий аллель по всем протестированным микросателлитным локусам. То же происходило с сортом Минай Шмырев и с сортами, полученными от него в первом поколении (Зуша, Лентяй, Орловская серенада), а также с сортом Экзотика и потомками этого сорта в первом поколении (сорта Кипиана, Гамма, Грация). Однако у сорта Очарование, для которого по родословной сорт Экзотика служил отцовской формой, в трех локусах (e4-D03, g1-E03, g2-B20) не было общих с ним аллелей. Возможно, что в действительности произошло опыление другой пыльцой, нельзя исключить и ошибку при размножении и пересадке, а также мутации в этих локусах. Сорта Оджебин и Бинар (получен от скрещивания сортов Оджебин х Нарядная) не имели общих аллелей в двух микросателлитных локусах (g1-M07, g1-E03).

При генотипировании микросателлитных локусов у коллекционных сортов черной смородины из Северной Европы в ряде случаев не удалось подтвердить генетическую идентичность одноименных образцов из разных коллекций, например один из 10 сортообразцов сорта Оджебин оказался не идентичен остальным (11). В работе S. Reim с соавт. 11 микросателлитных локусов были использованы при уточнении происхождения у сортов, выведенных в Dresden-Pillnitz (21). В результате в ряде случаев вы- яснили, какой именно сорт участвовал в гибридизации при опылении смесью пыльцы разных сортов, а для некоторых сортов установлена недостоверность родословных как по материнской, так и по отцовской форме.

Титания

Оджебин Говтва Ртищевская Сластена Орловия Черная вуаль Ажурная Дачница Минай Шмырсв Зуша Ядреная Г рация Гамма

Чудное мгновение Экзотика Кипиана Орловский вальс Бинар Консорт Очарование Монисто Блаксстон Канахама Искушение Селеченская Шаровидная

Рис. 2. Дендрограмма сходства 27 сортообразцов черной смородины ( Ribes nigrum L.) из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур, построенная на основании анализа полиморфизма 13 микросателлитных локусов (приведены значения бутстреп-поддержки).

Итак, нами впервые в России проведено генотипирование микросателлитных локусов у черной смородины ( Ribes nigrum L.). Установлен высокий полиморфизм микросателлитных локусов, выявлены редкие и уникальные аллели, что позволило получить уникальный мультилокусный профиль для каждого протестированного образца. Показана возможность проверки родства образцов на основе анализа распределения микросателлитных аллелей. Полученные данные свидетельствуют о перспективности применения протестированных маркеров при оценке генетического разнообразия отечественного генофонда черной смородины, а также при разработке методов идентификации и паспортизации сортов, что может быть использовано для защиты авторских прав селекционеров.