Полиморфизм по признакам, ассоциированным с генетической системой ЦМС-RF, у зернового сорго из коллекции ВИР

^∗ Для секвенирования в работе использовано оборудование ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» (ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Санкт-Петербург).

Первое упоминание о гетерозисных гибридах сорго относится к 1927 году (3, 4), однако создание коммерческих гибридов стало возможным лишь после открытия у кафрского сорго стабильно наследуемой цитоплазматической мужской стерильности А1 (milo) и источников восстановления фертильности пыльцы (5). Впоследствии были идентифицированы альтернативные типы ЦМС — А2-А6, 9Е (6), но из-за сложностей получения надежных источников генов восстановления фертильности, а также эпигенетической изменчивости признака в зависимости от условий среды (7-9) в селекционных программах пока используется лишь ЦМС А1 (10). Методом гибридологического анализа идентифицированы по меньшей мере два главных гена — Rf1 (11) и Rf2 (10), доминантные аллели которых отвечают за восстановление фертильности ЦМС А1-milo. Их проявление зависит от условий среды и действия генов-модификаторов. Полагают также, что в случае ЦМС А1 восстановление фертильности пыльцы контролируется доминантными аллелями главного и двух дуплицированных комплементарных генов, тогда как при ЦМС А2 и А3 оно детерминировано доминантными аллелями трех генов, взаимодействующих комплементарно (12). Обнаружены ген Rf5 и ряд модификаторов, восстанавливающие фертильность пыльцы ЦМС А1 и А2 (13). Восстановление фертильности при ЦМС А3 контролируется на гаметофитном уровне доминантными аллелями генов Rf3 и Rf4 (14), а на уровне спорофита объясняется парамутациями генов Rf (15). Молекулярные механизмы проявления признака ЦМС и восстановления фертильности у сорго изучены мало. Показано, что, как и у других растений, у сорго ЦМС обусловливают аберрантные гены митохондрий (16).

Большинство охарактеризованных к настоящему времени генов Rf (у петунии, кукурузы, риса, редиса) кодируют белки, которые содержат повторяющиеся мотивы из 35 аминокислотных остатков (PPR, pentatrico-peptide repeats) и регулируют согласованную работу ядра и митохондрий. PPR гены с функцией восстановления фертильности выделены в отдельное подсемейство RFL-PPR ( Restoration of Fertility Like-PPR ). Структурнофункциональное разнообразие PPR-RFL генов поддерживается за счет изменчивости PPR-мотивов, а также сложной кластерной организации локусов Rf в геноме (17-19).

У сорго на молекулярном уровне охарактеризован только один ген восстановления фертильности пыльцы — Rf1 (11). Установлено, что локус Rf1 находится в группе сцепления 08 и включает 4 открытых рамки считывания (ORF), которые кодируют Ca²⁺-АТФазу плазматической мембраны, циклин D-1, а также неизвестный митохондриальный белок, содержащий 13 PPR-мотивов и относящийся к Е-типу подсемейства PPR генов. В кодирующей последовательности, а также в 5 ′ - или 3 ′ -концевых фланкирующих районах доминантного и рецессивного аллелей гена-кандидата PPR13 выявлено 19 полиморфных сайтов. Ген PPR13 сорго по структуре PPR-мотивов существенно отличается от других представителей подсемейства PPR-RFL генов (19-21). Другой ген-кандидат ( Rf2 ) локализован на участке хромосомы SDI02 протяженностью 236219 п.н. Район включает 31 ORF, в том числе и один PPR ген, характеризующийся высокой степенью сходства с геном Rf1 риса (10). Полиморфизм нуклеотидных последовательностей доминантного и рецессивного аллелей локуса Rf2 до сих пор не изучен, что ограничивает возможности разработки специфичных молекулярных маркеров для их идентификации. Не идентифицированы и другие последовательности генома сорго, потенциально ассоциированные с признаком восстановления фертильности пыльцы.

Коллекция сорго ВИР насчитывает порядка 9 тыс. образцов. В со- ставе коллекции — стерильные линии с ЦМС А1 (milo), восстановители фертильности и закрепители стерильности. У сорго, как и у многих других растений, для оценки признака восстановления мужской фертильности наряду с показателями завязываемости семян при самоопылении используют данные цитологического анализа пыльцы гибридов F1 (8, 13, 22). Однако изменчивость этого признака, а также полиморфизм геномных последовательностей, потенциально ассоциированных с генетической системой ЦМС-Rf, у образцов коллекции ВИР не изучены.

В настоящей работе нами впервые показан значительный нуклеотидный полиморфизм в кодирующих последовательностях рецессивного и доминантного аллелей гена Rf2 (референсный фрагмент XM_002459403.1, хромосома SDI02), а также гена-кандидата RFL-PPR (референсный фрагмент XM_002458104.1), характеризующихся гомологией с геном Rf1 риса.

Цель выполненного исследования заключалась в выяснении характера изменчивости признаков, ассоциированных с генетической системой ЦМС- Rf у линий сорго, для чего изучили нуклеотидный полиморфизм генов-кандидатов, ассоциированных с генетической системой ЦМС- Rf , и сравнили образование пыльцы у фертильных форм и растений со стерильным цитоплазмоном типа А1 (milo).

Методика . Материалом служили образцы сорго из коллекции ВИР, различающиеся по способности к восстановлению фертильности пыльцы: полувосстановитель фертильности к-1362; линии-восстановители к-928 и к929; стерильные линии А-10598 и А-83 на основе ЦМС А1 (milo) и их фертильные аналоги В-10598 и В-83; устойчивые к обыкновенной злаковой тле ( Schizaphis graminum Rond.) сестринские линии F₈-F₁₂ BC₁-BC₂, выделенные из гибридов от скрещиваний стерильной линии (ЦМС А1) Низкорослое 81 (Н-81) с восстановителями к-928 и к-929; гибриды F₁ от скрещиваний стерильных и фертильных линий (23). Линии к-928 и к-929, которые выделены из образцов зернового сорго Джугара белая из Западного Китая, защищены различными аллелями генов устойчивости к S. graminum (24). Образец к-1362 (Джугара белая, Сирия) — донор устойчивости к S. grami-num и полувосстановитель фертильности. Стерильные линии зернового кафрского сорго А-10598 и А-83 и их фертильные аналоги В-10598 и В-83 поступили в коллекцию ВИР из Индии в 1980-х годах. Линии и гибриды выращивали на полях Кубанской опытной станции ВИР в 2014-2016 годах.

Для оценки фертильности пыльцы зрелые пыльники собирали рано утром в период массового цветения растений и фиксировали в 70 % этаноле. Долю фертильных пыльцевых зерен подсчитывалась по методике Нава-шина (цит. по 25) с изменениями на окрашенных ацетокармином глице-рин-желатиновых препаратах с использованием микроскопа Zeiss Axioplan 2 imaging («Carl Zeiss», Германия). На основании анализа не менее 30 полей зрения при увеличении ½20 рассчитывали процент полностью окрашенных (фертильных), слабо окрашенных и неокрашенных пыльцевых зерен (ПЗ), а также учитывали их диаметр, выравненность по диаметру и наличие деформированных ПЗ.

Фракции ДНК выделяли по протоколу, основанному на использовании СТАB-буфера (26). В результате биоинформационного поиска в базе данных GenBank NCBI (National Center for Biotechnological Information, США) были выявлены 11 последовательностей, обладающих гомологией с ядерными генами Rf и митохондриальными генами, ассоциированными с ЦМС сорго (27) и других видов растений. На основе четырех отобранных референсных последовательностей были сконструированы 8 пар специфичных праймеров, фланкирующих 954

полноразмерные и внутренние фрагменты (табл. 1). Фрагменты, синтезированные с помощью разработанных праймеров на ДНК генотипов, контрастных по проявлению признака фертильности пыльцы, очищали в 1 % агарозном геле и секвенировали на генетическом анализаторе ABI 3500xl («Applied Biosystems», США) в Выравнивание и анализ последовательностей выполнен в программе Mega 5.1 (28).

При статистической обработке данных о числе фертильных пыльцевых зерен рассчитывали средние ( M ) и ошибки средних (± m ).

Результаты . Для выяснения характера изменчивости нуклеотидных последовательностей гена Rf2 — одного из главных генов восстановления фертильности ЦМС А1, локализованного в 8-й хромосоме, изучили полиморфизм геномного фрагмента, амплифицированного с помощью праймеров (табл. 1), которые были сконструированы на основе геномной последовательности S. bicolor (образец XM_002459403.1), содержащей PPR-мотивы и самой близкой (10) к последовательности гена Rf1 риса Oryza sativa L., восстанавливающего фертильность ЦМС типа BTII (Boro II). Было выявлено сходство референсного фрагмента с несколькими фрагментами генома сорго (предположительно последовательностями гена Rf1 ) и предсказанными последовательностями генов восстановления фертильности из геномов могара Setaria italica (L.) P. Beauv. и кукурузы Zea mays L. Референсный фрагмент имел длину 951 п.н., секвенированный — 825 п.н. (позиции с 76-й по 901-ю). Длина транслированной in silico последовательности составила 275 а.о.

1. Праймеры, разработанные для амплификации гомологов генов восстановления фертильности у зернового сорго Sorghum bicolor L. Moench

Референсный фрагмент (длина)	Ген, белковый продукт	Праймер, нуклеотидная последовательность 5 ′→ 3 ′	Длина се-квениро-ванного фрагмента, п.н.	Позиции в референсной последователь-ности
XM_002458104.1 (2801 п.н.)	Не идентифицирован, PPR-белок	02458104fw1: CACCCAATTCTCCAGACCAT 02458104rev1: ACATCTGCCGGTACATAGCC 02458104fw2: GGCTATGTACCGGCAGATGT 02458104rev2: GATGGGATCAAATGGAATGG 104_inner_fw: TTGCTTGCATGGAGAAATTG 104_inner_rev: CTGCGAGATCACAGCAGTTG	818	301-1119
XM_002459403.1 (951 п.н.)	Rf2 , PPR-белок	2459403fw: CAGGGGCCAAATGTTGTTAC 2459403rev: CACAGTTTTATATTTTCCGTGAT-AGTG	825	76-901
AJ278689.1 (1324 п.н.)	atpA ,        AJ278689fw: AACTTTTACACGAATTTTCAAGTGG α -субъединицаAJ278689rev: TGACAGCAGCATAAATAACAACAA АТФ-синтазы AJ_inner_fw: TCCTATAGGCCGTGGTCAAC F0F1       AJ_inner_rev: CGTCTCCAGCTTGTGTTTCA		1183	60-1243
AB084898.1 (2159 п.н.)	ALDH2b , митохондриальная альде-гиддегидроге-наза	AB084898fw: TTCTGGTTTTGGCCCTACTG AB084898rev: CTCTTCTAACAAATGTTTTTTCAT- AAT AB_inner_fw: AACCATACGAATAAAGCCTTGC AB_inner_rev: CTCGCATTTGCCCTCTTAAT	738	858-1596

У линий-восстановителей к-928 и к-929, предположительно несущих доминантные аллели Rf2 , изученные последовательности различались шестью нуклеотидными заменами, тогда как при сравнении нуклеотидных последовательностей у стерильных линий А-10598 и А-83 (носители рецессивных аллелей) обнаружили 3 нуклеотидные замены. Референсная последовательность, источником которой была линия-закрепитель стерильности BT ½ 623 предполагаемого генотипа rf2rf2 , оказалась в большей степени схожа с последовательностями стерильных линий А-10598 и А-83 и отличалась от них соответственно двумя и четырьмя полиморфными позициями нуклеотидов. В то же время последовательности образцов к-928 и к

929 отличалась от последовательностей референсного фрагмента и стерильных линий 18 заменами нуклеотидов и семью заменами аминокислот (рис. 1). Известно, что полиморфизм кодирующих последовательностей генов Rf растений, в частности гена Rf1 сорго, связан с их функциональным состоянием (11, 18). Можно предположить, что полиморфные последовательности, идентифицированные у линий ЦМС и восстановителей

ХМ_002459403

A-10598

S еtaria_i tali с a_Rf1

Zеа^шауs_Rf1

80        90       100      110 ,   120 (   130 , 140       150 (   160170

76 CGCGCAGAAGCTAGAGAGATCTTTAATTCTATGATTCAGAGTGGTCAAAAACCCAATGCCGCCACTTATCGAAGTCTGCTTCATGGGTATGCTACCGAAG 175

76 .........................................C...........................G 175

76 .A. ,.............................. .......C..................T........G.C 175

76  -A...............................  C..................T........G.C   175

XM_002459403

A-10598

Setaria italica Rfl

Zea mays Rfl

XM002459403

Setaria_italica_Rfl

ZeamaysRfl

180      190      200 . 210 . 220 , 230 , 240 . 250 . 260 . 270

176 GCAATCTTGTTGATATGAACAATGTCAAAGATCTAATGGTACAAAATGGAATGCGACCTGACCGTCATGTCTT-CAACATAGAAATCTATGCATACTGTA 274

176 . ...............  -  274

280 , 290      300 , 310 , 320 , 330   , 340 ,   350 , 360 , 370

275 AATGTGGAAGGCTAGATGAGGCAAGCCTTACTTTTAACAAAATGCAGCAGCTAGGATTCATGCCAGACATAGTCACCTACACCACGGTTATAGATGGGCT 374 275 ....           374

275 ............................  . .......................................................A. . . . . 374

XM_002459403

A-1059®

Setaria_italica_Rf1

Zea mays Rfl

380      390      400      410      420 , 430 . 440      450 . 460 , 470

375 TTGCAAGATAGGCCSGCTGGACGATGCAATGTCCCGATTCTGTCAGATGATTGATGATGGATTGTCTCCCAATATCATAACATTTACGACCCTGATTCAT 474

375 .............................................................................................A...... 474

375 ......................................................................................A......A...... 474

XM002459403

A-10598

setaria_italica_Rfl zea_mays_R£l

480      490      500      510      520 .   530 . 540      550 . 560 .570 .

475 GGGTTTTCTATGTATGGCAAATGGGAGAAGGCTGAGGAACTATTTTATGAGATGATGGATAGAGGCATTCCTCCTAATGTCAATACGTTCAATTCAATGA 574

475 .........T             574

475 ..................        ..G......C. .TC. . . .. .G. ..... 574

475 ............C..........................T........................... G......C. .TC......G 574

XM_002459403

A-10598

Setaria_italica_Rfl

Zea_mays_Rf1

580 . 590 , 600 , 610 , 620 , 630 _ 640      650 , 660670 .

575 TAGATAGGCTATTCAAAGAAGGAAAGGTTACGGAGGCCCGAAAACTCTTTGATTTGATGCCACGTGCAGGAGCTAAACCTAATGTTGTTTCTTATAATAC 674 575 ....................A 674

575 ....C 674

680       690      700      710       720 . 730 . 740 . 750 . 760 . 770 .

XM_002459403

A-10598

Setaria_italica_Rfl zea_maya_Rfl

XMQ02459403

A-10598

Setaria_italiaa_Rfl

Zea_may s_Rf1

675 AATGATTCATGGGTATTTCATAGCTGGTGAAGTGGGCGAAGTGATGAAGCTCCTTGATGATATGCTCTTGATTGGCTTGAAACCCAATGCTGTTAACCTT 774

675 .................            .TC.T. . 774

780 , 790 , 800       810 , 820 , 830 . 840 , 850 , 860 . 87O .

775 AATACTTTACTTGATGGCATGCTCTCTATTGGCTTGAAACCAAA---TGTTGACACATGTAAGACTTTGATTGATAGCTGCTGTGAAGATGACAGGATAG 871

775 ............................................—..............  G 871

775 .............................G..............  G 871

XM_002459403

Setaria_italica_Rfl

Zea mays Rfl

880     890900

872 AGGATATATTAACTCTGTTCCGAGAAATGT 901 872  901

872  901

872  901

872  901

868 -C.C..A..—G. . G. AG. TA. . AGGC. AC 895

874 -T.C..A.C--GTCA . AA. TA. . AG. C . AC 901

Рис. 1. Элайнмент нуклеотидных последовательностей гена-кандидата Rf2 у линий зернового сорго ( Sorghum bicolor L. Moench) из мировой коллекции ВИР: к-928 и к-929 — носители доминантного аллеля, А-10598 и А-83 — носители рецессивного аллеля; XM_002459403 — референсный фрагмент. Для сравнения приведены гомологичные фрагменты генов Rf Setaria ital-ica и Zea mays.

	310        320        330        340        350        360        370
ХМ_002458104.1 А-ВЗ к-929 Zea mays ХМ_008677263.2	301 GGCGTCGCCGATGACCTCGCTTCCTCCCTCCGCGCACTCCTCGCATCCTCGCCCGACGGCCCGCACGCCT 370 301 ...................................................................... 370 301 . . . .ATCG...........................................................  .. 370 301  ............................................С.........АС..Т..А........ 370 380       390       400       410       420       430       440
ХМ_002458104.1 А-83 к-929 Zea mays ХМ_008677263.2	371 TCCACCTGCTACGTTCCGCTGCGCTGGATACGCGCCTCCCGCCGAACGAGCTCGTCGACGCCGTCCTCTC 4 40 371 ...................................................................... 440 371 ..............................................................   440 371 ....Т.....С........................................................... 440 450       460       470       480       490       500       510
ХМ_002458104.1 А-83 к-92 9 Zea mays ХМ_008677263.2	441 CGTCGCAGACGCTGGCTCGCCGGCCGCGGCCACGCTCCTCAGTCACGTCCTCACCTGCCTCTCCAGCGCC 510 441 ..................................   510 441 ...................................................................... 510 441 .AC..TG......................ТТ..Т........С.....................С....Т510 520        530        540        550        560        570        580
ХМ_002458104.1 А-83 к-929 Zea mays ХМ_008677263.2	511 GCCCGCGACTGCGCGGCCGCCGTGGCCGCATACTCTCGCATGGTCACGAGGGGCGTTGTCCCGGACGCCA 580 511 ...................................................................... 580 511 . *...........................................   580 511  ...А..................С............................................... 580 590       600       610       620       630       640       650
ХМ_002458104.1 А-83 к-929 Zea mays ХМ008677263.2	581 AATCTCGCACCGACCTGCTCGTCGCCACGGCACGGGGCGCATCGGCTGCGGATGCGCTCACGCTGTTCGA 650 581 . ..................................................................... 650 581 ...................................................................... 650 581 .G.................А. . .А.......G........G.................А........... 650 660       670       680       690       700       710        720
ХМ_002458104.1 А-83 к-929 Zea mays ХМ_008677263.2	651 CGAGATGCGGTGCAAGGGGTACTACGCGGATGCTAAGATGTACGACGTCGTGATGCGGGCCTGCGTCGTG 720 651 ............   720 651 . ..................................................................... 720 651 ..........G.......A.G............G....................А............AG. 720 730        740        750        760        770        780        790
ХМ_002458104.1 А-83 к-929 Zea mays ХМ_008677263.2	721 GGACGGATGCACGGTGACGCCGTCAGGCTGTTCGACGAAATGGCCGGTGCCGGAGTCAAGCCTGACGAGC 790 721 ...................................................................... 790 721 ...................................................................... 790 721  ...G........Т. . . .Т..............Т..Т........Т........G........С....... 790 800       810       820       830       840       850       860
ХМ_002458104.1 А-83 к-929 Zea mays ХМ_008677263.2	791 GCGTTTATGCCATCACAATCACAGGTTTGTGCAAGCTACGCGATGCAGACCGGGCAGTCCAGGTGCTGGG В 6 0 791 . ..................................................................... 860 791 ...................................................................... 860 791 ................... .Т.............    . . ,Т......С........Т. . . . 860 870       880       890       900       910       920       930
ХМ_002458104.1 А-83 к-929 Zea mays ХМ_008577263.2	861 GAAGATGAGGGAGGCAGGGTTGAAGCCACGGGATTTTACCTACAATTCTGTGGTGGATGTGCTTGTGAAG 930 861   ..........   930 861   .................................................................... 930 861   .....................CG. . . .GT. . . .G. .A. .G. . . .G......................... 930 940        950        960        970        980       990        1000
ХМ002458104.1 А-83 к-929 Zea mays ХМ_008677263.2	931 GTGGGGAGGATGGATGAGGCATTGGGGGTGAAGGATCAGATGCTGCTGGCCACGGGGAAGAAGATGGATG 100 931 ...................................................................... 100 931 ...........................................................А.......... 100 931 ........................А.........................Т.....А............. 100 1010       1020       1030       1040       1050       1060       1070
ХМ_002458104.1 А-83 к-929 Zea mays ХМ 008677263,2	1001 TGTTTCTCGCGACGACGTTGATGCAGGGATATTGCTTGCATGGAGAAATTGGGAAAGCATTAGATTTGTT 107 1001 . ..................................................................... 107 1001 ...................................................Т..........А....... 107 1001 ..G............Т.........C..G..................G.......G.....G........ 107 1080       1090       1100       1110
ХМ_002458104.1 А-83 к-929 Zea mays ХМ 008677263.2	1071 TGATGAGGCTGTCAGGGATGGTGTGACACCGACCAATGTGACATAT-AC 1118 1071 .............................................-.. 1118 1071 . ...A.A.G......АА.....Т.......АС.ТОТ.........А-.Т 1118 1071 ........Т......Т..............................-GG 1118

Рис. 2. Элайнмент нуклеотидных последовательностей локуса, кодирующего митохондриальный PPR белок, у линий зернового сорго ( Sorghum bicolor L. Moench) из мировой коллекции ВИР: к-929 — восстановитель фертильности, А-83 — стерильная линия; XM_002458104.1 — референсный фрагмент. Для сравнения приведена гомологичная последовательность Zea mays .

фертильности, представляют разные аллельные варианты гена Rf2, продукты которого участвуют в редактировании митохондриальных РНК. У носителей доминантного аллеля Rf2 в последовательностях выявлено 6 PPR- повторов, у носителей рецессивного — 5. В целом полиморфизм нуклеотидных последовательностей локуса Rf2 у носителей доминантного и рецессивного аллелей оказался довольно высоким (2,2 % полиморфных сайтов).

С использованием трех пар праймеров (см. табл. 1, рис. 2) изучили полиморфизм локализованного в 3-й хромосоме геномного фрагмента XM_002458104.1 длиной 2801 п.н., содержащего 17 PPR-повторов и наиболее близкого ядерному гену Rfo редиса Raphanus sativus (L.) Domin., восстанавливающему фертильность ЦМС Ogura (29), а также гену Rf1 риса O. sati-va Japonica Group. Последовательности референсного фрагмента и секве-нированного фрагмента ДНК линии А-83, длина которого составляла 818 п.н., оказались идентичными, но значительно отличались от последовательности секвенированного фрагмента ДНК у восстановителя фертильности к-929, при сравнении которых было выявлено 17 полиморфных сайтов и 8 аминокислотных замен (см. рис. 2). Наиболее высокой степенью сходства с идентифицированным фрагментом (90 % идентичных позиций нуклеотидов) характеризовалась последовательность образца XM_008677263.2 из базы данных NCBI (PPR белок Zea mays ).

Один из генов восстановления фертильности кукурузы ( Rf2 ) ЦМС Т-типа кодирует альдегиддегидрогеназу (АлДГ) — фермент, катализирующий окисление альдегидов. Известно, что АлДГ участвует в детоксикации ацетальдегида, продуцируемого во время развития пыльцы, может быть вовлечена в энергетический метаболизм клеток, особенно на стадии развития пыльников и, возможно, взаимодействует с митохондриальным белком URF13, связанным с ЦМС Т-типа у кукурузы (30, 31). Полагают, что механизм действия контролируемой геном Rf2 АлДГ как восстановителя фертильности обусловлен наличием на поверхности фермента туннельных полостей, посредством которых белок связывается с длинноцепочечными лигандами разной длины и/или с потенциально вредными, токсичными для развития пыльцы молекулами — продуктами экспрессии митохондриальных ЦМС-генов (32).

Чтобы проверить гипотезу о возможном участии гена альдегиддегидрогеназы сорго в контроле восстановления фертильности пыльцы, на основе последовательности мРНК ALDH2b S. bicolor (образец AB084898.1), представленной в базе NCBI, мы сконструировали праймеры для амплификации кодирующей последовательности фермента. Последовательность участка гена ALDH2b (позиции 858-1596-я), представляющего один из генов подсемейства 2 обширного суперсемейства АлДГ у высших растений, оказалась гомологичной последовательностям АлДГ других видов злаков, в том числе кукурузы (94 % идентичных аминокислотных остатков). В то же время по нуклеотидным последовательностям этого фрагмента мы не выявили различий между восстановителями фертильности и линиями ЦМС. Необходимо отметить, что для линии А-83 нам удалось определить последовательность протяженного участка гена ALDH2b длиной 2055 п.н., однако у секвенированного и референсного фрагментов N-концевые области существенно различались. Это можно объяснить как значительной вариабельностью остатков в указанной части молекулы (32), так и тем, что продукт амплификации включал интрон или интроны, информация о которых для генов АлДГ сорго и кукурузы пока отсутствует.

Известно, что во многих митохондриальных локусах, ассоциированных с ЦМС, обнаружены промоторные районы генов АТФ-синтазы либо части этих генов. Так, ассоциированный с ЦМС Т-типа ген urf13-T кукурузы содержит 59 нуклеотидов из регуляторной области гена atp6. Сцепленный с ним и котранскрибируемый ген orf221 был идентифициро-958

ван как часть гена, кодирующего одну из субъединиц компонента F0 АТФ-синтазы F0F1 (16). В качестве референсной последовательности для анализа участка митохондриального генома S. bicolor , потенциально ассоциированного с ЦМС А1, мы использовали последовательность гена atpA , кодирующего α -субъединицу АТФ-синтазы F0F1 линии CS3541 — восстановителя фертильности ЦМС А1 (AJ278689.1 из базы NCBI). Выравненные фрагменты имели длину 1183 п.н. и были идентичны у форм со стерильным (А-83) и фертильным (к-929) типами цитоплазмона. Продукты трансляции этих последовательностей у линии ЦМС и линии-восстановителя, а также референсной последовательности AJ278689.1 и последовательностей, кодирующих α -субъединицу АТФ-синтазы F0F1 у кукурузы, риса, Triticum aes-tivum L . , T. durum L., Secale cereale L., оказались высокогомологичны.

Таким образом, в настоящей работе впервые выявлен полиморфизм фрагментов нуклеотидной последовательности гена-кандидата Rf2 , контролирующего признак восстановления фертильности ЦМС А1 у сорго. Наибольшее число полиморфных сайтов обнаружено при сравнении этих последовательностей у стерильных линий и восстановителей. В частности, нуклеотидный полиморфизм обнаружен у восстановителей фертильности к-928 и к-929 — образцов, которые служили родительскими формами при создании устойчивых к S. graminum линий F₈-F₁₂ BC₁-BC₂. Эти линии имеют стерильную цитоплазму и, по-видимому, различаются по аллельному составу генов Rf , полученных от отцовского родителя. Несмотря на высокую степень гомозиготности, линии F₈-F₁₂ BC₁-BC₂ проявляют значительную изменчивость по признаку фертильности пыльцы.

Изученные генотипы значительно различались как по содержанию фертильных (хорошо окрашенных) пыльцевых зерен (ПЗ), так и по их диаметру (табл. 2). Сообщалось (33), что в норме у диплоидного сорго диаметр фертильных ПЗ не зависит от года репродукции и варьирует в пределах 37,5-54,2 мкм. ПЗ с диаметром более 54,2 мкм (крупные пыльцевые зерна) встречается у диплоидного сорго довольно редко и, по-видимому, содержат нередуцированное число хромосом. Высоким качеством пыльцы характеризовались линии В-10598 (фертильный аналог линии ЦМС А-10598), а также образцы к-1362 и к-928 (соответственно 75,5; 100,0 и 83,3 % фертильных ПЗ). Вместе с тем у к-1362 и к-928 отмечалось большое число крупных ПЗ (с диаметром от 55 до 70 мкм). У семи устойчивых к S. graminum фертильных линий F₈-F₁₂ BC₁-BC₂, выделенных из гибридов Н-81 ½ к-928 и Н-81 ½ к-929, наблюдали сравнительно высокий процент фертильных ПЗ. Этот показатель был несколько выше для пяти линий, у которых донором генов Rf служил образец к-929 (72,2-83,8 %), чем для двух линий, выделенных из гибридов с участием к-928 (57,4 и 63,4 %). У пяти линий с разной частотой встречались крупные (диаметр 55-70 мкм), а у двух — гигантские (диаметр до 84 мкм) ПЗ.

2. Характеристика пыльцы у линий зернового сорго ( Sorghum bicolor L. Moench) с разным типом цитоплазмы, сохраняемых в мировой коллекции ВИР

Образец	Тип цитоплаз-мы	Характеристика генотипа	Характеристика пыльцевых зерен
			Ф ПЗ, % ( M ± m )	Д ПЗ, мкм		Г ПЗ, %	К ПЗ, %	Выравненность по Д/деформи-рованные ПЗ
				min	max

к-1362 Джу-	F	Полувосстановитель
гара белая к-928 Джу-	F	фертильности           100    51,8  68,9     0      70,0          +/ - Восстановитель
гара белая В-10598	F	фертильности         83,3±3,73  40,1   60,5     0       60,0            - / Закрепитель стерильности         75,5±9,71 42,2  48,3     0        0           +/ -

Продолжение таблицы 2

2146/15	S	Фертильная линия F 9 BC 2 (Н-81 ½ к-929)	75,3±4,65	19,9	50,3	0	0	- / -
2148/15	S	Фертильная линия F 10 BC 2
2149/15	S	(Н-81 ½ к-929) Фертильная линия F 10 BC 2	76,6±5,56	26,5	58,5	1,8	0	+/+
2150/15	S	(Н-81 ½ к-929) Фертильная линия F 10 BC 2	75,6±3,30	27,6	52,2	0	0	+/ -
2151/15	S	(Н-81 ½ к-929) Фертильная линия, F 12 BC 2	83,8±3,66	28,7	84,3	2,7	8,2	- / -
2152/15	S	(Н-81 ½ к-929) Фертильная линия F 12 BC 1	72,2±6,34	16,4	57,2	0	2,1	- / -
2153/15	S	(Н-81 ½ к-928) Фертильная линия F 12 BC 1	63,4±3,90	20,8	56,1	0	2,8	- /+
73/16	S	(Н-81 ½ к-928) Гибрид F 1 между стерильной линией и восстановителем	57,4±3,20	28,5	56,1	0	3,1	- / -
74/16	S	фертильности Гибрид F 1 между стерильной линией и восстановителем	27,0±5,88	13,4	52,5	0	0	- / -
		фертильности	58,3±8,96	28,5	60,2	0	3,0	- / -

Прим еч ани е. Ф ПЗ — фертильные (окрашенные) пыльцевые зерна, Д ПЗ — диаметр пыльцевых зерен, Г ПЗ — гигантские пыльцевые зерна (диаметр > 70-80 мкм), К ПЗ — крупные пыльцевые зерна (диаметр > 55 мкм); «+» или « - » — наличие и отсутствие признака.

Лишь одна из 7 проанализированных сестринских линий (2149/15) характеризовалась выравненными по диаметру ПЗ. Поскольку фертильные линии имеют стерильную цитоплазму, унаследованную от материнской формы Н81, можно полагать, что в их генотипах присутствуют полученные от отцовских форм аллели ядерных генов Rf , которые в разной степени влияют на восстановление фертильности пыльцы на фоне стерильного цитоплазмона. У двух линий встречались деформированные ПЗ. Гибриды от скрещиваний устойчивых к S. graminum стерильных линий с сестринскими линиями — предполагаемыми восстановителями фертильности тоже значительно различались по доле фертильной пыльцы (от 9 до 58,3 % у разных растений F₁). Один из гибридов от скрещивания стерильной линии с сестринской линией-закрепителем был полностью стерилен и не образовывал пыльцы, а у другого в пыльниках присутствовала пыльца, но она не окрашивалась, то есть была стерильной. Таким образом, изменчивость по показателям фертильности пыльцы, наблюдаемая у устойчивых к S. graminum сестринских линий и полученных с их участием межлинейных гибридов, свидетельствует о различиях по аллелям генов, вовлеченных в восстановление фертильности (возможно, минорных генов или генов-модификаторов), что согласуется с гипотезой о сложном генетическом контроле признака (13).

Итак, последовательность Rf2 — гена-кандидата восстановления фертильности ЦМС А1 у сорго полиморфна у стерильных линий А-10598 и А-83 и восстановителей фертильности пыльцы к-928 и к-929 (Джугара белая). Фрагмент кодирующей последовательности гена длиной 825 п.н. у носителей рецессивного и доминантного аллелей Rf2 различается 18 полиморфными сайтами, а транслирования последовательность — семью аминокислотными заменами. Геномный фрагмент одного из PPR генов, гомологичного гену Rf1 риса (образец XM_002458104.1) высокополиморфен у линий, различающихся по способности к супрессии фенотипа ЦМС, и со-960

держит 17 полиморфных сайтов. Идентифицированный полиморфизм может быть использован при разработке аллель-специфичных молекулярных маркеров локуса Rf2 . Секвенированные последовательности митохондриального гена atpA , кодирующего α -субъединицу АТФ-синтазы F0F1, и ядерного гена альдегиддегидрогеназы ALDH2b (длина фрагментов — соответственно 1183 и 738 п.н.) у изученных линий идентичны. Устойчивые к Schizaphis graminum линии зернового сорго F₈-F₁₂ BC₁-BC₂, выделенные из гибридов от скрещиваний линии ЦМС Низкорослое 81 с восстановителями фертильности к-928 и к-929, а также гибриды между ними различаются по показателям фертильности пыльцы, наличию крупных, гигантских и деформированных пыльцевых зерен. Поскольку линии обладают стерильной цитоплазмой, можно полагать, что они несут различные аллели генов, оказывающих влияние на проявление признака восстановления фертильности пыльцы, которые были получены от рекуррентного родителя. Устойчивые к S. graminum линии зернового сорго могут служить модельными объектами для изучения механизмов восстановления фертильности пыльцы.

Авторы признательны А.Г. Пинаеву (Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Санкт-Петербург) за помощь в секвенировании фрагментов ДНК.