Полиморфизм сахарозосинтазного домена генов Sus4 сортов картофеля российской, белорусской и казахстанской селекции

Картофель является одной из основных стратегических сельскохозяйственных культур в Российской Федерации, Республике Беларусь и Республике Казахстан. В большинстве стран мира широко развита система промышленной переработки картофеля на различные про- дукты, и для успешного получения некоторых из них: чипсы, фри, печёный картофель, – важным является содержание сухого вещества, в том числе содержание крахмала и редуцирующих сахаров.

За последнее десятилетие достиг- нуты значительные успехи в понимании процессов углеводного метаболизма и взаимного превращения

«сахароза - крахмал» в клубнях картофеля. Показано, что одними из ключевых генов, определяющих качество картофельной продукции, являются гены метаболизма сахарозы.

Одним из важнейших ферментов углеводного метаболизма растений является сахарозосинтаза (Sus). Cахарозосинтаза (Sus4) расщепляет сахарозу до глюкозы и фруктозы, обеспечивая растение энергией для флоэмного транспорта и поставляя субстрат для дыхания. При этом саха-розосинтаза создает субстрат для синтеза крахмала, тем самым обеспечивая растение запасом питательных веществ. Кроме того, было показано, что сахарозосинтаза играет роль в формировании ответной реак- ции растений на воздействие биотических и абиотических стрессовых факторов (Liu et al., 2013).

Анализ структуры и вариабельности генов Sus4 имеет большое значение как для понимания молекулярных процессов контроля углеводного обмена у растений, так и для разработки маркеров, применимых в селекции новых сортов картофеля.

Целью данной работы является описание нуклеотидного и аминокислотного полиморфизма последовательностей фрагмента сахарозосин-тазного домена гена сахарозосинтазы Sus4 у различных сортов картофеля российской, белорусской и казахстанской селекции и оценка их аллельного разнообразия.

cностей проводили с помощью программы MEGA6.0 (Tamura et al, 2013).

<-----------------►

Sus3exF Sus6exR

Рис.1. Графическое изображение анализируемого фрагмента гена Sus4.

Материалы и методы

Для изучения полиморфизма генов-гомологов Sus4 у сортов отечественной и зарубежной селекции был составлен набор из 9 сортов картофеля, которые включали сорта российской (Фаворит, Елизавета, Башкирский), белорусской (Лилея, Зорачка, Манифест) и казахстанской селекции (Карасайский, Аксор, Мирас). Отобранные для анализа образцы клубней были предоставлены Всероссийскийм научно-исследовательским институтом картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха (ВНИИКХ), Биотехнологическим Центром Казахстана и Белорусским НИИ картофелеводства.

ДНК из растений выделяли калийацетатным методом с двойной очисткой смесью фенол-хлоформ (Edwards, 1991).

Ранее был изучен полиморфизм нуклеотидных последовательностей гена Sus4, кодирующих сахарозосинтазный и глюкозилтрансферазный домены белка (Борис и др., 2011, Слугина и др., 2014). Показано, что сахарозосинтаз-ный домен является полиморфным, что достаточно редко для функциональных доменов, и поэтому именно он выбран в данной работе для оценки аллельной вариабельности сортов картофеля. Для амплификации последовательно- стей сахарозосинтазного домена разработана система из праймеров, приводящая к амплификации фрагмента гена Sus4 с экзона III по экзон VI (рис.1).

Реакционная смесь для проведения ПЦР содержала 1Х буфер (50мM TrisCl (pH 8.6), 50мM KCl 0,1% Tween 20 («Диалат», Москва)), 1,5 М MgCl2, 20мМ dNTP; 10 мкМ соответствующего праймера; 0.25 единиц Taq полимеразы и ~100 нг геномной ДНК. Температурновременной профиль ПЦР был следующим:

• 1)    Первый цикл: 94 ° С - 5 мин;

• 2)    Последующие 35 циклов: 94 ° С - 30 сек, 57 ° С - 35 сек и 72 ° С -1 мин.

Анализ полученных продуктов ПЦР проводили методом электрофореза в 1% агарозном геле.

Полученные фрагменты секвениро-вали с использованием тех же праймеров, что и для амплификации. Секвенирование проводили с использованием реагентов ABI PRISM DyeDeoxiterminatorsequencingkit («AppliedBiosystems», США) согласно протоколу фирмы-производителя на автоматическом секвенаторе ABI 310 capillary DNA Analyzer («AppliedBiosystems», США) в ФИЦ «Биотехнология» РАН.

Выравнивание и анализ нуклеотидных и аминокислотных последователь-

Результаты и обсуждение

Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента гена Sus4 (экзон III – экзон VI).

Протяженность кодирующей последовательности гена Sus4 картофеля ( Solanum tuberosum ) составляет 2415 п.н. и включает 14 экзонов. Для последовательности Sus4 картофеля характерно наличие двух доменов, определяющих основные функции белка: саха-розосинтазного (I–XI экзон) и глюкозилтрансферазного (XII экзон) (Fu et al., 1995; Baud et al., 2004). Ранее было показано, что у видов и сортов Solanum наиболее вариабельным является фрагмент сахарозосинтазного домена гена, включающий последовательность с III по VI экзон (Борис и др., 2011, Слугина и др., 2014).

У анализируемых сортов картофеля фрагмент гена с интрона III по экзон VI был амплифицирован с использованием разработанных праймеров и определена его первичная последовательность. Общая протяженность исследуемого фрагмента сахарозосинтазного домена составила от 977 п.н. (у сортов Фаворит, Карасайский, Мирас) до 1013 п.н. (у сортов Зорочка, Манифест, Елизавета, Башкирский). Это является следствием наличия четырех инделей, две из которых находятся в интроне IV, две другие – в интроне V. Так у сортов Карасайский и Фаворит была выявлена шестинуклеотидная делеция в интроне IV и тридцатинуклеотидная – в интроне V гена Sus4 сортов Фаворит, Карасайский, Мирас (рис.2). Как было показано ранее, аналогичные индели были характерны для ряда дикорасту-

FATORIT KARASAISKII KIRAS

LILIA

AXSOR ZOROCHKA MANIFEST i. ELIZAVETA .. bashkirskii

FAVORIT KARASAISKII MIRAS

L * w2.A xxsoa zoaocKXA xanxfzst

. ELIZAVETA . BASHKXASXII

x|g!igAXiaig||xlllliHk8AAlA*ixliaiXiMxxliaigiliBiaxx AaaggBxxuBgagsxi6tg,rx8xxcxxrxaicgxiRxxagaxggiBcicxA

AaigttxgxarigfArttrbdtxBxxiAAixiicgxgixAiiaxiiii-iexgxggEAxrtafMiiaggegeaBeixgiaxiaa Mlllltx8ACrr:ixrbTCC=AeXA6AAZAABCtArCAAHexril|-iCAXiliaAAg:d:tiTtidttggeeBi6ATCCAaaa AaigigxBxcg:xgxg6tacgxcxxBxx:AAgagAgaxAxx=Ag|||-mAggggxxagBgagacggxgccczexxacAg8c xBiirrxBACxTXXArbxbcxxcxxBxxrxAbcxxxixxiaiiim-IIIIIllllllllllliaiiHBeailxiiaxiaa АВГХГХА|х8ГГ|ГАХ|хВСХхВхХ|ХХХАЛВСГАгВХАХХСАгШ-|СААГвГ = ЛЛВХвГВХвСГГ = ГСССГ6ХХВСАВСС XBXXirABXCXXXiXXaticrXCAXixArXAgaixMiillllllll-llillllUlilililillllllllliilililll xiiiiixixaaiiexeiiiaixajixiiixixbiaikiixxiHAiiig-aaxxiiiixxiiiiiiiBHiiaaBiixiiaxiae igagiiaaggegBaaiixiaaxiaa |g|glilCggrgCCCECArlcgA8B

xiiiaxxiiixxiaiii- -...........................laxiiiexaaiixaaixiiAiixixiaixiiBK

111ШШШ11111..............................1И111111111111ШМ1111|||111111

IIIIIIIIIIIIIIIII..............................GCA7G-TACrrgACiBlxSrx|XA8AB-CAB7CA xaBBaAABBXAxxTiaBixiiaaaxiiexiiiiiiiiiiixAieiiiiaATarfAaiiixaegxaiATAAiAixaAarax хавваААвв8Ахгх5в:бАиав8111ехеавАеАвахх£ххШ1ебохШ1хааавА8сгх11АВАхйА$йсхнах ACdGCAABdTAA:rrBigAH8a8AliaAiii:BA=xSAxr£Axi:g«llBillllxaiHx8BaxllABXAlxll6illli allia*illlixllllllXliaBlilreAXXBArxBBrirxAxrrbt6GArBxXAB£xlABG8AlliltililHillHI xaH8AxiiixxiiiiiixiiHeAggaAE8BA£xBarxidxAgig|giaxii»xaiiiaaaixigAiAxaAigBAig8A ^iiiBxxiiixxiieiiixiaBBaxaiBxaiixBxiiiiaxxHiieiBxaiBixBiaixBBBxBBxiKxaxiiixHBx

Рис. 2. Индели в интронных последовательностях анализируемого фрагмента сахарозосинтазы.

Участок гена Sus4	Последовательность, пн	Вариабельные сайты, (%)	Информативные сайты, (%)	Количество инделей.
Интрон III	83	4 (4,81)	2 (2,40)	0
Экзон IV	156	5 (3,20)	4 (2,56)	0
Интрон IV	77-84	10 (12,4)	3 (3,72)	2
Экзон V	190	8 (4,21)	1 (0,52)	0
Интрон V	235-266	23 (9,18)	11 (4,39)	2
Экзон VI	235	8 (3,40)	4 (1,70)	0
Всего	977-1013	58 (5,82)	25 (2,51)	4

Рис. 3. Полиморфизм исследуемых последовательностей фрагмента гена Sus4.

Анализ аллельныхвариантов

Несмотря на то, что общий уровень полиморфизма экзонов гораздо ниже, чем интронов, именно экзонные последовательности представляют наибольший интерес, так как именно нуклеотидные замены в экзонах могут привести к аминокислотным заменам, в конечном счете что может отразиться на функции кодируемого фермента.

Исходя из наличия в составе последовательностей экзонов отдельных поли- щих видов картофеля (подсекции c) (К.В. Борис, личные данные). Для селекции современных сортов картофеля активно используются межвидовая гибридизация, таким образом, данные индели могли закрепиться в их геноме.

Анализ исследуемых нуклеотидных последовательностей гена сахарозо-синтазы сортов показал, что уровень полиморфизма был высок, принимая во внимание, что анализируемые последовательности представляют собой фрагмент функционального домена гена Sus4 и составил 5,82% (58 полиморфных сайтов) (рис. 3). При этом почти половина (43,12%) от общего числа полиморфных сайтов являются информативными и дают возможность выделения определенных сортовых групп.

Анализ вариабельности отдельных экзонов и интронов показал, что, как и ожидалось, более полиморфными были интронные последовательности, наибольший уровень вариабельности выявлен в последовательностях интрона IV (12,4%) и интрона V (9,18%). Среди экзонов наиболее вариабельным является экзон IV (рис. 3). Ранее при исследовании аналогичного участка гена сахарозосинтазы у набора сортов казахстанской селекции также было показано, что данные интроны наибо- лее вариабельны (Слугина и др., 2014).

По наличию инделей в последовательностях интронов IV и V исследуемые сорта делятся на 4 группы (рис. 4), которые могут указывать на общность их происхождения. Группа 1, представленная сортами Зорочка, Башкирский, Манифест и Елизавета, характеризуется присутствием шестинуклеотидной

Рис. 5. Аллельные варианты генов сахарозосинтазы сортов российской, белорусской и казахстанской селекции.

индели в интроне IV, а также тридцати-и однонуклеотидных инделей в интроне V. Сорта Аскор и Лилея, Фаворит и Карасайский соответственно также составляют пары по наличию общих инделей. Казахстанский сорт Мирас характеризуется наличием только шестинуклеотидной индели в интроне IV (рис.4).

морфных нуклеотидов, можно предположить наличие как минимум 7 аллельных вариантов последовательностей, кодирующих сахарозосинтазный домен. Экзонные последовательности сортов картофеля Зорочка, Башкирский и Манифест полностью идентичны и представляют собой один аллельный вариант (А). Последовательности экзонов саха-розосинтазного домена сортов Аскор,

Елизавета, Лилея, Фаворит, Карасайский, Мирас имеют сортоспецифичные SNPs, и соответственно различные аллельные варианты (рис.5).

Анализ аминокислотной последовательности

Белок Sus4 состоит из 805 а.о. и имеет молекулярную массу около 92

Рис. 4. Выявленные индели в интронах IV и V у анализируемых сортов картофеля.

Манифест Башкирский Зорачка Липея	W N W N W N W N	D Е F Е D А D Е F Е D А D Е F Е D А D Е F Е D А	Группа 1
Фаворит	W N	D Е F D D А	Группа 2
Елизавета	W N	D Е F Е V S	Группа 3
Аксор	W N	D Е L Е D А	Группа 4
Карасайский	W К	N К F D D А	Группа 5
Мирас	С N	D Е F Е D А	Группа 6

Рис. 6. Замещения аминокислот в исследуемом фрагменте полипептида Sus4.

кДа (Fu et al.,1995). При трансляции нуклеотидных последовательностей экзонов анализируемого участка саха-розосинтазного домена получена последовательность из 193 аминокислотных остатков. В исследуемой поли- пептидной

последовательности

выявлено 8 аминокислотных замен (рис. 6).

Стоит отметить, что среди анализируемых экзонных последовательностей девяти сортов картофеля показано наличие семи аллельных вариантов нуклеотидных последовательностей и только шесть вариантов аминокислотных последовательностей. Это связано с тем, что сорта, для которых характерен аллельный вариант А (Манифест, Башкирский, Зорачка) и сорт Лилея, при трансляции имеют одинаковую аминокислотную последовательность. Интересно, что соответствующие нуклеотидные последовательности экзонов данных двух аллельных вариантов имеют достаточ- но большое количество замен

–

SNPs. Таким образом, можно сделать вывод о том, что данные замены носят скорее нейтральный характер, и их закрепление в процессе эволюции не скажется на функционировании белка.

Полипептидные последовательности сортов Фаворит, Елизавета, Аскор,

Карасайский и Мирас характеризуются наличием специфичных сайтов замещения аминокислот. При этом сорт Карасайский имеет наибольшее (по отношению к группе 1) количество замещений, и вероятность того, что он несет отличные от других сортов признаки, наиболее высока.

Заключение

Таким образом, среди исследуемого набора из 9 сортов картофеля российской и зарубежной селекции выявлено наличие 7 аллельных вариантов нуклеотидной последовательности сахарозосинтазного домена гена Sus4. Из 21 полиморфных сайтов, выявленных в последовательностях экзонов, 8 приводили к замене аминокислотных

остатков.

Подобное разнообразие нуклеотидного состава в пределах функционального домена гена сахарозосин-тазы может представлять интерес для селекционеров, так как может влиять на свойства белка и, как следствие, приводить к изменению содержанию крахмала и сахаров в клубнях.

Работа выполнена при поддержке ГК № 14.M04.12.0016 МЦП ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии».

THE POLYMORPHISM OF THE SUS4 SUCROSE SYNTHASE DOMAIN SEQUENCES IN RUSSIAN, BELORUSSIAN

AND KAZAKH POTATO CULTIVARS

Slugina M.A.1,2,3, Zapekina T.I.4, Meleshin A.A.4

1Department of Biotechnology of the Biological faculty of the Lomonosov State University 119234, Russia, Moscow, Leninskie Gory, 1, str.12

2Federal Research Centre «Fundamental principal of biotechnology» of Russian Academy of Sciences

119071, Russia, Moscow, Leninskiy prospect, 33

• ³    Peoples' Friendship University of Russia 117198, Russia, Moscow, 117198, Moscow, Miklukho-Maklaya str., 8

• ⁴    Federal State Budgetary Scientific Research Institution

«All-Russian Scientific Research Institute of potato farming by A.G. Lorh»

140051, Russia, Moscow region, Lyuberetskiy district, p. Kraskovo 1, Lorkha street, 23