Полиморфизм сперматозоидов и изменение ядерного материала при воздействии хлорида цинка

В условиях природного и антропогенного загрязнения особую значимость приобретают вопросы объективной оценки экологической безопасности последствий воздействия химических токсикантов на организм. Важная роль в этом процессе принадлежит избыточному поступлению в биосферу тяжелых металлов и их солей. Для многих из них характерны эффекты токсичности, затрагивающие такие основополагающие функции живых организмов, как биопродуктивность [4,7]. Соли тяжелых металлов оказывают неспецифическое воздействие, которое реализуется через бессимптомное накопление изменений в тканях и органах [9] и проявляется в связывании, блокировании активных центров ферментов, влияющих на состояние органеллоспецифических ферментных систем различных субклеточных структур репродуктивных органов, центральной нервной системы и др. [1].

Вместе с тем токсическое воздействие тяжелых металлов оказывает влияние и на нуклеолярный аппарат клетки. Известно, что ядрышко является самоорганизующейся динамической системой, реагирующей на действие агентов, внутриклеточные мишени, которых находятся вне ядрышка, поэтому структурнофункциональная организация ядрышек может изменяться в ответ на разнообразные воздействия. Особенно важное значение имеет совокупность структурно-функциональных изменений ядрышек при воздействии на клетки химических соединений, являющихся непосредственными ингибиторами генной транскрипции [8]. При этом структурная организация ядрышка тесно связана с его функциональной активностью, т.е. уровнем синтеза предшественника рибосомной РНК (рРНК), скоростью процессинга и выхода зрелых субъединиц рибосом из ядрышка в нуклеоплазму и отражает уровень метаболизма клетки в целом. Многообразные морфологические типы ядрышек отражают степень патологических изменений в клетке [3].

Целью наших исследований явилась оценка полиморфизма сперматозоидов и изменения ядерного материала при воздействии хлорида цинка.

Методика исследования . Эксперименты выполнены на белых беспородных мышах-самцах ( n= 52) двухмесячного возраста массой 19±2г. Животных содержали на стандартном рационе в условиях свободного доступа к воде и пище. В качестве модельного ксенобиотика использовался хлорид цинка (ZnCl 2 ) (ОАО Уральский завод химреактивов, Россия).

Исследование гонадотоксического эффекта в клетках репродуктивной системы животных производили при подостром применении хлорида цинка в дозе 20 мг/кг массы животного, который инъецировали внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 и 10 дней. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Хлорид цинка использовали в дозе, соответствующей, согласно литературным данным [2], диапазону доз, обладающих цитотоксическим и гонадотоксическим эффектом.

Для определения количества спермиев с аномальной морфологией готовили препараты по модифицированной методике Ю.В. Иванова [5]. Извлеченные из мошонки семенники гомогенизировали в 2 мл 0,9% раствора NaCl. Брали 100 мкл суспензии семенников и вносили в 1 мл 1% раствора эозина, тщательно смешивали. Из капли этой смеси готовили мазок, сушили на воздухе. Анализ количества аномальных форм спермиев осуществляли методом световой микроскопии (увеличение х 400). Анализировали по 200 клеток в мазках, при этом учитывали изменение размеров и формы головки (грушевидные, удлиненные, карликовые и гигантские головки), повреждения шейки и хвоста (расщепленные, изогнутые, нитевидные средние части; скрученные хвостики, прирастание хвоста к голове, сломанный хвост и удвоение хвостика) [11].

Аргентофильность ядрышек в клетках сперматогенного эпителия осуществляли методом окраски мазков нитратом серебра. Готовые препараты сперматогенного эпителия фиксировали в метаноле 5–7 мин, затем обрабатывали в термостате при температуре 37-38 ° С в течение 20 мин смесью 50% водного раствора серебра и 2% раствора желатина на 1% муравьиной кислоте. После окраски клетки классифицировали по форме ядра (на 200 клеток сперматогенного эпителия, увеличение х 1000) по видам: I - клетки без видимых морфологических повреждений; II – клетки с деградацией хроматина. В данных клетках определяли два типа ядрышек по диаметру с помощью окуляр-микрометра МОВ - 1 х 15: 1 тип - компактные и нуклеолонемные (отличаются крупными размерами, 2–4 мкм); 2 тип – плотные фибриллярные ядрышки (мелкие, до 1 мкм), что соответствует высокой (1 тип) и низкой (2 тип) функциональной активности ядрышек [10].

Для изучения восстановительного периода после однократного введения ксенобиотика в дозе 40 мг/кг исследования проводили через 24 ч, на 5-е и 10-е сутки после введения ZnCl 2 .

Материалы обработаны методом вариационной статистики с использованием t -критерия Стьюдента (Р<0,05) [6].

Результаты исследования. Морфологический анализ гонадотоксического действия хлорида цинка показал, что при затравке животных ксенобиотиком в дозе 20 мг/кг через 24 ч наблюдалось недостоверное снижение относительного содержания морфологически нормальных форм спермиев до 21,3±0,32% по сравнению с контрольной группой (25,8±1,4%). Одновременно отмечается значительное увеличение относительного содержания сперматозоидов с патологическими изменениями хвоста 19,0±1,1% (Р<0,001), причем в основном за счет сперматозоидов с закрученными хвостами 17,5±2,1% (Р<0,001), по сравнению с контролем 15,7±1,9% и 10,5±1,9% соответственно. Пятисуточное введение ксенобиотика в той же дозе сопровождалось достоверным снижением количества морфологически нормальных форм сперматозоидов 18,9±1,3% (Р<0,001) по сравнению с контролем, а относительного содержания сперматозоидов с патологическими изменениями хвоста достоверно увеличилось до 25,4±2,0% (Р<0,001), при этом количество сперматозоидов с закрученными хвостами достоверно возросло в два раза по сравнению с контролем (рис.1).

Рис. 1. Динамика формирования аномальных форм сперматозоидов при действии хлорида цинка в дозе 20 мг/кг

Десятисуточное введение ксенобиотика в той же дозе привело к снижению в два раза количества морфологически нормальных форм сперматозоидов, при этом отмечается достоверный рост числа сперми-ев с морфологическими аномалиями хвоста до 40,2±1,9% (Р<0,001) и в три раза возросло количество сперматозоидов с закрученными хвостами.

Процентное содержание сперматозоидов с патологией шейки при затравке животных ксенобиотиком в дозе 20 мг/кг через 24 ч увеличилось незначительно по сравнению с контролем, а количество половых клеток с аномальными размерами головки достоверно возрастало с 0,9±0,18% в контроле, до 2,1±0,1% (Р<0,001) на 5-е сутки и 3,0±0,12% (Р<0,001) на 10-е сутки соответственно (табл. 1).

Таблица 1

Морфологические формы сперматозоидов, индуцируемые хлоридом цинка в дозе 20 мг/кг, %

Q. О	о ф q ® Ф s 5 z ° ^8 ■^ о а о 1 с	Cl О о о 1- S ф £ О С о	S X О 1- к 05 S 05 О 2 С о о	о и о х 1. ® ГО > о & 05 СО О	- S я л S ь S го й s ч 2 о X ш ?; ГО Е S S О	—    Ь£ л s m Ct Е о 5 ф 0^0 о го ■- °   5 го го s 5 5 ГО 5.0 а о о s CL
Контроль	25,8±1,4	5,5±0,9	15,7±1,9	10,5±1,9	2,3±0,5	0,9±0,18
24 часа	21,3±0,3	5,6±0,7	19,0±1,1*	17,5±2,1**	2,8±0,3	1,7±0,3
5 суток	18,9±1,3**	5,8±0,6	25,4±2,0**	22,0±2,8**	4,3±0,5*	2,1±0,1**
10 суток	14,4±1,7**	5,9±0,5	40,2±1,9**	32,0±0,8*	5,1±0,4*	3,0±0,12*

Здесь и далее: достоверность различий по сравнению с контролем: * Р<0,05; ** Р<0,02; *** Р<0,01; **** Р<0,001.

В восстановительном периоде к 10 суткам наблюдалась тенденция к снижению количества половых клеток (спермиев) с аномальной морфологией (табл. 2).

Таблица 2

Аномальные формы сперматозоидов в восстановительном периоде после однократного внутрибрюшинного введения хлорида цинка в дозе 40 мг/кг in vivo

Серия	Аномальные формы спермиев, %
Контроль	2,10 ± 0,14
Через 24 часа	4,10 ± 0,19****
Через 5 суток	4,90 ± 0,19****
Через 10 суток	3,0 ± 0,32*

В ходе проведенных экспериментов выявлено, что подострое поступление хлорида цинка в организм животных вызывает проявление гонадотоксического эффекта ксенобиотика в отношении сперматозоидов мышей.

Известно, что размеры ядрышек определяют степень транскрипционной активности ядрышкового аппарата. Поэтому учет количества и размеров ядрышек в клетках сперматогенного эпителия является одним из методов оценки цитотоксической активности ксенобиотика [9]. При затравке животных хлоридом цинка в дозе 20 мг/кг через 24 ч отмечалось достоверное увеличение числа клеток с деградацией хроматина. Количество ядрышек 1-го и 2-го типов в клетках без видимых морфологических повреждений снизилось и составило 88,28±0,61% (Р<0,001) и 81,62±0,35% (Р<0,001) по сравнению с контролем 97,98±0,27% и 94,76±0,46% соответственно. Вместе с тем, в клетках сперматогенного эпителия с деградацией хроматина количество крупных и мелких ядрышек увеличилось и составило 11,72±0,6% (Р<0,001) и 18,38±0,35% (Р<0,001) по сравнению с контролем соответственно. При пятисуточном введении ксенобиотика наблюдалась тенденция к возрастанию в 14 раз количества клеток с деградацией хроматина. При этом в клетках без видимых морфологических повреждений количество ядрышек 1-го и 2-го типов снижалось 86,40±0,27% (Р<0,001) и 67,0±0,1% (Р<0,001) по сравнению с контролем 97,98±0,27% и 94,76±0,4% соответственно. В клетках с де- градацией хроматина в ядре количество ядрышек 1-го типа возросло в 6,7 раза, а ядрышек 2-го типа в 6,3 раза по сравнению с контрольным уровнем. Десятисуточное введение хлорида цинка привело к возрастанию количества клеток с деградацией хроматина в ядре и составило 35,02±0,34% (Р<0,001) и 1,76±0,23% в опыте и контроле соответственно и снижение количества клеток без видимых морфологических повреждений 64,98±0,34% (Р<0,001) и 98,24±0,24% в опыте и контроле соответственно. Количество крупных и мелких ядрышек в клетках без видимых морфологических повреждений снизилось и составило 83,56±0,29% (Р<0,001) и 61,64+0,52% (Р<0,001) соответственно, тогда как в клетках с признаками деградации хроматина количество крупных и мелких ядрышек достоверно возросло в 8,4 и в 7,3 раза соответственно (рис. 2, А, Б).

Рис. 2. Относительное количество ядрышек 1 типа (А) и 2 типа (Б) в клетках без морфологических признаков повреждения ядер (I) и в клетках с деградацией хроматина (II) при введении хлорида цинка в дозе 20 мг/кг

К концу восстановительного периода наблюдалась тенденция к нормализации всех исследуемых параметров (табл. 3), что отражает усиление транскрипционной активности и восстановление интенсивности белкового синтеза в клетках сперматогенного эпителия.

Таблица 3

Изменение ядерного материала в сперматогенном эпителии мышей в восстановительном периоде после однократного внутрибрюшинного введения хлорида цинка в дозе 40 мг/кг in vivo

Серия	Клетки без видимых морфологических повреждений ядра			Клетки с деградацией хроматина
	% данного типа клеток	% ядрышек 1-го типа	% ядрышек 2-го типа	% данного типа клеток	% ядрышек 1-го типа	% ядрышек 2-го типа
Контроль	98,24 ± 0,24	97,98 ± 0,27	94,76 ± 0,46	1,76 ± 0,23	2,02 ± 0,27	5,24 ± 0,46
Через 24 ч	81,14 ± 0,14****	87,28 ± 0,35****	75,40 ± 0,51****	18,86 ± 0,14****	12,72 ± 0,35****	24,60 ± 0,51****
Через 5 суток	92,84 ± 0,27****	90,34 ± 0,29****	86,30 ± 0,29****	7,16 ± 0,27****	9,66 ± 0,29****	13,70 ± 0,27****
Через 10 суток	96,60 ± 0,25***	96,04 ± 0,29***	93,64 ± 0,21	3,40 ± 0,25***	3,96 ± 0,29****	6,36 ± 0,25

Данные экспериментов показывают, что при воздействии хлорида цинка отмечается рост числа клеток сперматогенного эпителия с низкой функциональной активностью ядрышек.

Таким образом, при действии хлорида цинка выявлена корреляция между активностью ядрышкового аппарата, наличием патоморфологических изменений клеток сперматогенного эпителия и сохранностью их ядерного материала.