Полногеномное исследование ассоциаций SNP с высотой в холке в популяциях локальных и трансграничных пород крупного рогатого скота в России

Племенная работа по совершенствованию крупного рогатого скота (КРС) имеет важное значение для повышения эффективности скотоводства, поскольку гармонично сложенные, развитые животные имеют высокую продуктивность и пользуются спросом на рынке племенной продукции (1).

Полногеномный анализ ассоциаций (whole-genome associated study, GWAS) позволил идентифицировать множество геномных вариаций, связанных с количественными признаками сельскохозяйственных животных

• (2) . В последние несколько десятилетий проведены исследования по картированию локусов количественных признаков (quantitative trait loci, QTLs), ответственных за молочную продуктивность (3), устойчивость к болезням (4, 5), воспроизводительные качества (6), рост (7-9), мясные качества (1013) и качества туши КРС (14-16).

Рост животного — это классический количественный признак, привлекающий внимание генетиков на протяжении долгого времени (17-19). Понимание молекулярных основ вариабельности роста между индивидуумами поможет не только получить информацию об общей архитектуре количественных признаков, но также даст представление о механизмах, контролирующих рост организма. Известно, что рост влияет на предрасположенность к определенным заболеваниям и связан с продуктивностью сельскохозяйственных животных. Несмотря на чувствительность к факторам окружающей среды, он обычно передается по наследству, в том числе у человека ( ∼ 85 %) (20).

Доместикация КРС оказала сильное влияние на этот показатель. Рост у вида Bos taurus уменьшился примерно в 1,5 раза от Неолита до Средневековья и снова увеличился только в Раннем Новом времени (21). Вымерший тур ( Bos primigenius ) был намного крупнее своих домашних потомков (высота в холке ∼ 2 м против ∼ 1,1-1,5 м у современного КРС). Коэффициент наследуемости показателя колеблется в пределах ∼ 25-85 % в зависимости от популяции (22, 23). Если механизмы генетической изменчивости способствовали восстановлению роста с Раннего Нового времени, их отпечатки селекции должны быть обнаружены на основе геномных данных современных пород КРС.

В настоящее время картировано множество QTLs, влияющих на составляющие роста КРС, что подтверждает его полигенный детерминизм. Например, сообщалось о картировании 38 и 52 QTLs, объясняющих более 60 % вариаций соответственно роста и массы взрослых особей в американской популяции коров абердин-ангусской породы (24). L. Karim с соавт. (25) исследовали животных голштино-фризской и джерсейской пород для идентификации QTLs, влияющих на признаки, важные для молочного скотоводства. Были проведены измерения для более чем 500 признаков, шесть из которых относились к размерам тела: масса при рождении, масса в 6, 8, 12, 18 и более 24 мес (живая масса), а также высота в холке в 18 мес.

• I.    Randhawa с соавт. (26) сравнили данные однонуклеотидного полиморфизма (single nucleotide polymorphism, SNP) по всему геному у ряда европейских и африканских пород B. taurus с высокой (145-155 см) и низкой (105-133 см) холкой и обнаружили, что наиболее значимый селекционный сигнал, связанный с ростом, картирован на 14-й хромосоме (BTA14) в регионе 24,79-28,25 Mbp (27). Этот отпечаток селекции был недавно подтвержден данными последовательностей полного генома четырех пород B. taurus и ограничен меньшей областью, охватывающей позиции 24,80-25,08 Mbp (28), где расположен ген плеоморфной аденомы 1 ( PLAG1 ).

Ген PLAG1, состоящий из пяти экзонов и четырех интронов и имеющий пять транскриптов, был впервые обнаружен посредством позиционного картирования, когда исследователи изучали плеоморфные аденомы слюнных желез у человека (29). PLAG1 инициирует транскрипцию инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2), митогенного гормона, важного для роста и развития плода, и участвует в генетической изменчивости роста как у человека, так и у КРС (25, 30-32). Опубликовано значительное число работ, в которых исследовалась связь гена PLAG1 с легкостью отела (33), размерами тела (25), живой массой в раннем возрасте (14), характеристиками туши (34), массой при рождении (35) и другими признаками КРС (36). Российские локальные породы представляют большой интерес в качестве резерва биоразнообразия (37, 38), однако остаются неизученными в отношении гена PLAG1 несмотря на проведенные ранее полногеномные исследования (39, 40).

В настоящей работе впервые проведена оценка частоты встречаемости аллелей SNP, связанных с высотой в холке, в популяциях крупного рогатого скота, разводимых на территории России. В российских локальных породах установлено преобладание таких аллелей в трех из четырех выявленных однонуклеотидных полиморфизмов.

Целью работы была идентификация локусов и характеристика аллельных вариантов, находящихся под давлением отбора и связанных с размерами тела, в популяциях российских локальных и разводимых на территории Российской Федерации трансграничных пород крупного рогатого скота различных направлений продуктивности, по-разному подверженных давлению искусственного отбора и неодинаково распространенных в мире.

Мешодика. Исследовали биоматериал (цельную кровь, сперму и ушные выщипы, хранящиеся в УНУ «Банк генетического материала домашних и диких видов животных и птицы» ФГБНУ ФИЦ животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста) от 670 гол. крупного рогатого скота 13 пород: абердин-ангусской (ANG, n = 39), айрширской (AYR, n = 144), черно-пестрой (BLW, n = 50), голштинской (HLS, n = 184), истобенской (IST, n = 22), джерсейской (JRS, n = 32), калмыцкой (KLM, n = 27), холмогорской (KHL, n = 26), киргизской (KRG, n = 24), монгольской (MNG, n = 26), тагильской (TAG, n = 26), якутской (YKT, n = 29) и ярославской (YRS, n = 41).

ДНК выделяли с помощью коммерческих наборов ДНК-Экстран-1 и ДНК-Экстран-2 (ООО «Синтол», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Перед генотипированием на SNP-чипах полученные препараты проходили контроль качества: измеряли концентрацию (не менее 15 нг/мкл) двуцепочечной ДНК (флуориметр Qubit 4.0, «Invitrogen, Life Technologies», США), а также соотношение OD 260 /OD 280 (допустимые значения 1,8-2,0), характеризующее чистоту препаратов (спектрофотометр NanоDrop ™ 8000 («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США).

Образцы 11 пород генотипировали самостоятельно, генотипы двух пород — абердин-ангусской и джерсейской — были загружены из базы данных WIDDE .

Поскольку генотипирование образцов проводили на SNP-чипах разной плотности — GGP Bovine 150K и BovineHD BeadChip («Illumina, Inc.», США), в процессе обработки данных были определены общие для двух чипов SNP, которые использовались для дальнейшего анализа. Качество генотипирования контролировали в программе PLINK 1.9 (41) с использованием следующих фильтров: успешно генотипированы не менее 90 % локусов (--geno 0.1) не менее чем у 80 % животных (--mind 0.2), частота минорных аллелей не менее 5 % (--maf 0.05). После объединения наборов данных и контроля качества генотипирования для анализа отобрали 115237 SNP. C помощью PLINK 1.9 осуществляли полногеномное исследование ассоциаций (GWAS) однонуклеотидных полиморфизмов с высотой в холке. Поскольку SNP-чипы, на которых проводили генотипирование, были смоделированы с учетом позиций однонуклеотидных полиморфизмов, представленных в сборке генома Bos taurus UMD 3.1.1 , для поиска генов, расположенных вблизи значимо ассоциированных SNP, также использовалась вышеуказанная сборка.

Данные о высоте в холке для исследуемых пород были получены из базы ФАО (DAD-IS, . Поскольку величины показателей варьировали в разных странах, для каждой породы были рассчитаны средние значения без учета страны разведения и пола животного. Затем вычисляли среднее значение высоты в холке для всего массива исследованных пород. Расчеты и визуализацию результатов проводили в программной среде R с использованием собственных скриптов.

На основании данных о размерах тела животных все исследуемые породы были разделены на две группы. Породы, для которых средние значения высоты в холке не превышали средних значений, рассчитанных для всего массива, были отнесены к низкорослым (группа Low). Породы, для которых средние значения показателя превышали средние значения выборки, относили к высокорослым (группа High). Кроме того, исследованные породы подразделяли на группы по следующим критериям: в соответствии с направлением продуктивности (молочные, мясные), степенью давления селекции (примитивные, заводские) и распространенностью в мире (российские, трансграничные).

Достоверность разности частот встречаемости альтернативных аллелей для SNP, показавших значимые ассоциации с признаком высоты в холке, в разных группах животных определяли с использованием критерия χ ² в программной среде R. При оценке достоверности разницы частот встречаемости альтернативных аллелей между трансграничными и российскими породами из анализа были исключены монгольский и киргизский скот, поскольку эти группы не разводят на территории России в товарных или племенных стадах.

Результаты. Характеристика исследованных пород КРС приведена в таблице 1.

1. Характеристика исследованных российских локальных и трансграничных пород крупного рогатого скота ( Bos taurus taurus )

Порода	Аббревиатура	Группа	Географическая классификация по ФАО	Направление продуктивности	Селекционное давление
Абердин-ангусская	ANG	High	Трансграничные	Мясное	Заводские
Айрширская	AYR	High	Трансграничные	Молочное	Заводские
Черно-пестрая	BLW	High	Трансграничные	Молочное	Заводские
Холмогорская	KHL	High	Российские	Молочное	Заводские
Голштинская	HLS	High	Трансграничные	Молочное	Заводские
Ярославская	YRS	High	Российские	Молочное	Заводские
Тагильская	TAG	High	Российские	Молочное	Заводские
Истобенская	IST	High	Российские	Молочное	Заводские
Калмыцкая	KLM	Low	Трансграничные	Мясное	Заводские
Джерсейская	JRS	Low	Трансграничные	Молочное	Заводские
Киргизский скот	KRG	Low	-	Мясное	Примитивные
Монгольский скот	MNG	Low	-	Мясное	Примитивные
Якутская	YKT	Low	Российские	Мясное	Примитивные

Примечание. Low — породы, для которых средние значения высоты в холке не превышали средних значений, рассчитанных для всего массива; High — породы, для которых средние значения показателя превосходили средние значения выборки, относили к высокорослым. Прочерки означают, что породы исключены из группы, поскольку не разводятся на территории России.

Полногеномное исследование ассоциаций однонуклеотидных полиморфизмов с показателем высоты в холке (рис. 1) было проведено для 13 пород крупного рогатого скота. Обнаружены статистически значимые (p-value < 1e - 80) ассоциации для некоторых однонуклеотидных полиморфизмов (рис. 2).

Выявлено в общей сложности четыре SNP, из которых три были локализованы на 4-й хромосоме, один — на 14-й хромосоме.

Рис. 1. Средние значения высоты в холке для российских локальных и трансграничных пород крупного рогатого скота ( Bos taurus taurus ): HLS — голштинская, BLW — черно-пестрая, KHL — холмогорская, ANG — абердин-ангусская, TAG — тагильская, AYR — айрширская, IST — ис-тобенская, YRS — ярославская, KLM — калмыцкая, JRS — джерсейская, KRG — киргизский скот, YKT — якутская, MNG — монгольский скот. На диаграммах размаха для каждой породы приведены значения нижнего квартиля, арифметической средней и верхнего квартиля. Горизонтальная линия — среднее значение, рассчитанное для всего массива исследованных пород.

Рис. 2. Локализация однонуклеотидных полиморфизмов, значимо ассоциированных с показателем высоты в холке у российских локальных и трансграничных пород крупного рогатого скота ( Bos taurus taurus ): А — 4-я хромосома, Б — 14-я хромосома; горизонтальные линии — пороговые значения отрицательного логарифма.

• 2.    Гены, обнаруженные в регионе локализации однонуклеотидных полиморфизмов, значимо ассоциированных с высотой в холке у российских локальных и трансграничных пород крупного рогатого скота ( Bos taurus taurus )

3. Частоты аллелей в локусах, значимо связанных с признаком высоты в холке, у российских локальных и трансграничных пород крупного рогатого скота ( Bos taurus taurus )

Название SNP Хромосома Позиция Регион, Mb      Гены	Признаки
Hapmap53144-ss46525999    4-я     77555681   77,3-77,8 PURB , MIR4657 ,	Продолжительность бе-

BovineHD0400021479       4-я     77613816             H2AFV , PPIA , ZMIZ2 , ременности, синтез

OGDH , TMED4 , ARS-BFGL-NGS-116590    4-я     77635835             DDX56 , NPC1L1 , NUDCD3 , CAMK2B , YKT6 BovineHD1400007259        14-я    25015640 24,8-25,2 LYN , RPS20 , MOS , PLAG1 , CHCHD7 , SDR16C5 , SDR16C6

компонентов молока, белковый и жировой обмен, среднесуточный прирост массы Рост, конституция, потребление корма, фертильность

Мы провели поиск генов, расположенных на участке ±200 Kb от обнаруженных SNP (табл. 2). В проведенных ранее исследованиях было показано, что регион 24,8-25,2 Mb на 14-й хромосоме содержит гены, для которых установлена связь с размерами тела (42, 43), потреблением корма (44, 45) и фертильностью (46). На 4-й хромосоме в регионе 77,3-77,8 Mb выявлены гены, связанные с обменом веществ (47), составом (48, 49) и синтезом (50) молока, среднесуточным приростом живой массы (51). S.M. Ghoreishifar с соавт. (52) изучали следы селекции в группе из пяти пород КРС, происходящих из северной, средней и южной частей Швеции. Участки генома с наиболее значимыми сигналами отбора обнаружены на BTA5 (105,75106,52 Mbp), BTA1 (2,25-2,52 Mbp) и BTA14 (24,42-25,11 и 25,35-25,73 Mbp). Аннотация генов в этих регионах выявила как уже известные, так и новые гены-кандидаты, ассоциированные с высотной гипоксией ( DCAF8 , PPP1R12A, SLC16A3 , UCP2 , UCP3 , TIGAR ), акклиматизацией к холоду ( AQP3 , AQP7 , HSPB8 ), размером тела и ростом ( PLAG1 , KCNA6 , NDUFA9 , AKAP3 , C5H5112orf1 , RAD51AP1 , FGF6 , TIGAR , CCND2 , CSMD3 ), устойчивостью к болезням и бактериальным инфекциям ( CHI3L2 , GBP6 , PPFIBP1 , REP15 , CYP4F2 , TIGD2 , PYURF , SLC10A2 , FCHSD2 , ARHGEF17 , RELT , PRDM2 , KDM5B ), с репродуктивными качествами ( PPP1R12A , ZFP36L2 , CSPP1 ), удоем и составом молока ( NPC1L1 , NUDCD3 , ACSS1 , FCHSD2 ).

Наши данные согласуются с опубликованными ранее, при этом регионы, описанные в предыдущих работах и расположенные на других хромосомах (53-55), не были выявлены в нашей выборке. Интересно, что в проведенных другими авторами исследованиях, в том числе с использованием контрастных пород, не обнаружено ассоциаций SNP, расположенных в регионе 77,3-77,8 Mb на BTA4, с высотой в холке (56-58).

Для выявленных SNP были рассчитаны частоты встречаемости альтернативных аллелей в каждой из пород (табл. 3).

Порода	Группа	4-я хромосома						14-я хромосома
		ARS-BFGL-NGS-116590		Hapmap53144-ss46525999		BovineHD0400021479		BovineHD1400007259
		T	G a	T a	] C	A	G a	T	1 G a
HLS	High	0,82	99,18	99,18	0,82	0,82	99,18	0,54	99,46
BLW	High	1,00	99,00	99,00	1,00	1,00	99,00	0,00	100,00
KHL	High	23,08	76,92	76,92	23,08	23,08	76,92	13,46	86,54
ANG	High	62,82	37,18	36,84	63,16	62,82	37,18	0,00	100,00
TAG	High	26,92	73,08	73,08	26,92	26,92	73,08	9,62	90,38
AYR	High	28,47	71,53	71,53	28,47	28,47	71,53	21,88	78,13
IST	High	45,00	55,00	54,55	45,45	36,36	63,64	9,52	90,48
YRS	High	45,12	54,88	55,00	45,00	45,12	54,88	17,50	82,50
KLM	Low	95,83	4,17	3,85	96,15	96,15	3,85	94,23	5,77
JRS	Low	95,31	4,69	4,69	95,31	95,31	4,69	100,00	0,00
KRG	Low	72,92	27,08	29,17	70,83	52,27	47,73	85,42	14,58
YKT	Low	98,28	1,72	0,00	100,00	87,50	12,50	98,28	1,72
MNG	Low	100,00	0,00	6,25	93,75	89,58	10,42	100,00	0,00

Примечание. HLS — голштинская, BLW — черно-пестрая, KHL — холмогорская, ANG — абердин-ангусская, TAG — тагильская, AYR — айрширская, IST — истобенская, YRS — ярославская, KLM — калмыцкая, JRS — джерсейская, KRG — киргизский скот, YKT — якутская, MNG — монгольский скот; Low — породы, для которых средние значения высоты в холке не превышали средних значений, рассчитанных для всего массива; High — породы, для которых средние значения показателя превышали средние значения выборки, относили к высокорослым; ^a — аллели, связанные с высоким ростом у крупного рогатого скота.

Наиболее существенные различия между частотами альтернативных аллелей наблюдались в группе низкорослых пород: в локусе ARS-BFGL-NGS-116590 частоты аллелей G / T варьировали соответственно от

0 до 27,08 % и от 72,92 до 100 %; в локусе Hapmap53144-ss46525999 частоты аллелей T / C — от 0 до 29,17 % и от 70,83 до 100 %; в локусе BovineHD1400007259 частоты аллелей G / T — от 0 до 14,58 % и от 85,42 до 100 %. У высокорослых пород наибольшая разница в частотах аллелей T / G (соответственно 0 и 100 %) наблюдалась в локусе BovineHD1400007259 у животных черно-пестрой и абердин-ангусской пород.

Оценить статистическую значимость различий между частотами альтернативных аллелей для каждой исследуемой породы в отдельности не удалось в связи с отсутствием в некоторых породах одного из аллелей, поэтому такая оценка была проведена для групп, сформированных по разным признакам (табл. 4).

4. Статистическая значимость различий между частотами альтернативных аллелей в локусах, связанных с признаком высоты в холке, в разных группах российских локальных и трансграничных пород крупного рогатого скота ( Bos taurus taurus )

Группа пород	4-я хромосома			14-я хромосома
	ARS-BFGL-NGS-116590	Hapmap53144-ss46525999	BovineHD0400021479	BovineHD1400007259
	T 1 G a 1 p	T a C 1 p	A 1 G a 1 p	T     G aпp

Высокорослые	0,204	0,796	***	0,795	0,205 ***	0,201	0,799	***	0,090	0,910	***
Низкорослые	0,349	0,651	***	0,082	0,918 **	0,309	0,647	***	0,959	0,041
Мясные	0,839	0,161		0,168	0,832	0,77	0,230		0,687	0,313	***
Молочные	0,218	0,782	***	0,781	0,219 ***	0,215	0,785	***	0,152	0,848	***
Заводские	0,276	0,724	***	0,721	0,279 ***	0,275	0,725	***	0,177	0,823	***
Примитивные	0,909	0,091	***	0,112	0,888 ***	0,777	0,223	***	0,948	0,052
Трансграничные	0,256	0,744	***	0,740	0,260 ***	0,259	0,741	***	0,187	0,813	***
Российские	0,486	0,514	*	0,514	0,486 *	0,448	0,552		0,306	0,694	***

Примечание. ^a — аллели, связанные с высоким ростом у крупного рогатого скота.

* p < 0,05, ** p < 0,01; *** p < 0,001, пропуски означают, что статистически значимые различия отсутствуют.

В большинстве случаев частоты альтернативных аллелей в исследованных группах статистически значимо различались. Исключение составила группа мясного скота по всем трем SNP, обнаруженным на BTA4. Кроме того, частоты в SNP BovineHD1400007259 не отличались от теоретически ожидаемых в группе примитивного скота. Такая же ситуация наблюдается в группе низкорослого скота. Это может быть связано с тем, что три из пяти формирующих ее пород, относятся к примитивному скоту (киргизский и монгольский скот, якутская порода). Интересно отметить, что у абердин-ангусской породы, несмотря на то, что она была отнесена к группе крупных пород, в распределении частот аллелей на 4-й хромосоме наблюдались те же тенденции, что и в группе мелких пород.

С высокими значениями высоты в холке связан аллель G в локусе BovineHD0400021479, аллель G в локусе ARS-BFGL-NGS-116590, аллель G в локусе BovineHD1400007259 и аллель Ò в локусе Hapmap53144-ss46525999. Для SNP BovineHD1400007259, расположенного внутри гена PLAG1 , частоты аллеля G , связанного с высоким ростом, согласовывались с полученными в предыдущих исследованиях для голштино-фризской и джерсейской пород (25). Ранее J. Hou с соавт. (58) изучали связь SNP rs109815800 (AC_000171.1: g.25015640, G >  T , обозначенный на чипе как BovineHD1400007259) в гене PLAG1 с ростом крупного рогатого скота. Результаты анализа показали, что животные с генотипом T / T были ниже ростом, чем особи с генотипами T / G или G / G (p < 0,001).

Выявлена статистически значимая корреляция между частотами альтернативных аллелей и показателем высоты в холке для всех обнаруженных однонуклеотидных полиморфизмов (табл. 5). Почти во всех группах пород установлены статистически значимые корреляции между частотами аллелей, связанных с высоким ростом в холке, и высотой в холке. Интересно, что для группы низкорослых пород, против ожидания, не выявлено достоверной отрицательной корреляции в локусе BovineHD1400007259.

• 5.    Оценка корреляционных взаимодействий между показателем высоты в холке и частотой альтернативных аллелей в локусах, связанных с признаком высоты в холке, в разных группах российских локальных и трансграничных пород крупного рогатого скота ( Bos taurus taurus )

Группа пород	4-я хромосома						14-я хромосома
	ARS-BFGL-NGS-116590		Hapmap53144-ss46525999		BovineHD0400021479		BovineHD1400007259
	T / G a	p	T a/ C 1	p	A / G a	p	T / G a	p
Высокорослые	0,722	***	0,719	***	0,708	***	0,678	***
Низкорослые	- 0,172		- 0,281		- 0,498	**	- 0,063
Мясные	0,530	***	0,456	*	0,090		0,767	***
Молочные	0,908	***	0,908	***	0,907	***	0,751	***
Заводские	0,829	***	0,827	***	0,821	***	0,729	***
Примитивные	0,962	***	0,859	***	0,96	***	0,975	***
Трансграничные	0,876	***	0,875	***	0,876	***	0,840	***
Российские	0,981	***	0,982	***	0,989	***	0,971	***
Вся выборка	0,838	***	0,826	***	0,752	**	0,854	***

Примечание. a — аллели, связанные с высоким ростом у крупного рогатого скота. Коэффициенты корреляции показаны для аллеля, связанного с высоким ростом в холке.

* p < 0,05, ** p < 0,01; *** p < 0,001, пропуски означают, что статистически значимые различия отсутствуют.

Таким образом, идентифицированы однонуклеотидные полиморфизмы ARS-BFGL-NGS-116590, Hapmap53144-ss46525999, BovineHD0400021479 и BovineHD1400007259, локализованные, согласно сборке генома UMD 3.1.1, на 4-й и 14-й хромосомах и ассоциированные с высотой в холке у крупного рогатого скота, разводимого на территории Российской Федерации. Частоты выявленных SNP в разных группах пород значимо отличались от случайно возможных. Альтернативные аллели в обнаруженных SNP имели статистически значимые положительные либо отрицательные корреляции с показателем высоты в холке. Следовательно, можно сделать вывод о неодинаковом селекционном давлении на эти локусы для разных групп пород. Многообразие и разнородность пород, представленных в выборке, позволяет рассматривать выявленные следы селекции как характерные не для одной породы, региона или направления продуктивности, а для группы пород вида Bos taurus taurus , распространение которых от центра одомашнивания шло по Дунайскому пути.