Полногеномное секвенирование и сравнительный анализ генов «домашнего хозяйства» и вирулентности у коммерческих штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидным действием
Автор: Сафронова В.И., Сазанова А.Л., Кузнецова И.Г., Попова Ж.П., Гришечкина С.Д., Ермолова В.П., Андронов Е.Е.
Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology
Рубрика: Разнообразие и эволюция микробно-растительных систем
Статья в выпуске: 3 т.50, 2015 года.
Бесплатный доступ
Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) поддерживает 37 штаммов Bacillus thuringiensis, обладающих выраженной энтомоцидной активностью и используемых для производства препаратов фитозащитного действия (битоксибациллин, бактокулицид, бацикол). Эффективность производимых биопрепаратов зависит от качества микробного материала. Контроль за чистотой и аутентичностью коммерческих штаммов может осуществляться с помощью их молекулярно-гене-тической паспортизации. В настоящее время наиболее эффективной технологией доскональной генетической характеристики штаммов микроорганизмов считается полногеномное секвенирование. Однако, несмотря на несомненную востребованность полногеномного секвенирования для паспортизации коммерческих штаммов, ее широкое применение ограничивается значительной трудозатратностью и себестоимостью. Поэтому для удешевления анализа и сокращения сроков его выполнения необходима разработка экспресс-методов высокопроизводительного секвенирования. Одним из решений может быть анализ не всего генома, а наиболее таксономически и функционально значимых генетических локусов (так называемого референт-комплекса). Целью нашей работы стало выявление референт-комплексов у 10 штаммов B. thuringiensis разных серотипов. После проведения высокопроизводительного пиросеквенирования штаммов и получения полногеномных последовательностей был проведен их сравнительный анализ и найдены наиболее дивергентные генетические локусы, определяющие уникальность штаммов. Использовали программу BioNumerics («Applied Maths», США); для построения дендрограмм, отражающих филогенетическое родство между исследуемыми штаммами, суммы последовательностей отобранных генов «домашнего хозяйства» и отдельно генов вирулентности обрабатывали с помощью программы MEGA v. 5.0 (метод Neighbour-Joining). В результате были отобраны 10 генов «домашнего хозяйства» ( glpT, glpF, pyrE, purF, purH, pta, gyrB, ftsA, panC и isd ), а также 8 генов вирулентности ( hblA, hblC, hblD, nheA, nheC, capA, capC и inA ). Для каждого штамма сконструированы два референт-комплекса, представляющих собой сумму последовательностей отобранных локусов «домашнего хозяйства» и отдельно генов вирулентности. Общий размер референт-комплексов составлял соответственно 11809 и 10094 п.н. Полученные результаты будут использованы в дальнейшей работе для создания системы праймеров с целью проведения мультиплексного анализа референт-комплексов в условиях высокопроизводительного секвенирования и разработки экспресс-метода генетической паспортизации коммерческих штаммов B. thuringiensis.
Полногеномное секвенирование, гены "домашнего хозяйства" и вирулентности, генетическая паспортизация
Короткий адрес: https://sciup.org/142133594
IDR: 142133594 | DOI: 10.15389/agrobiology.2015.3.332rus
Текст научной статьи Полногеномное секвенирование и сравнительный анализ генов «домашнего хозяйства» и вирулентности у коммерческих штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидным действием
Основу любой микробной технологии составляет штамм микроорганизма, обладающий ярко выраженным практически ценным (целевым) свойством. Культивирование штаммов при лабораторном хранении и особенно производственного процесса зачастую сопровождается потерей целевых свойств и контаминацией (загрязнением) вплоть до полного замещения контаминантом. В результате может использоваться микробный материал ненадлежащего качества, что приводит к снижению эффективности выпускаемой продукции, а также к риску использования при ее производстве патогенных микроорганизмов. Контроль за чистотой и аутентичностью коммерческих штаммов может осуществляться с помощью их молекулярно-генетической паспортизации. Для этой цели в настоящее
∗ Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение ¹ 14.604.21.0024, RFMEFI60414X0024).
время привлекаются новейшие молекулярно-генетические методы, такие как анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов ДНК (AFLP фингерпринтинг) (1), метод пульс-электрофореза (2, 3), а также высокопроизводительное полногеномное секвенирование (4-8). Указанные приемы позволяют выявить уникальные особенности культур микроорганизмов, которые могут быть использованы для создания штаммоспецифичных паспортов. Полногеномное секвенирование сейчас признано наиболее эффективной технологией доскональной генетической характеристики штаммов микроорганизмов. Однако, несмотря на несомненную востребованность полногеномного секвенирования для паспортизации коммерческих штаммов, ее широкое применение ограничивается значительной трудозатратностью и себестоимостью. Поэтому для оперативного контроля за качеством микробного материала на базе высокопроизводительного секвенирования необходимо разработать экспресс-методы с целью удешевления анализа и сокращения сроков его выполнения. Одним из возможных решений может быть анализ не всего генома, а наиболее таксономически и функционально значимых генетических локусов (так называемого референт-комплекса).
Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Всероссийского НИИ сельскохозяйственных микроорганизмов (ВНИИСХМ) (ВКСМ) поддерживает 37 штаммов B. thur-ingiensis , обладающих выраженной энтомоцидной активностью и используемых для производства препаратов фитозащитного действия (битоксиба-циллин, бактокулицид, бацикол).
Целью работы было получение полногеномных последовательностей для 10 штаммов Bacillus thuringiensis разных серотипов, проведение их сравнительного анализа и поиск наиболее дивергентных генетических локусов для последующей разработки экспресс-метода достоверной аутентификации коммерческих штаммов этого вида.
Методика. Штаммы Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, B. thur-ingiensis subsp. darmstadiensis и B. thuringiensis var. israelensis культивировали на мясопептонном агаре (МПА) при 28 °С (9). Штаммы размещены в УНУ «Станция низкотемпературного автоматизированного хранения биологических образцов» ВКСМ (10). Информация о штаммах доступна в базе данных ВКСМ на сайте ВНИИСХМ .
Для выделения бактериальной ДНК отбирали по 3 мл ночных культур штаммов в мясопептонном бульоне (МПБ) (9), клетки осаждали центрифугированием при 13400 об/мин в течение 2 мин. Осадок промывали 1 мл буфера 1 (25 мМ TrisHCl pH = 8,0; 10 мМ EDТА) и повторно центрифугировали. Ресуспендировали осадок в 100 мкл лизирующей смеси, содержащей 960 мкл буфера 1, 3 мг лизоцима и 25 мкл РНКазы (10 мг/мл) и инкубировали 20 мин при 37 ° С. Добавляли к смеси 500 мкл протеиназы К в буфере 2 (10 мМ TrisHCl pH = 8,0; 5 мМ EDТА; 0,5 % SDS) и инкубировали 30 мин при 55 ° С. Приливали 60 мкл 3 М ацетата натрия и 750 мкл смеси фенол:хлороформ (1:1), встряхивали на вортексе 5 мин и центрифугировали при 14000 об/мин 10 мин. Переносили супернатант в чистые пробирки, добавляли 750 мл смеси фенол:хлороформ (24:1), встряхивали на вортексе в течение 5 мин и повторно центрифугировали. Переносили супернатант в чистые пробирки, добавляли равный объем изопропилового спирта, аккуратно перемешивали в течение 5 мин и центрифугировали при 13400 об/мин 10 мин. Отделяли супернатант, осадок промывали 70 % этанолом и высушивали. К осадку добавляли 50 мкл
H 2 O MQ, перемешивали и прогревали при 65 ° С в течение 5 мин. Доочистку выделенной ДНК проводили с помощью набора AxyPrep Multisource Genomic DNA miniprep Kit («Axygen», США) в соответствии с рекомендациями производителя.
Концентрацию и степень чистоты ДНК оценивали на спектрофотометре SpectroStar Nano («BMG Labtech GMbH»,Германия) при четырех длинах волн — 230, 260, 280 и 340 нм. Нуклеотидную последовательность геномной ДНК определяли на пиросеквенаторе Junior GS («Roche Applied Science», Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Работу по сборке ридов выполняли с помощью программы CLC Genomics Workbench 7.5.1 («CLC bio QIAGEN», Германия, .
Для выявления наиболее дивергентных локусов последовательности генов «домашнего хозяйства» и вирулентности штаммов B. thuringiensis сравнивали с помощью программы BioNumerics («Applied Maths», США). Для построения дендрограмм, отражающих филогенетическое родство между исследуемыми штаммами, суммы последовательностей отобранных генов «домашнего хозяйства» и отдельно генов вирулентности обрабатывали с помощью программы MEGA v. 5.0 (метод Neighbour-Joining).
Результаты . Для изучения были отобраны коммерчески ценные штаммы B. thuringiensis , обладающие выраженным энтомоцидным действием. Биологическая характеристика штаммов приведена в таблице 1.
1. Биологическая характеристика сравниваемых штаммов Bacillus thuringien-sis разных серологических групп
|
¹ штамма |
Объект выделения |
Титр спор, ½10 9 /мл КЖ |
Содержание экзотоксина (ЛК 50 , мкл/г корма для L2 комнатной мухи) |
Энтомоцидная активность ЛК 50 , % |
|
|
для L2 колорадского жука |
для L4 комара желтолихорадочного (½10 -3 ) |
||||
|
12 |
Труп колорадского жука |
B. thuringiensis var. thuringiensis 2,79 3,4 0,22 |
– |
||
|
20 |
Больная гусеница капустной совки |
2.58 |
4,0 |
0,26 |
– |
|
40 |
Почва капустного поля |
2,42 |
4,29 |
0,32 |
– |
|
800/19 |
Труп гусеницы капустной белянки |
2,72 |
3,78 |
0,28 |
– |
|
79 |
Труп колорадского жука |
B. thuringiensis subsp . darmstadiensis 1,98 5,86 0,42 |
– |
||
|
109 |
Личинка колорадского жука |
2,78 |
4,28 |
0,36 |
– |
|
109/4 |
Реизоляция из личинки колорадского жука |
3,08 |
3,8 |
0,32 |
– |
|
109/57 |
Реизоляция из личинки колорадского жука |
3,25 |
3,6 |
0,27 |
– |
|
38 |
Аедогенный водоем (вода) |
B. thuringiensis var. israelensis 2,81 – – |
0,24 |
||
|
44 |
Анофелогенный водоем (почва) |
3,28 |
– |
– |
0,16 |
П р и м еч ани е. КЖ — культуральная жидкость. Прочерки означают, что определение не проводили.
Штаммы B. thuringiensis var. thuringiensis активны против колорадского жука и чешуекрылых вредителей сельскохозяйственных культур, в то время как B. thuringiensis subsp. darmstadiensis действуют в основном против жесткокрылых насекомых-фитофагов (колорадский жук, крестоцветные блошки, рапсовый цветоед, восточный горчичный листоед, землянично-малинный долгоносик и др.). Представители B. thuringiensis var. israelensis обладают ларвицидной активностью и действуют против комаров. Два штамма из анализируемых (109/4 и 109/57) — варианты штам- ма B. thuringiensis subsp. darmstadiensis 109, отобранные в результате селекции (см. табл. 1).
После получения полногеномных последовательностей штаммов B. thuringiensis разных серотипов был проведен их сравнительный анализ и поиск наиболее дивергентных генетических локусов. Объектами сравнения были гены, определяющие вирулентность штаммов, а также гены, необходимые для поддержания важнейших жизненных функций клеток микроорганизмов (так называемые гены «домашнего хозяйства»). В результате отобрали 10 генов «домашнего хозяйства» ( glpT , glpF , pyrE , purF , purH , pta , gyrB , ftsA , panC и isd ), а также 8 генов вирулентности ( hblA , hblC , hblD , nheA , nheC , capA , capC и inA ) (табл. 2).
-
2. Гены «домашнего хозяйства» и вирулентности, исследованные при сравнительном анализе полногеномных последовательностей у 10 штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидной активностью
Ген
Размер фрагмента, п.н.
Кодируемый белок
Ссылка
Гены «домашнего хозяйства»
glpT
1350
glycerol-3-phosphate permease
(11)
glpF
837
glycerol uptake facilitator protein
(12, 14)
pyrE
633
orotate phosphoribosyltransferase
(11)
purF
1416
glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase
(13)
purH
1536
phosphoribosylaminoimidazole carboxamide formyltransferase
(14)
pta
972
phosphate acetyltransferase
(12, 14)
gyrB
1883
DNA gyrase subunit B
(15)
ftsA
1308
cell division protein
(11)
panC
849
pantoate-beta-alanine ligase
(13)
isd
1025
iron-regulated surface determinant protein
Настоящая статья
Гены вирулентности
hblA
1388
hemolytic enterotoxin hemolysin A
(16, 17)
hblC
1340
hemolytic enterotoxin hemolysin C
(16, 17)
hblD
1221
hemolytic enterotoxin hemolysin D
(17)
nheA
1161
nonhemolytic enterotoxin A
(16)
nheC
1080
nonhemolytic enterotoxin C
(16)
capA
748
capsular polysaccharide A
(18)
capC
768
capsular polysaccharide C
(18)
inA
2388
metalloprotease
(18)
-
3. Число различающихся нуклеотидов в референт-комплексах генов «домашнего хозяйства» у 10 штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидной активностью при парном сравнении
Штамм
var. thuringiensis
subsp. darmstadiensis
var. israelensis
40
] 12 1
20
800/19
109
1 109/4 1
109/57
79
38
44
40
12
12
20
27
15
800/19
18
6
21
109
352
345
360
350
109/4
357
351
366
343
7
109/57
354
346
361
351
3
8
79
346
339
354
344
20
25
21
38
414
399
424
414
188
195
191
190
44
413
408
423
414
192
199
195
194
24
Указанные локусы, за исключением гена isd , использовались ранее другими авторами для генотипирования и изучения биоразнообразия штаммов B . cereus и B . thuringiensis (11-18). Высокий уровень генетической дивергенции в локусе isd был выявлен нами в проведенном исследовании. Для каждого штамма сконструировали два референт-комплекса, представляющих собой сумму последовательностей отобранных локусов «домашнего хозяйства» и отдельно генов вирулентности. Общий размер референт-комплексов составлял соответственно 11809 и 10094 п.н. Данные по числу различающихся нуклеотидов в референт-комплексах у изученных
-
4. Число различающихся нуклеотидов в референт-комплексах генов вирулентности у 10 штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидной активностью при их парном сравнении
Штамм
var. thuringiensis
subsp. darmstadiensis
var. israelensis
40
12 1
20
800/19
109
1 109/4 1
109/57
79
38
44
40
12
18
20
8
12
800/19
15
3
9
109
296
300
292
299
109/4
296
300
292
299
0
109/57
296
300
292
299
0
0
79
276
279
270
277
229
229
229
38
385
389
379
386
420
420
420
394
44
383
399
389
396
429
429
429
403
29
штаммов B. thuringiensis при их парном сравнении представлены в таблицах 3 и 4. Можно видеть, что наиболее гомологичными по генам «домашнего хозяйства» были штаммы 109, 109/4 и 109/57 B . thuringiensis subsp. darmstadiensis (3-8 различающихся нуклеотидов), а также штаммы 12, 20 и 800/19 B. thuringiensis var. thuringiensis , имеющие от 6 до 21 различающегося нуклеотида (см. табл. 3). По генам вирулентности штаммы 109, 109/4 и 109/57, которые представляют собой варианты одного штамма, были идентичны, в то время как близкородственные штаммы 12, 20 и 800/19 имели от 3 до 12 различающихся нуклеотидов (см. табл. 4).
Более наглядно филогенетическое родство исследованных штаммов B . thuringiensis демонстрировали дендрограммы, полученные на основе анализа референт-комплексов генов «домашнего хозяйства» и вирулентности (рис. 1 и 2) . Можно видеть, что в обоих случаях штаммы группируются в строгом соответствии с их систематическим положением и серотипом, что свидетельствует о высокой таксономической значимости использованных локусов.
-
B. thuringiensis subsp . darmstadiensis
100 B. thuringiensis subsp .darmstadiensis
B. thuringiensis subsp . darmstadiensis
B. thuringiensis subsp . darmstadiensis
B. thuringiensis var. israelensis 38
100 B. thuringiensis var . israelensis 44
B thuringiensis var . thuringiensis 40
B thuringiensis var . thuringiensis 12
B thuringiensis var . thuringiensis 20
B thuringiensis var . thuringiensis 800/19
0,002
Рис. 1. Дендрограмма штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидной активностью, построенная на основе анализа референт-комплекса, который включает гены «домашнего хозяйства» glpT , glpF , pyrE , purF , purH , pta , gyrB , ftsA , panC и isd .
B thuringiensis var . thuringiensis 12
B thuringiensis var . thuringiensis 20
B thuringiensis var . thuringiensis 800/19
B thuringiensis var . thuringiensis 40
B. thuringiensis subsp . darmstadiensis 79
B. thuringiensis subsp . darmstadiensis 109
100 I B. thuringiensis subsp . darmstadiensis 109/4
B. thuringiensis subsp . darmstadiensis 109/57
______ Г" B. thuringiensis var . israelensis 38
-
100 B. thuringiensis var . israelensis 44
0,005
Рис. 2. Дендрограмма штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидной активностью, построенная на основе анализа референт-комплекса, который включает гены вирулентности hblA , hblC , hblD , nheA , nheC , capA , capC и inA.
Таким образом, в результате сравнительного анализа полногеномных последовательностей у 10 штаммов Bacillus thuringiensis разных серотипов выявлены уникальные гены «домашнего хозяйства» и вирулентности, секвенирование которых позволит проводить оперативную аутентификацию коммерческих штаммов этого вида для контроля за качеством микробного материала при производстве биопрепаратов эн-томоцидного действия.
Список литературы Полногеномное секвенирование и сравнительный анализ генов «домашнего хозяйства» и вирулентности у коммерческих штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидным действием
- Paun O., Schönswetter P. Amplified fragment length polymorphism: an invaluable fingerprinting technique for genomic, transcriptomic, and epigenetic studies. Methods Mol. Biol., 2012, 862: 75-87 ( ) DOI: 10.1007/978-1-61779-609-8_7
- Leblond P., Decaris B. Сhromosome geometry and intraspecific genetic polymorphism in Gram-positive bacteria revealed by pulsed-field gel Electrophoresis. Electrophoresis, 1998, 19(4): 582-588.
- Насонова Е.С. Пульс-электрофорез: теория метода, инструментальный арсенал и области применения. Цитология, 2008, 50(11): 927-935.
- Bull-Otterson L., Feng W., Kirpich I., Wang Y., Qin X., Liu Y., Gobejishvili L., Joshi-Barve S., Ayvaz T., Petrosino J., Kong M., Barker D., McClain C., Barve S. Metagenomic analyses of alcohol induced pathogenic alterations in the intestinal microbiome and the effect of Lactobacillus rhamnosus GG treatment. PLoS ONE, 2013, 8(1): e53028 ( ) DOI: 10.1371/journal.pone.0053028
- Džunková M., D’Auria G., Pérez-Villarroya D., Moya A. Hybrid sequencing approach applied to human fecal metagenomic clone libraries revealed clones with potential biotechnological applications. PLoS ONE, 2012, 7(10): e47654 ( ) DOI: 10.1371/journal.pone.0047654
- White J., Gilbert J., Hill G., Hill E., Huse S.M., Weightman A.J., Mahenthiralingam E. Culture-independent analysis of bacterial fuel contamination provides insight into the level of concordance with the standard industry practice of aerobic cultivation. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77(13): 4527-4538 ( ) DOI: 10.1128/AEM.02317-10
- Nacke H., Thürmer A., Wollherr A., Will C., Hodac L., Herold N., Schöning I., Schrumpf M., Daniel R. Pyrosequencing-based assessment of bacterial community structure along different management types in German forest and grassland soils. PLoS ONE, 2011, 6(2): e17000 ( ) DOI: 10.1371/journal.pone.0017000
- Petrosino J.F., Highlander S., Luna R.A., Gibbs R.A., Versalovic J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem., 2009, 55(5): 856-866 ( ) DOI: 10.1373/clinchem.2008.107565
- Сафронова В.И., Оследкин Ю.С., Свиридова О.В., Воробьев Н.И. Методы консервации коллекционных культур микроорганизмов. СПб, 2007.
- Safronova V., Tikhonovich I. Automated cryobank of microorganisms: Unique possibilities for long-term authorized depositing of commercial microbial strains. In: Microbes in applied research: current advances and challenges/A. Mendez-Vilas (ed.). World Scientific Publishing Co., 2012: 331-334 () DOI: 10.1142/9789814405041_0066
- Helgason E., Tourasse N.J., Meisal R., Caugant D.A., Kolsto A.B. Multilocus sequence typing scheme for bacteria of the Bacillus cereus group. Appl. Environ. Microbiol., 2004, 70: 191-201 ( ) DOI: 10.1128/AEM.70.1.191-201.2004
- Barker M., Thakker B., Priest F.G. Multilocus sequence typing reveals that Bacillus cereus strains isolated from clinical infections have distinct phylogenetic origins. FEMS Microbiol. Lett., 2005, 245: 179-184.
- Sorokin A., Candelon B., Guilloux K., Galleron N., Wackerow-Kouzova N., Ehrlich S.D., Bourguet D., Sanchis V. Multiple-locus sequence typing analysis of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis reveals separate clustering and a distinct population structure of psychrotrophic strains. Appl. Environ. Microbiol., 2006, 72: 1569-1578 ( ) DOI: 10.1128/AEM.72.2.1569-1578.2006
- Soufiane B., Baizet M., Côté J.C. Multilocus sequence analysis of Bacillus thuringiensis serovars navarrensis, bolivia and vazensis and Bacillus weihenstephanensis reveals a common phylogeny. Antonie Van Leeuwenhoek, 2013, 103(1): 195-205 ( ) DOI: 10.1007/s10482-012-9800-5
- Ko K.S., Kim J.W., Kim J.M., Kim W., Chung S.I., Kim I.J., Kook Y.H. Population structure of the Bacillus cereus group as determined by sequence analysis of six housekeeping genes and the plcR gene. Infect. Immun., 2004, 72: 5253-5261 ( ) DOI: 10.1128/IAI.72.9.5253-5261.2004
- Rahimi E., Abdos F., Momtaz H., Baghbadorani Z.T., Jalali M. Bacillus cereus in infant foods: prevalence study and distribution of enterotoxigenic virulence factors in Isfahan Province, Iran. Scientific World Journal, 2013, 2013: 292571 ( ) DOI: 10.1155/2013/292571
- Kim Y.R., Batt C.A. Riboprint and virulence gene patterns for Bacillus cereus and related species. J. Microbiol. Biotechnol., 2008, 18(6): 1146-1155.
- Zahner V., Silva A.C., De Moraes G.P., McIntosh D., De Filippis I. Extended genetic analysis of Brazilian isolates of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Mem. Inst. Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro), 2013, 108(1): 65-72.
