Полногеномный поиск ассоциаций однонуклеотидных полиморфизмов с шириной груди у овец северокавказской мясо - шерстной породы

Растущий в мире спрос на баранину ставит перед селекционерами задачу повышения мясной продуктивности имеющихся пород овец. Одним из перспективных подходов к решению этой задачи является использование методов маркер-ассоциированной селекции по аллелям генов, влияющих на мясную продуктивность. Ранее был выявлен ряд генов, связанных с количественными и качественными признаками мясной продуктивности овец: MSTN (myostatin) [Aiello et al., 2018; Osman et al., 2021], MYOD1 (myogenic differentiation 1) [Sousa-Junior et al., 2022], FST (follistatin) [Nissinen et al., 2021] и др. Однако кроме них в развитии мышечной ткани участвует большое число генов, влияние которых может быть относительно невелико. Многие из них на данный момент ещё не выявлены, т.к. параметры мясной продуктивности в значительной степени зависят от факторов окружающей среды, что маскирует эффект экспрессии отдельных генов [Tobar et al., 2020].

Одним из наиболее эффективных методов поиска новых генов-кандидатов является полногеномный поиск ассоциаций (GWAS). Он основывается на обработке результатов генотипирования животных по отдельным однонуклеотидным полиморфизмам (SNP), проведённого с использованием ДНК-биочипов [Benavides et al., 2018]. С его помощью на данный момент удалось выявить ряд геномных регионов и предложить гены-кандидаты, ассоциированные с экономически важными признаками у овец [Gebreselassie et al., 2019].

Поскольку для овец характерна высокая экологическая пластичность, генетические маркеры продуктивности могут отличаться у отдельных пород из-за того, что их селекция проводилась в разных условиях окружающей среды. В связи с этим перспективным является поиск генов-кандидатов у пород, приспособленных к определенным условиям содержания и кормления [Яцык, 2017].

Одной из таких пород, разводимых на территории Ставропольского края, является Северокавказская мясо-шерстная, выведенная в условиях засушливых степей Юга России. Овцы этой породы легко приспосабливаются к различным условиям разведения и характеризуются достаточно высокой мясной продуктивностью: бараны-производители имеют среднюю массу более 100 кг, а ярки – 60 кг. Для породы характерна дисперсия фенотипа мясных форм, что указывает на высокое генетическое разнообразие и возможности селекции в направлении увеличения мясной продуктивности животных [Омаров, Гайда-шов, 2021]. Одним из важных промеров, характеризующих мясную продуктивность у овец, является ширина груди, определяющая поперечный размер туши и степень развития сердечно-легочной системы у животного. Он важен для оценки овец при селекционном отборе, и выявление его генетической основы позволит использовать новые молекулярные маркеры для улучшения породы.

В связи с вышеизложенным, целью нашего исследования стали поиск SNP, ассоциированных с параметром «ширина груди» и выявление новых генов-кандидатов продуктивности у овец Северокавказской мясо-шерстной породы.

Объекты и методы исследования

Объектом исследования служили бараны (n=50) Северокавказской мясо-шерстной породы в возрасте 12 месяцев, разводимые в СПК «Племенной завод Восток» Степновского р-на Ставропольского края. Все животные были клинически здоровы, не стрижены, содержались в оптимальных условиях и получали полноценный рацион [Абонеев и др., 2009]. Забор крови для выделения ДНК проводился Зуевым Р.В. и Криворучко О.Н. в феврале-марте 2018 г. Кровь, отобрали из яремной вены в асептических условиях.

Лабораторные исследования проведены Криворучко А.Ю. и Лиховид Н.Г. на базе лабораторий ВНИИОК – филиала ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ» и ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный университет».

Выделение тотальной ДНК проводилось при помощи набора Pure Link Genomic DNA MiniKit (Invitrogen Life Technologies, США) согласно протоколу производителя. Генотипирование животных осуществляли с использованием ДНК-биочипов Ovine Infinium HD BeadChip 600K (Illumina Inc., Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя. Первоначальная обработка результатов генотипирования проведена с помощью программы Genome Studio 2.0 (Illumina Inc., Калифорния, США).

Контроль качества генотипирования выполнен с помощью программы PLINK V.1.07. В обработку данных были включены образцы с показателем количества обнаруженных SNP (Call Rate) более 0,95, полиморфизмы, имеющие физическую локализацию и частоту минорных аллелей более 0,01. Из 606 006 генотипированных SNP для дальнейшего анализа было использовано 562 549 полиморфизмов.

GWAS выполняли с помощью программного обеспечения PLINK V.1.07, функция – qassoc [Purcell, Neale, Todd-Brown, 2007]. Достоверными считали различия при –log 10 (p)>5. Визуализацию и построение графиков производили с применением пакета «QQman» на языке программирования «R».

Картирование SNP проведено с помощью сборки генома Oar_v3.1. Поиск ближайших генов-кандидатов выполняли в области 250 000 п.н. вокруг SNP, показавших достоверную связь с шириной спины у животных исследуемой группы. Аннотации генов выполнялись с использованием геномного браузера Ensemble (.

Результаты исследования и их обсуждение

При проведении GWAS для параметра «ширина груди» было выявлено 9 однонуклеотидных замен, преодолевших порог достоверности -log 10 (p) = 5 (рис. 1). Эти SNP были расположены на 1, 2, 3, 5 и 6-й хромосомах.

Chromosome

Рис. 1. Манхэттенский график результатов GWAS с набором значений –log 10 (p) для исследуемых SNP. Горизонтальная линия обозначает порог достоверности различий при значении –log 10 (p) = 5 [Manhattan plot of GWAS results with a set of –log10(p) values for the studied SNPs.

The horizontal line indicates a difference reliability threshold at –log10(p) = 5]

На представленном квантиль-квантиль графике показаны результаты оценки распределения достоверностей различий. Отклонение от теоретически ожидаемого распределения в случае подтверждения нулевой гипотезы наблюдается, начиная с –log 10 (р)>5 (рис. 2).

Рис. 2. Q-Q график для вероятностей распределения достоверности оценок однонуклеотидных полиморфизмов

[Q-Q plot for the probability distribution of reliability in single nucleotide polymorphism estimates ]

В областях локализации выявленных SNP, достоверно ассоциированных с шириной спины, были обнаружены 5 генов-кандидатов, предположительно влияющих на продуктивные показатели овец. Восемь замен были локализованы в интронах белок-кодирующих генов, одна – в экзоне (таблица).

Характеристики однонуклеотидных замен, ассоциированных с шириной груди у овец Северокавказской мясо-шерстной породы

[Characteristics of single nucleotide substitutions associated with chest width in sheep of the Severocavcazskaya sheep breed]

№	SNP	Хромосома/позиция	P	Ген/расстояние до гена
1	rs412308293	1/73858834	5.007e-06	DPYD/intron
2	rs400857844	1/73648184	6.042e-06	DPYD/intron
3	rs399781046	1/73672374	6.473e-06	DPYD/intron
4	rs398315636	3/75299649	1.000e-05	FSHR/intron
5	rs405039164	5/30848833	1.373e-05	PRR16/intron
6	rs417623542	2/228929830	1.586e-05	SLC19A3/exon
7	rs423233667	2/228930690	1.586e-05	SLC19A3/intron
8	rs424473282	6/29385966	1.930e-05	BMPR1B/intron
9	rs403874313	6/29386809	1.930e-05	BMPR1B/intron

На хромосоме 1 нами выявлено 3 замены, все они находятся в интронах гена DPYD (dihydropyrimidine dehydrogenase). Фермент, кодируемый этим геном, участвует в катаболизме пиримидинов и синтезе β-аланина [Wei et al., 1998]. Последний является предшественником в скелетных мышцах карнозина – дипептида, выступающего в роли pH буфера в мышцах, повышая их производительность и замедляя время наступления нервно-мышечного утомления [Artioli et al., 2010]. Предыдущие исследования крупного рогатого скота и свиней указали DPYD как ген-кандидат, ассоциированный с развитием мышц и качеством мяса. Так, GWAS на бычках зебувидных пород показал, что этот ген ассоциирован с размерами мышечного глазка [Santana et al., 2015]. Методом анализа сети коэкспрессии генов была продемонстрирована связь DPYD с мраморностью говядины [Lim et al., 2014]. В полногеномном ассоциативном исследовании у свиней породы дюрок DPYD рассматривается как ген-кандидат, связанный с развитием внутримышечного жира [Ding et al., 2019]. Таким образом, учитывая предыдущие исследования и важную роль DPYD в обмене веществ, мы считаем его геном-кандидатом, ассоциированным с параметром «ширина груди» у овец.

Две значимые замены были выявлены на хромосоме 2. Обе локализованы в гене SLC19A3 (solute carrier family 19 member 3). SNP rs423233667 расположена в интроне, а rs417623542 – синонимичная замена во втором экзоне. SLC19A3 кодирует один из белков-переносчиков тиамина (витамина B 1 ) [Rajgopal et al., 2001]. Тиамин входит в состав простетических групп многих ферментов, участвующих в катаболизме углеводов, у животных, грибов, растений и бактерий. Он играет важную роль в развитии и функционировании нервной и иммунной систем, почек и мышц у человека и животных [Manzetti et al., 2014]. У чёрных тибетских овец ген SLC19A3 указывался как один из важных регуляторов развития мышечной ткани в эмбриональном периоде и молодом возрасте [Wu et al., 2023]. Таким образом, мы считаем SLC19A3 перспективным геном-кандидатом, ассоциированным с параметром «ширина груди» у овец.

На хромосоме 3 выявлен полиморфизм rs398315636, локализованный в интроне гена FSHR (follicle stimulating hormone receptor). Продукт этого гена представляет собой рецептор и отвечает за возможность клеток реагировать на фолликулостимулирующий гормон. FSHR напрямую связан с развитием яичников и семенников, сперматогенезом и женским репродуктивным циклом [Suocheng et al., 2017; Su et al., 2023]. У овец данный ген ассоциирован с размером помёта и фертильностью [Wang et al., 2015; Xiaoyun et al., 2022]. Кроме того, в последнее время появляются данные о внегонадной экспрессии FSHR в различных тканях, например в хондроцитах, плюрипотентных клетках костного мозга и эндотелии кровеносных сосудов [Kong et al., 2018; Bhartiya et al., 2021b; Utami et al., 2023]. Дисфункция подобных клеток может являться причиной возникновения некоторых онкологических заболеваний [Bhartiya, Patel, 2021a] и иных нарушений, например артериовенозных мальформаций [Utami et al., 2023]. Учитывая важную роль FSHR в размножении и индивидуальном развитии, мы считаем его важным геном-кандидатом, влияющим на продуктивность овец.

SNP rs405039164 расположен на хромосоме 5 в интроне гена PRR16 (proline rich 16). Этот ген кодирует белок Largen, который участвует в регуляции размеров клеток млекопитающих и стимулирует трансляцию специфических мРНК, связанных, в том числе, с функциями митохондрий. Повышенная экспрессия PRR16 приводит к увеличению размеров клеток, а также к повышению количества и активности митохондрий [Yamamoto et al., 2014]. У гибридов коммерческих пород свиней (Duroc х Landrace х Large White) PRR16 указывался как ген-кандидат, ассоциированный с цветом мяса [Li et al., 2022]. Исходя из вышесказанного, мы можем считать PRR16 геном-кандидатом, ассоциированным с исследуемым признаком.

На хромосоме 6 выявлено 2 значимых полиморфизма: rs424473282 и rs403874313. Они оба расположены в локусе FecB в интронах гена BMPR1B (bone morphogenetic protein receptor type 1B). Продукт этого гена является рецептором к костным морфогенетическим белкам (BMP) и играет важную роль в развитии хрящевой ткани в период эмбрионального и постэмбрионального развития [Mang et al., 2020]. Кроме того, BMPR1B экспрессируется в яичниках и влияет на развитие ооцитов и овуляцию. У овец породы Бурула мутация FecB^B в данном гене приводит к гиперплодовитости [Fabre et al., 2003]. Согласно исследованиям породы Китайский меринос, эта мутация также положительно влияет на прирост массы тела и ширину груди ягнят в первые 3 месяца после рождения [Guan et al., 2007]. Схожий эффект был показан на особях линии МЕГА (меринос Х гарут), гетерозиготных по данной мутации [Margawati et al., 2023]. GWAS у мериносовых овец европейских пород показал, что BMPR1B ассоциирован с параметром «масса тела» [Tuersuntuoheti et al., 2023]. Учитывая важную роль выявленного гена в формировании костно-мышечной системы, мы можем считать его геном-кандидатом, ассоциированным с шириной груди у овец.

Ранее исследования связи локусов генома с показателем ширины спины были проведены для пород Джалгинский меринос и Российский мясной меринос [Krivoruchko et al., 2022; Криворучко и др., 2023]. Оказалось, что с шириной груди у всех трёх пород, включая Северокавказскую мясо-шерстную, были ассоциированы разные гены-кандидаты. Отсутствие общих генов, предположительно связанных с исследуемым признаком, показывает, с одной стороны, что количественные фенотипические признаки зависят от большого числа генов, а с другой стороны, это ещё раз подтверждает тезис о различии генетических маркеров для разных пород овец.

Заключение

Таким образом, в результате проведённого нами исследования были выявлены достоверные ассоциации между шириной груди и девятью SNP на 1, 2, 3, 5 и 6-й хромосомах у овец Северокавказской мясошерстной породы. Полиморфизм rs417623542 был расположен в экзоне, а остальные – в интронах белок-кодирующих генов. Картирование выявленных замен позволило предложить 5 новых генов-кандидатов, ассоциированных с изучаемым параметром: DPYD , FSHR , PRR16 , SLC19A3 и BMPR1B . Гены DPYD и SLC19A3 играют важную роль в обмене веществ, гены FSHR , PRR16 и BMPR1B участвуют в регуляции роста клеток и клеточной дифференцировки.

Последующие исследования должны быть направлены на проверку влияния данных генов на параметры мясной продуктивности животных, а SNP, выявленные в ходе исследования, могут использоваться как молекулярные маркеры при селекционной работе.