Получение и комплексная оценка диагностических сывороток к антигену Yersinia pseudotuberculosis, выделенному с применением диметилсульфоксида

Введение. Энтеропатогенные иерсинии ( Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis ) повсеместно вызывают расстройства функции желудочно-кишечного тракта у молодняка сельскохозяйственных животных. Эти расстройства известны как кишечный иерсиниоз и псевдотуберкулез.

Основным методом диагностики иерсиниозов является бактериологический, в котором ключевое значение имеет «холодовое обогащение» возбудителя на бедных питательных средах накопления [1].

Эффективность бактериологической диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерси-ниоза можно повысить предварительной индикацией иерсиний в средах накопления при помощи иммуноферментной тест-системы. Обязательной составной частью тест-системы являются гипериммунные сыворотки, содержащие специфические антитела. Для непрямого варианта ИФА необходимо наличие иерсиниозных сывороток, полученных от двух видов лабораторных животных [2]. Нами ранее была получена иерсиниозная гипериммунная сыворотка от кроликов [3]. В настоящей работе предпринята попытка использования морских свинок для получения антител.

Для иммунизации животных нами использовался антиген (ДА), полученный в результате обработки клеток Y. pseudotuberculosis диметилсульфоксидом. Основной химический состав ДА представлен белками [4].

Получение иммунных сывороток с высоким титром антител возможно только при использовании адъювантов, усиливающих действие антигена. Синтетические полиэлектролиты являются перспективной группой адъювантных препаратов [5]. Представителем данной группы химических соединений является полиазолидинаммоний, модифицированный гидрат-ионами йода (ПААГ).

Возможности совместного применения ПААГ и ДА Y. pseudotuberculosis для получения гипериммунных сывороток крови впервые изучались нами при иммунизации кроликов [3]. Данный эксперимент показал перспективность таких гипериммунизаций, что определило использование комплекса ПААГ + ДА Y. pseudotuberculosis при иммунизации морских свинок.

Цель исследования – получение гипериммунной сыворотки крови морской свинки путем иммунизации животного ДА Y. Pseudotuberculosis в комплексе с ПААГ, а также изучение возможности комплексного использования полученных антител с аналогичными кроличьими антителами в непрямом ИФА.

Задачи: получение гипериммунной сыворотки крови морской свинки в результате иммунизации животного ДА Y. pseudotuberculosis и ПААГ в качестве адъюванта; изучение специфичности полученной гипериммунной сыворотки крови морской свинки; совместное использование полученных антител с аналогичными кроличьими антителами в непрямом ИФА для индикации иер-синий в среде накопления с фекалиями свиней.

Объекты и методы. ДА получали из микробной культуры Y. pseudotuberculosis III О:3 серова-риантa. Специфичность гипериммунных сывороток крови морских свинок определяли при помощи формалинизированных клеток Y. Pseudotuberculosis О:1, О:3, О:4, О:5 серовариантов, Y. enterocolitica О:3, О:9 серовариантов и других видов бактерий кишечной группы, а также единого бруцеллезного антигена производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов». Все исполь- зованные в работе штаммы бактерий были получены из музейной коллекции патогенных микроорганизмов ФКУН РосНИПЧИ «Микроб».

Методика получения ДА Y. Pseudotuberculosis заключалась в обработке сухой ацетоновой микробной массы бактерий диметилсульфоксидом. «Ацетоновый порошок» заливали диметилсульфоксидом в соотношении 1:6, инкубировали на шейкере при 37 °С 40 мин, осаждали центрифугированием при 5 тыс. об/мин и удаляли осадок. Надосадочную жидкость, содержащую ДА, диализировали против 0,01 М кар-бонатно-бикарбонатного буферного раствора (КББ) для освобождения от диметилсульфоксида. Диализ проводили 10 ч при комнатной температуре, с перемешиванием и сменой КББ. Полученный ДА лиофильно высушивали [4].

Иммунизацию морских свинок массой 400– 500 г проводили подкожно четырехкратно вдоль спины в 3–4 точки в объеме 1 мл смеси ДА и ПААГ. Соотношение адъюванта к раствору антигена составляло 1:1. ПААГ использовали в 1 %-й концентрации. ДА вводили из расчета 0,6 мг препарата на животное. Иммунизирующая доза для морской свинки была рассчитана из дозы, использованной нами ранее для иммунизации кролика, с учетом коэффициента межвидового переноса доз [6]. Было проведено 5 иммунизаций с интервалом в 2 недели. Кровь для получения сыворотки брали из сердца в процессе тотального обескровливания животного через 14 сут после последней иммунизации.

Гипериммунная сыворотка крови кролика была получена нами ранее аналогичным способом при введении 2 мг ДА на животное [3].

Полученные гипериммунные сыворотки крови морских свинок исследовали методом твердофазного непрямого ИФА [7].

• 10 %-ю взвесь свиных фекалий, отобранных в момент дефекации, обсеменяли суточными агаровыми культурами Y. enterocolitica или Y. pseudotuberculosis , а затем вносили в среду накопления (фосфатно-солевой буфер (ФСБ) pH = 7,6–7,8) таким образом, чтобы концентрации иерсиний в средах накопления составляли 5·10⁵; 5·10³; 50; 5 клеток/мл. Среды накопления с посевами инкубировали при 4 °С в течение 6 сут. Исследование сред в ИФА проводили на 3-и и 6-е сут «холодового обогащения» посевов. Для индикации иерсиний часть содержимого

пробирки после перемешивания среды вносили в лунку планшета и обрабатывали 1 %-м формалином в течение 4 ч.

Результаты и их обсуждение. Результаты оценки специфичности гипериммунных сывороток представлены в таблице 1. Полученная гипериммунная сыворотка морской свинки показала родовую иерсиниозную специфичность в

ИФА с цельными клетками бактерий. Взаимодействие с бактериями из других родов кишечной микрофлоры и бруцеллами было незначительным. Гипериммунная сыворотка крови морской свинки проявила несколько меньшую анти-тельную активность и сходную специфичность при сравнении с аналогичной кроличьей сывороткой (табл. 1).

Таблица 1

Результат определения специфичности полученных гипериммунных сывороток крови

Бактериальные клетки в разведении 109 на 1 мл	Титры антител полученных сывороток в ИФА с клетками бактерий
	Сыворотка морской свинки	Сыворотка кролика
Yersinia pseudotuberculosis О:1	1:12800	1:25600
Yersinia pseudotuberculosis О:3	1:12800	1:25600
Yersinia pseudotuberculosis О:4	1:6400	1:12800
Yersinia pseudotuberculosis О:5	1:12800	1:12800
Yersinia enterocolitica О:3	1:12800	1:25600
Yersinia enterocolitica О:9	1:6400	1:12800
Escherichia coli	1:200	1:400
Salmonella typhimurium	1:100	1:100
Proteus vulgaris	1:100	1:200
Enterobacter aerogenes	1:200	1:200
Brucella abortus	1:100	1:200

Для определения антигенов в исследуемом материале могут быть использованы прямой и непрямой варианты ИФА. Для проведения прямого ИФА диагностическую сыворотку необходимо конъюгировать с ферментом, что может привести к снижению чувствительности и специфичности создаваемой тест-системы. В непрямом варианте ИФА конъюгировать специфическую сыворотку не надо, поэтому непрямой вариант ИФА был признан более перспективным. Для его осуществления мы имели две специфические гипериммунные сыворотки: морской свинки и кролика. Антитела морской свинки было решено использовать для адсорбции на поверхности лунок планшета в разведении 1:200, а с помощью кроличьих антител мы осуществляли индикацию антигена в исследуемом материале, также используя разведения 1:200. Последовательность этапов проведения непрямого ИФА приведена на рисунке.

Исследуемым материалом для индикации являлась среда накопления – ФСБ, предварительно обсемененная энтеропатогенными иер-синиями и фекалиями свиней, а также подвергнутая «холодовому обогащению». Проведенная подготовка исследуемого материала позволила максимально приблизить процесс индикации к реальной ситуации, при которой наблюдается присутствие значительного количества посторонней микрофлоры и накопление корпускулярных и растворимых иерсиниозных антигенов. Результаты исследования указывают на возможность индикации энтеропатогенных иерси-ний при помощи экспериментальных сывороток на 3-й день «холодового обогащения» при условии внесении в 1 мл среды накопления не менее 50 иерсиниозных клеток, а при инокуляции 5 клеток – на 6-й день (табл. 2).

Схема проведения непрямого варианта ИФА для индикации энтеропатогенных иерсиний в средах накопления

Диагностические возможности совместного использования экспериментальных сывороток

Таблица 2

Кол-во бактерий, внесенных в среды накопления			Время обогащения, сут
			3	6
			Разведения среды, показавшие положительный результат с экспериментальными сыворотками
Y. pseudotuberculosis		5·105	1:8	1:32
		5·103	1:4	1:16
		50	1:2	1:8
		5	–	1:4
Y. enteroсolitica		5·105	1:4	1:16
		5·103	1:2	1:8
		50	Цельная	1:4
		5	–	Цельная
о I— о	без фекалий	с Y. pseudotuberculosis	1:4	1:16
		с Y. enteroсolitica	1:4	1:16
	с фекалиями	Без иерсиний	–	–