Получение и оценка селекционного материала для создания F1 гибридов капусты пекинской (B.rapa ssp. pekinensis) c устойчивостью к стрессовым факторам

Оригинальные статьи / Originalarticles УДК 635.345:631.524.85

Капуста пекинская – важный и ценный для рациона питания человека овощ, неизменный ингредиент многих диет из-за низкой калорийности и хорошего биохимического состава. Например, в ней много витамина C, В5, B2, витамина РР, противоязвенного витамина U, β-каротина, белков и клетчатки. Она содер- жит также незаменимую аминокислоту лизин, которая способствует активному очищению крови [1].

Культуру возделывают как однолетнее растение, хотя по своей природе это двулетник. Овощ любят и широко выращивают во всем мире: это Северный и Северо-Восточный Китай, Япония, Америка, Австралия, Юго-Восточная Азия [2]. Ежегодная посевная площадь пекинской капусты в Китае достигает 2,67 млн. гектаров, что составляет 15% от общей посевной площади овощей, с выходной стоимостью почти 60 млрд. юаней [2].

В странах Европы также возделывают и потребляют культуру. Так, в Польше площадь её производства ежегодно составляет 5-7 тыс. га и зависит от гибридов F1, поставляемых иностранными семеноводческими компаниями [3]. А в Австрии по данным компании Statista (2022), в 2020/21 году годовой объем потребления пекинской капусты составил около 32,6 тыс. тонн1.

Привлекательность производства культуры заключается в высокой оптовой цене реализации и спросе, высокой урожайности (до 60 т с 1 га), а также в возможности получать два урожая в год [4]. Популярность капусты пекинской в России продолжает развиваться и в промышленном, и в частном овощеводстве. В данный период в стране посевные площади увеличиваются под культуры азиатских подвидов Brassica, и снижаются под корнеплодной репой [5]. Однако значительная доля потребляемой пекинской капусты импортируется в Россию из других стран. По материалам исследований АБ-Центра (2022), импорт культуры за пять лет был сокращен примерно на 58% [4] (рисунок 1).

Поэтому необходимо иметь отечественный сортимент гибридов пекинской капусты, чтобы обеспечить импортозамещение.

По состоянию на ноябрь 2022 года в Госреестр включено 16 отечественных сортов и 52 гибрида F 1 пекинской капусты, 48% из которых зарубежные [4].

Рис.1. Объём импорта пекинской капусты в Россию

Fig.1. Importvolume ofChinese cabbage to Russia

Для сравнения, в Японии зарегистрировано более 300 гибридов. На урожайность капустных культур негативно влияют различные патогены, в том числе бактериальные, вирусные и грибковые инфекции [5]. Многие сорта и гибриды Госреестра восприимчивы к наиболее опасным патогенам. Такие заболевания, как кила (возбудитель Plasmodiophora brassicae ), верхушечный ожог (некроз капусты), альтернариоз (возбудители Alternaria brassicae , А. brassicicola ) и мучнистая роса (возбудитель Erysiphe communis f . sp. brassicae Hammarl.), хотя и не входят в перечень карантинных объектов на территории России и Евразийского экономического союза, обычно поражают значительную часть посевных площадей и приводят к ощутимой потере и снижению товарной продукции. Создание устойчивых к этим патогенам сортов является важным направлением в селекции. По состоянию на ноябрь 2022 г. устойчивость к киле имеют всего 29% гибридов капусты пекинской Госреестра, только 13% из которых отечественной селекции, менее 3% гибридов устойчивы к краевому некрозу, нет гибридов с толерантностью к альтерна-риозу.

Устойчивость к раннему стеблеванию, очень важную ввиду биологической особенности культуры, имеют всего 13% сортов Госреестра и только половина рекомендованных для выращивания растений имеют закрытую вершину кочана. Много сортов и гибридов пекинской капусты Госреестра представлены кочанными формами типа Аити (часто недостаточно устойчивыми к стеблеванию) и Чифу (с остроконечным кочаном типа «пуля»), а также гибридами этих сортотипов с сортами с полуоткрытым кочаном типа Касин (с устойчивостью к стеблеванию, но часто недостаточно устойчивыми к альтернариозу и вирусу мозаики турнепса) [1].

Для перехода на зеленое сельское хозяйство и производство органической продукции необходимы сорта и гибриды, сочетающие высокую продуктивность и товарность с комплексной устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессовым факторам [6]. Для этого нужен селекционный материал, устойчивый к раннему стеблеванию, с высокой продуктивностью, а также с устойчивостью к заболеваниям, таким как кила, внутренний некроз, мучнистая роса.

По своей природе капуста пекинская высоко восприимчива к киле, от которой гибнет до 60% урожая [7]. Возбудитель заболевания P. brassicae – эндемичный организм, внутриклеточный паразит, который приводит к гипертрофии и гиперплазии клеток [8]. В результате разрастания паренхимной ткани корней, на корнях образуются клубневые наросты и в результате из-за блокировки проводящей системы растение не получает питание и гибнет.Покоящиеся споры возбудителя килы сохраняют патогенность до 20 лет [9]. Признано, что единственный эффективный способ справиться с заболеванием – выращивание растений с генетической устойчивостью к патогену [9]. Такие растения растут практически без применения пестицидов, к тому же происходит очищение почвы от спящих спор килы, которые прорастают, но не развиваются на корнях устойчивых растений и погибают [4]. При выращивании устойчивых растений дополнительно сохраняется до 40% урожая и это экономически целесообразно.

Лишь в конце XX века удалось получить первые устойчивые к киле (CR) гибриды культуры, когда удалось передать гены резистентности из европейского кормового турнепса ( B. rapa ssp. rapifera ) [10]. У B.rapa ssp. pekinensis и B. rapa ssp. rapifera одинаковое число хромосом ( B.rapa , 2n = 20, AA), поэтому интродукция любого признака между ними не вызывает сложности [11]. Для создания килоустойчивых гибридов и сортов различного назначения необходимо одновременно проводить отбор по CR и другим ценным хозяйственным признакам. Устойчивость, контролируемая одним доминантным геном CR, со временем может быть преодолена с высокой степенью вероятности [12]. Для придания высокой степени устойчивости к широкому спектру рас P. brassicae необходимо «пирамидиро-вать» в одном генотипе несколько доминантных генов CR или QTL [13; 14]. Всего у B. rapa удалось обнаружить не менее 19 генов / QTL резистентности к Plasmodiophora brassicae Wor., которые локализованы на шести группах сцепления [9; 14]. К ключевым генам «главного действия» относят гены CRa [15], CRb [16], Crr1 [17], и СRA05 [18].

При создании F 1 -гибридов растений Brassica в большинстве развитых стран традиционные методы классической селекции комбинируют с технологиями ускорения селекционного процесса, такими, как методы молекулярного маркирования (для отбора и «пирамидирования» генов), а также создания удвоенных гаплоидов (DH). Их применение позволяет создавать чистые линии с определёнными признаками (например, устойчивостью к киле или раннему стеблеванию) – исходный материал для скрещиваний – за 1-2 года вместо 5-6 лет традиционной селекции [19] . Наиболее эффективным и технологичным способом создания DH-линий является использование метода культуры изолированных микроспор [20]. Гаплоидные растения регенерируют in vitro из микроспор, изолированных из пыльников. Технология не универсальна, очень чувствительна к множеству факторов, тем не менее, её широко применяют для различных растений Brassica, в том числе для капусты пекинской и китайской [21]. В значительной степени на отзывчивость к микроспорогенному эмбриогенезу влияет генотип культуры. Однако основным преимуществом технологии является высокий выход эмбриоидов и, как следствие, - высокое количество удвоенных гаплоидов [22].

Цель исследования состояла в оценке и создании генотипов с набором ценных хозяйственных признаков, включая продуктивность, устойчивость к киле, мучнистой росе, раннему стеблеванию.

Материалы и методы

Растительный материал. Линии капусты пекинской произведены в 2019–2020 годах из образцов, отобранных на провокационных фонах по устойчивости к киле и толерантности к внутреннему некрозу кочанов. Изучали среднюю массу кочана 36 гибридов от скрещивания этих линий в весенне-летнем обороте и 22 гибрида в летне-осеннем обороте в 2022 г. Выделение перспективных гибридных комбинаций проводили в сравнении с лучшими стандартами: зарубежным гибридом F 1 Bilko и отечественными гибридами F 1 Ника и

F 1 Гидра. Для изоляции микроспор использовали 4 линии различной степени инбридинга: ОКС_2; ЕС 2-3 ×Е 2 ки б112; К 43-15 и К 43-12 , устойчивые к раннему стеблеванию.

Выращивание растений и оценка продуктивности. Растения гибридных комбинаций выращивали рассадным способом с использованием кассетной технологии. В весенне-летнем обороте посев семян в кассеты с торфяным субстратом произвели 20 апреля 2022 г., в открытый грунт в многолетний инфекционный фон по киле растения высаживали по схеме 45×35 см² 16 мая 2022 г. с одновременным поливом. Для летне-осеннего оборота посев семян произведен 30 июня 2022 г., в открытый грунт растения высаживали 21 июля 2022 г. по той же схеме. Полевые испытания генотипов были проведены при размещении опытных делянок методом рандомизированных повторений по 8 растений в каждой с двухкратной повторностью. Оценку продуктивности проводили в технической зрелости кочана при взвешивании по 4 растения, вычисляя среднюю массу для каждого генотипа. Растения выращивали традиционным способом.

Используемые для введения в культуру микроспор линии посажены в сентябре 2022 г в зимнюю теплицу. Яровизацию проводили в защищенном грунте в зимний период при температуре 4-6oC.

Статистический анализ. Существенность различий в проявлении признака оценивали с помощью дисперсионного анализа на 5%-ном уровне значимости.

Оценка устойчивости к мучнистой росе. Проводили в сложившихся благоприятных для развития заболевания естественных условиях в теплице для растений, посеянных в сентябре 2022 г. Оценку растений проводили по универсальной шкале для листовых пятнистостей [23]: 0 – устойчивое (отсутствие поражения); 1 – толерантное (поражение в виде отдельных белых пятен, до 10% площади листа); 2 – слабовосприимчивое (поражено от 11% до 25% поверхности; поражение в виде отдельных белых пятен, спороношение слабое); 3 – высоковосприимчивое (поражено от 25 до 50% площади листа, поражение в виде крупных пятен, спороно-шение сильное); 4 – высоковосприимчивое (поражено свыше 50% площади листа, сплошной белый налет). Оценку площади поражения проводили по эскизам листьев [24].

Изоляция и культивирование микроспор. Для изоляции микроспор при помощи штангенциркуля отбирали бутоны длиной 2,5-2,7 мм, содержащие микроспоры поздней одноядерной стадии развития. Изоляцию микроспор проводили по [25; 26]. Стерилизацию бутонов проводили в 2% гипохлорите натрия с добавлением 1-2 капель Твин-20 в течение 10 минут и промывали 3 раза в стерильной воде. Изоляцию микроспор проводили в питательной среде B5, содержащей 13% сахарозы. Простерилизованные ситечки с бутонами последовательно споласкивали в стерильной воде в течение 1, 5 и 10 минут. Бутоны помещали в одноразовые бюксы с добавлением 2 мл стерильной среды В5-13, измельчали плунжерами до суспензии и фильтровали в стерильную пробирку объемом 15 мл. Центрифугировали микроспоры 4 минуты при 800 оборотах в минуту 3 раза. Далее ресуспендировали микроспоры в 2 мл охлажденной среды NLN-13.

Определяли плотность микроспор, используя камеру Фукса-Розенталя, после чего средой для культивирования доводили до 4×104 микроспор/мл. Суспензию микроспор разливали в чашки Петри и культивировали при 33оC в течение 48 часов в полной темноте и затем переносили снова в темноту. При появлении эмбриоидов чашки Петри помещали на шейкер и инкубировали при 25оC (при 60 оборотах в минуту).

Регенерация/проращивание       эмбриоидов.

Эмбриоиды в семядольной стадии развития помещали в автоклавируемые контейнеры, заполненные на 0,5–0,6 см агаризованной (1,1%) средой В5. Кислотность среды перед стерилизацией доводили до pH 5,8. Плотность размещения эмбриоидов составляла 9–12 шт. на один контейнер. Эмбриоиды культивировали при 24°C и фотопериоде 16 ч – день, 8 ч – ночь. Один раз в месяц при отсутствии развитых растений пересаживали на свежую питательную среду того же состава. При образовании из эмбриоида проростка с нормально развитыми листьями и корневой системой их пересаживали в кассеты с торфяным субстратом для адаптации.

Выделение ДНК. Проводили из молодых тканей листьев растений капусты пекинской по методике ЦТАБ согласно протоколу [27].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Амплификацию геномной ДНК проводили в 15 мкл реакционной смеси, содержащей: 1×ПЦР-буфер; 0,2 мМ dNTPs; по 5–10 пМ каждого праймера; 0,25 ед.а. Taq-полимеразы и 20 нг геномной ДНК.Амплификацию проводили в амплификаторе DNA Engine^® Peltier Therma Cyclers (BIO-Rad). ПЦР былавыполнена при следующих условиях: начальная денатурация при 94°С 3 мин; 35 циклов – денатурация при 94°С 30 с; отжиг при 60°С 30 с, элонгация при 72°С 1 мин; завершающая элонгация при 72°С 5 мин. Хранение – при температуре 10°C [4].

Генотипирование устойчивости к киле проводили с использованием маркера B0902 гена CRb

(F: AGCCTTGCGTAAAAGCAACTAC,

R: GTTTGGAATCCGACAAATACATCCAT) [28].

Электрофорез, визуализация и документация.

Продукты амплификации окрашивали флуоресцентным красителем GelRed (Biotium, США)и разделяли в 1%-ном агарозном геле в однократном Трис-боратном-ЭДТА-буфере при напряженности 4 Вт/см в течение 60 мин. Визуализацию и документацию электрофореграмм проводили с использованием гель-документи-рующей системы GelDoc Go (Bio-Rad) [4].

Результаты и их обсуждение

Выделение продуктивных гибридов капусты пекинской

Проведён учёт массы кочанов гибридных комбинаций, устойчивых к киле: в весенне-летнем обороте 2022 года изучали 36 гибридов, в летне-осеннем обороте 2022 года – 22 гибрида. Изучаемый материал сравнивали с лучшими коммерческими CR-гибридами отечественной и зарубежной селекции: F 1 Ника, F 1 Гидра и F 1 Bilko.

Размах вариации средних значений массы кочана оцениваемых 36 генотипов, выращиваемых в весеннелетнем обороте, составил 970,5 г. Минимальное значение средней массы кочана было у генотипа Кви дг7-

3×Кви10, максимальное – у генотипа Чи 1 мс×П 1 дг7 (табл. 1). По результатам оценки в сравнении со стандартами, выявлена лучшая гибридная комбинация Чи 1 мс×П 1 дг7 (mср=1458,25 г.), среднее значение массы которой для 5% уровня значимости превысило 3 стандарта. Три генотипа: Чи 1 мс×Квидг7, Квидг19×П 1 дг9 и К 43-12 ×Чи 1 существенно превысили по продуктивности гибрид F 1 Ника. Выделенные генотипы были с максимальным проявлением признака свыше 1000 г (табл.1).

Из таблицы 1 следует, что масса кочана слабо варьирует (CV ≤ 10%) только у четырех генотипов, не превышающих стандарты: Квидг(10)×Квидг7-2, Квидг8-2×8-1, Кви 19 ×П 1 дг2 и К 43-15 ×Квидг(10). Среднюю степень варьирования признаков (11-20%) имеют 11 генотипов (30% от общего числа): Чи 1 мс×Квидг7, Чи 1 мс×П 2 дг(13)2, Чи 1 мс×П 1 дг2-1, Чи 1 мс×К43-15, Чи 1 мс×Ес2, Квидг7-2×Квидг(10)1, Квидг19×П1дг9, Чи 1 мс×Т 52 , Кви 7 ×П 1 дг4, Кви 19 ×П 1 дг18 и Кви 8 ×П 1 дг9. Сильную вариацию признака > 20% наблюдали у остальных 21 гибридных комбинаций, что составило 58% от общего числа линий. Выделенные 4 гибридные комбинации с высокой массой кочана имели высокую и среднюю степень варьирования, при этом средние значения диаметра и высоты кочана у данных генотипов слабо варьировали (CV≤10%), что может свидетельствовать о разной плотности кочана.

Для 22 генотипов, оцениваемых в летне-осеннем обороте (июль-сентябрь 2022 года), размах вариации составил 805,16 г. Минимальное значение массы кочана было у генотипа Би 5 дг2-1xП₁дг5-11, максимальное – у генотипа Би 5 дг2-1 х П₁дг4-1 (табл.2). Примечательно, что у этих двух генотипов одна и та же материнская линия Би 5 дг2-1, а в генотипе с максимальной массой отцовская линия П₁дг4-1 имела высокий эффект ОКС в исследовании [4] и была рекомендована к использованию для поиска «удачных» гибридных комбинаций. Можно предположить, что именно скрещивание с линией П₁дг4-1 привело к «удачной комбинации», так как эффект ОКС частично определяется доминированием [29]. По результатам оценки в сравнении с двумя стандартами выявлены 10 гибридных комбинаций, значимо превысивших по массе кочана стандарт F 1 Bilko. Ни один генотип не превзошел по продуктивности F 1 Гидра, но 7 гибридных комбинаций (выделены зеленым цветом в табл.2) значимо не отличаются от него по массе для НСР 05 = 279,7 г. Лучший по массе генотип Би 5 дг2-1 х П 1 дг4-1 (m ср = 1404,56 г) (табл. 2).

Одна из 7 гибридных комбинаций с высокой массой (Кви 19 х П 1 дг9) была выделена ранее при полевых испытаниях в 2021 году и вошла в число 14 перспективных по продуктивности [4]. У данного генотипа было отмечено удачное сочетание высоких эффектов ОКС родительских линий и СКС гибридной комбинации, что подтверждает решающий вклад в генетический контроль массы кочана эффекта специфической комбинационной способности.

В 2021 году испытание данного генотипа проводили также в летне-осенний период.Примечательно, что средняя масса гибридных комбинаций, выращенных в летне-осеннем обороте (m ср = 1019,57 г), выше средней массы генотипов, выращенных в весенне-летнем обороте (m ср = 838,71 г.). Так, доля гибридов с массой свыше 1000 г во втором обороте составила 45%, а в первом – всего 8%. Это может свидетельствовать о

Таблица 1. Среднее значение и степень изменчивости массы кочана гибридных комбинаций капусты пекинской (весна-лето, 2022) Table 1. The average value and degree of variability of the head weight of hybrid combinations of Chinese cabbage (spring-summer, 2022)

№	Генотипы	Средняя масса, г	Коэффициент вариации, %	№	Генотипы	Средняя масса, г	Коэффициент вариации, %
1.	Чи 1 мс×Квидг7	1151,00	17,3%	19.	К 43-15 ×Чи 1	961,50	21,7%
2.	Чи 1 мс×Квидг8	816,31	31,1%	20.	Квидг7-3×7-1	782,00	30,6%
3.	Чи 1 мс×П2дг(13)2	720,50	18,1%	21.	Квидг7-3×8-1	724,75	29,7%
4.	Чи 1 мс×П 1 дг2-1	786,00	18,9%	22.	Квидг19×П 1 дг9	1086,00	14,5%
5.	Квидг(10)×Квидг7-2	663,50	6,5%	23.	К 43-12 ×Чи 1	1157,13	26,7%
6.	Кви дг8-1×8-2	626,75	34,4%	24.	Чи 1 мс×П2дг13	593,75	36,4%
7.	Чи 1 мс×К 43-15	513,25	16,3%	25.	Кви дг7-2×Чи 1	708,50	24,2%
8.	Чи 1 мс×П 6 дг2	773,13	39,2%	26.	Чи 1 мс×Т52	880,75	15,3%
9.	Кви дг7-3× Кви 10	487,75	21,9%	27.	Чи 1 мс×П 1 дг7	1458,25	28,9%
10.	Кви дг7-4× Квидг10	857,75	26,0%	28.	Кви 7 ×П 1 дг4	765,63	16,4%
11.	Кви 10 ×П 1 дг2	956,63	33,0%	29.	Кви 5 ×П 1 дг8	748,50	23,9%
12.	Кви3×П 1 дг1	864,50	22,1%	30.	Кви 19 ×П 1 дг2	783,00	9,8%
13.	К 43-12 ×Квидг7-2	857,75	27,6%	31.	Кви 19 ×П 1 дг18	772,75	12,4%
14.	Кви дг8-2×8-1	963,75	9,4%	32.	Кви 8 ×П 1 дг9	679,75	10,4%
15.	Чи 1 мс×Ес2	849,75	16,4%	33.	Кви 10 ×П 1 дг5	921,50	20,1%
16.	Чи 1 мс×П 1 дг4	865,00	22,7%	34.	Чи 1 мс×Кви 7	938,63	30,3%
17.	Кви8×П1дг8	743,38	26,2%	35.	К43-12×Квидг(10)	575,50	23,1%
18.	Квидг7-2× Квидг(10)1	933,00	13,8%	36.	К 43-15 ×Квидг(10)	763,25	4,6%

Примечание. НСР 05 масса кочана = 256,25 г. Средняя масса кочана 3 стандартов: Ника F 1 (816,5 г), Гидра F 1 (996,75 г), Bilko F 1 (1168,25 г). Зеленым цветом выделена гибридная комбинация, превышающая 3 стандарта, синим выделены генотипы, превзошедшие Ника F 1 .

Note. LSD 05 the cabbage head weight = 256.25 g. The average weights of the cabbage head of 3 hybrid standards are: F 1 Nika (816.5 g), F 1 Hydra (996.75 g), F 1 Bilko (1168.25 g). The hybrid combination that surpassed 3 standards is highlighted in green, the genotypes that surpassed the F 1 Nika are highlighted in blue.

Таблица 2. Среднее значение и степень изменчивости массы кочана гибридных комбинаций капусты пекинской (лето-осень, 2022 год) Table 2. The average value and degree of variability of the head weight of hybrid combinations of Chinese cabbage (summer- autumn, 2022)

№	Генотипы	Средняя масса, г	Коэффициент вариации%	№	Генотипы	Средняя масса, г	Коэффициент вариации %
1.	К 43-15 x Чи 1	894,50	14,2%	12.	Би 5 дг2-1 х П 1 дг4-1	1404,56	9,7%
2.	Би 5 дг2-1 x П 1 дг5-11	599,40	9,5%	13.	К 43-12 х Квидг(16)	940,57	17,5%
3.	П 1 дг7-1 х Би 5 дг2-1	934,14	35,1%	14.	Ги 13 х Би 5 дг	812,00	15,7%
4.	Би5дг2 х Т52	956,13	19,7%	15.	Би 5 дг7-1 х Квидг8-2	977,00	38,9%
5.	П1дг4-11 х Би5дг2-1	780,71	30,1%	16.	Кви 5 дг2 х Квидг7-1	1156,63	41,4%
6.	Кви 19 х П 1 дг9	1227,25	35,4%	17.	Би 5 дг2 х П 1 дг2	1201,83	11,4%
7.	Би5дг2-1 х П1дг7-1	1052,64	30,0%	18.	Квид7 х Би5дг2-1	1260,75	37,9%
8.	Квидг(15)1 х Би 5 дг2	1142,00	26,1%	19.	Квидг8-2 х Би 5 дг2-1	1229,17	15,2%
9.	П2дг2-11 х Би5дг2	1369,33	24,1%	20.	Би 5 дг2-2 х Квидг(15)	1010,25	15,7%
10.	П 1 дг8-1 х Би 5 дг2-1	919,45	33,3%	21.	Кви 3 х П 1 дг1	876,63	21,2%
11.	Би 5 дг2 х Квидг(16)	789,08	27,0%	22.	Кви 10 х П 1 дг2	790,88	20,4%

Примечание. НСР 05 масса кочана = 279,7 г. Средняя масса кочана стандартов: Гидра F 1 (1424,25 г), Bilko F 1 (720,63 г). Зеленым цветом выделены гибридные комбинации, превзошедшие Bilko F 1 и значимо не отличающиеся от Гидра F 1 , синим цветом выделены генотипы, превысившие по массе кочана 1 стандарт.

Note. LSD 05 the cabbage head weight = 279.7 g. The average weights of the cabbage head of standards of hybrids are: F 1 Hydra (1424.25 g), F 1 Bilko (720.63 g). The hybrid combinations that have surpassed F 1 Bilko and are not significantly different from F 1 Hydra are highlighted in green, the genotypes that have exceeded the F 1 Bilko by cabbage head weight are highlighted in blue.

сложившихся благоприятных условиях для выращивания генотипов во втором обороте, так как среднесуточные температуры находились в оптимальном для культуры диапазоне 15-23ºC.

Масса кочана слабо варьирует всего у двух генотипов: Би 5 дг2-1 x П 1 дг5-11 и у генотипа с максимальной массой Би 5 дг2-1хП 1 дг4-1. Семь генотипов, в том числе Би5дг2 х П 1 дг2 и Квидг8-2 х Би 5 дг2-1 с высокой массой, имели среднюю степень варьирования признаков, остальные 13 генотипов сильно варьировали по массе (CV более 20%).

В совокупности, по выровненности и продуктивности выделены 2 лучшие гибридные комбинации: Би₅дг2-1 х П₁дг4-1 (mср=1404,56 г) и Би 5 дг2 х П 1 дг2 (m ср = 1201,83 г).

Изучение устойчивости линий капусты пекинской к мучнистой росе

Мучнистая роса (возбудитель: Erysiphe cruciferarum Opiz ex L. Junell.) обычно поражает все капустные культуры при сложившихся благоприятных для заболевания условиях (жаркая погода и наличие влажной среды для прорастания конидий возбудителя, частые туманы).

Первые симптомы заболевания можно наблюдать в виде белых округлых пятен с белым мучнистым мицелием на верхней и нижней поверхности листа. По мере развития заболевания эти пятна сливаются, и вскоре вся поверхность листа покрывается порошкообразным налетом [7]. Поврежденная листовая поверхность становится более восприимчивой к другим патогенам.

Моногенная доминантная устойчивость к настоящей мучнистой росе встречается у капусты белокочанной. У капусты пекинской генов вертикальной устойчивости пока не обнаружено [7]. Важной селекционной работой является оценка устойчивости к заболеванию растительного материала.

Были оценены 18 линий капусты пекинской, посеянные в сентябре 2022 г в зимнюю теплицу (см. табл. 3). Оценка проявления симптомов заболевания была проведена в апреле 2023 г. Определяли степень болезнеустойчивости растений капусты пекинской на естественном инфекционном фоне по 4-балльной шкале (рис. 2). За устойчивые принимали растения с поражением 0-1 балла, за восприимчивые – с поражением 2-4 балла. Оценивали фактическое количество пораженных растений каждой линии (от 1 до 5) и процент распространённости болезни.

В результате оценки поражения (см. табл. 3) генотипы были разделены на группы по устойчивости к патогену:

• •    Устойчивые (К 43-12 , К 43-15 , Квидг12-2, ОКС2, Би 5 дг2-1, Чи 1 -0, Orient Q);

• •    Высоковосприимчивые (Чи₁мс×Квидг7, Чи₁мс×Квидг8, П 1 дг4-12, П 2 дг2-1);

• •    Слабовосприимчивые (Квидг7-2 цв, Квидг8-2, Квидг10-1, П 2 дг7-1, Чи 1 мс×ЧиI, Чи 1 -6 цв F, ЕС 2-3 ×Е 2 ки б112).

Таким образом, выявлено 7 устойчивых и толерантных к мучнистой росе генотипов, которые можно рекомендовать для проведения дальнейших испытаний и включения в селекционный процесс для создания гибридов с устойчивостью к стрессовым факторам.

A) 0 баллов

B) 1 балл

C) 2 балла

D) 3 балла

Рис.2.Поражение капусты пекинской мучнистой росой от 0 до 4 баллов

F) 4 балла

Таблица 3. Оценка поражения линий капусты пекинской мучнистой росой Table 3. Evaluation of the damage to Chinese cabbage lines from powdery mildew

№	Генотип	Балл поражения растений					Развитие болезни, %	Устойчивость
		1	2	3	4	5
1.	Чи 1 мс×Квидг7	4	4	–	–	–	100%	высоковосприимчивое
2.	Квидг7-2 цв	2	2	–	–	–	50,00%	cлабовосприимчивое
3.	Квидг8-2	1	2	–	–	–	37,50%	cлабовосприимчивое
4.	Квидг12-2	1	1	–	–	–	25,00%	толерантное
5.	Квидг10-1	1	2	–	–	–	37,50%	cлабовосприимчивое
6.	Чи 1 мс×Квидг8	3	3	–	–	–	75,00%	высоковосприимчивое
7.	К 43-12	1	–	–	–	–	25,00%	толерантное
8.	К 43-15	0	0	–	–	–	0,00%	устойчивое
9.	ОКС2	1	–	–	–	–	25,00%	толерантное
10.	Би 5 дг2-1	1	1	0	–	–	25,00%	толерантное
11.	П 1 дг4-12	3	3	3	2	2	65,00%	высоковосприимчивое
12.	П 2 дг7-1	1	2	2	2	–	43,75%	cлабовосприимчивое
13.	П 2 дг2-1	4	4	3	–	–	91,66%	высоковосприимчивое
14.	Чи 1 -0	0	–	–	–	–	0,00%	устойчивое
15.	Orient Q	1	1	1	–	–	25,00%	толерантное
16.	Чи 1 мс×ЧиI	2	2	2	2	2	50,00%	cлабовосприимчивое
17.	Чи 1 -6 цв F	1	2	2	–	–	41,66%	cлабовосприимчивое
18.	ЕС 2-3 ×Е2 ки б112	2	2	–	–	–	50,00%	cлабовосприимчивое

Создание удвоенных гаплоидов капусты пекинской в культуре изолированных микроспор in vitro и отзывчивость генотипов

Методы биотехнологии позволяют создавать линии с заданными свойствами, например, ценными хозяйственными признаками и генами устойчивости сразу к нескольким возбудителям заболеваний. Для создания DH-растений в культуре изолированных микроспор использовали 4 селекционных образца с важной для культуры устойчивостью к раннему стеблеванию: ОКС_2; ЕС 2-3 ×Е 2 ки б112; К 43-15 и К 43-12 . Все указанные генотипы были созданы с помощью инфекционных фонов по устойчивости к киле и толерантности к верхушечному ожогу кочана. Дополнительно генотипы К 43-12 , К 43-15 и ОКС_2 обладают устойчивостью к мучнистой росе, а линия ОКС_2 перспективна для получения высокоурожайных гибридов.

Использовали бутоны с размером 2,5-2,7 мм согласно литературным данным [25]. Происходило успешное развитие эмбриоидов (рис. 3A, 3B), которые в дальнейшем развивались в полноценные растения (рис. 3С).

Были изучены сортовые различия в эмбриогенезе данных генотипов пекинской капусты ( Brassica rapa L. ssp. pekinensis ). Как известно, эмбриогенная способность зависит от множества факторов, но одним из ключевых моментов при работе с культурой микроспор in vitro является генотип донорных растений [21].

Селекционные образцы были разделены на группы по отзывчивости к эмбриогенезу (табл. 4). Для оценки эмбриогенной способности B.rapa ssp.pekinensis в культуре изолированных микроспор нами предложена следующая шкала (число эмбриоидов в пересчете на 100 бутонов): 0 шт./100 бут. – неотзывчивый; 1 - 500 шт./100 бут. – низко отзывчивый; 501 - 2000 шт./100 бут. – средне отзывчивый; ≥ 2001 шт./100 бут. – высоко отзывчивый [31]. Согласно данной шкале к средне отзывчивым отнесли генотип ЕС2-3×Е2 ки б112, с частотой эмбриогенеза более 500 эмбриоидов на 100 бутонов. Генотипы K43-12, K43-15 и ОКС_2 оказались низко отзывчивыми к эмбриогенезу (до 500 эмбриоидов на 100 бутонов). Адаптировать удалось растения-регенеранты для всех 4 генотипов.

Всего было получено 498 эмбриоидов (~ 77% от общего числа из 649 бутонов), из них:

• •    3 эмбриоида – получено из донорного генотипа ОКС_2;

• •    180 эмбриоидов – получено из донорного генотипа K 43-12 ;

• •    9 эмбриоидов – получено из донорного генотипа K 43-15 ;

• •    306 эмбриоидов – получено из донорного генотипа Е С2 -3×Е 2 ки.

Молекулярное генотипирование коллекции образцов линий на устойчивость к киле

Для изучения генов устойчивости к киле линий капусты пекинской было проведено молекулярное генотипирование с ДНК маркером B0902 F/R на ген устойчивости CRb.

A) Эмбриоиды в жидкой среде NLN-13 Embryos in a NLN-13 liquid medium

B) Прорастающие эмбриоиды на среде B5 Shooting of embryos on medium B5

C) Укоренение и адаптация растений-регенерантов (К 43-12 ) Rooting and adaptation of regenerated DH-plants (К 43-12 )

Рис. 3.Развитие DH-растений капусты пекинской в культуре изолированных микроспор

Fig. 3. DevelopmentofChinese cabbage DH-plantembryoids in isolated microspore culture

Проведение отбора с помощью маркеров для ранних этапов селекционного материала способствует значительному сокращению трудоёмкости исследований. Фенотипическая оценка линий не проводилась, результат генотипирования основан на работе маркера гена CRb. Линии Кви 4 и Кви 9 использовали для проверки результатов маркирования в качестве контроля восприимчивости. Эти линии ранее в 2021 г. проверялись на искусственном инфекционном фоне к киле [4] и проявили восприимчивость с максимальным баллом поражения 3 балла по шкале [32]. В соответствии с рис.4 наблюдаются целевые фрагменты, ассоциированные с рецессивным аллелем восприимчивости размером 241 п.н. у пяти линий: Кит 1 -3Са 1 бут; Кви 4 , Кви 9 , Би 5 дг бут и ЕС 2-3 -2102 бут.

У остальных 33 линий (кроме Ха6-111-4; Чи 1 мс×Квидг8 и Квидг(16) 2 бут) наблюдаются целевые фрагменты,ассоциированные с аллелем устойчивости, размером 160 п.н. (рис.4). Присутствие двух аллелей гена CRb наблюдается у 8 генотипов: П 1 дг4-1, Чи 1 мс×П 1 дг9, Чи 1 мс×П 1 дг21, Чи 1 мс×Чи 1 , ЕС 2 -3×Ес ки б112, ЕС2×ЕС ки б212, Orient Queen и Чи 1 мс×Квидг7, что свидетельствует о разных проявлениях гена. Ген Crb относят к генам «главного действия», он был обнаружен в 2013 г. у капусты китайской CR Shinki, локализован в 3 хромосоме [15]. Линии Ха6-111-4; Чи 1 мс×Квидг8 и Квидг(16) 2 бут, у которых не было обнаружено фрагмента амплификации, могут содержать другой ген устойчивости к киле.

Таблица 4. Отзывчивость генотипов в культуре изолированных микроспор in vitro Table 4. Responsiveness of genotypes in culture of isolated microspores in vitro

Генотип	Число эмбриоидов/100 бутонов	Группа отзывчивости
К 43-15	40,63±13,26	низко отзывчивый
К 43-12	415,69±177,07	низко отзывчивый
ОКС_2	8,82±4,16	низко отзывчивый
ЕС 2-3 ×Е 2 ки б112	608,66±19,69	средне отзывчивый

Рис.4.ПЦР-анализ образцов капусты пекинской маркером B0902 гена CRb;

M- DNA-size marker;НК - negative control;160 bp is the size ofthe expected amplicon ofthe resistance allele;

Выводы

В результате полевого испытания устойчивых к киле 36 гибридных комбинаций капусты пекинской в обороте весна-лето 2022 г. выделен генотип Чи1мс×П1дг7 (mср = 1458,25 г.), значимо превысивший 3 стандарта по массе кочана. Однако коэффициент вариации признака у генотипа был значительным (CV более 20%), что может свидетельствовать о разной плотности кочанов и низкой морфологической выровненности.Во втором обороте из 22 гибридных комбинаций в совокупности по выровненности и продуктивности выделены 2 перспективные с закрытой вершиной кочана гибридные комбинации: Би5дг2-1 х П1дг4-1 (mср = 1404,56 г) и Би5дг2 х П1дг2 (mср = 1201,83 г), которые рекомендованы для расширенного сортоиспытания генотипов с ценными хозяйственными признаками, включая устойчивость к киле.

В результате оценки симптомов поражения мучнистой росой на естественном инфекционном фоне из 18 линий капусты пекинской были выделены 7 устойчивых к патогену: К 43-12 ; К 43-15 ; Квидг12-2; ОКС_2; Би 5 дг2-1; Чи 1 -0; Orient Q, которые рекомендованы для включения в селекционные испытания для создания гибридов с устойчивостью к стрессорам.

В культуре изолированных микроспор на основе 4 селекционных образцов, ЕС 2-3 ×Е 2 ки б112; ОКС_2; К 43-15 и К 43-12 , устойчивых к раннему стеблеванию, создана коллекция DH-линий.Селекционный материал для всех линий получен на инфекционном фоне по устойчивости к киле и толерантности к верхушечному ожогу. Дополнительно генотипы К 43-12 , К 43-15 и ОКС_2 показали устойчивость к мучнистой росе. Это позволит получить гибриды с набором ценных хозяйственных признаков, включая устойчивость к раннему стеблеванию, резистентность сразу к нескольким возбудителям заболевания и высокую продуктивность (благодаря перспективной линии ОКС_2). Самую высокую отзывчивость к эмбриогенезу из 4 генотипов проявил генотип ЕС 2-3 ×Е 2 ки б112 (частота образования эмбриоидов 608,66±19,69 штук на 100 бутонов).

В результате молекулярного генотипирования была проведена дифференциация 41 линии капусты пекинской по гену «главного действия» устойчивости к киле CRb . Ген Crb обнаружен у подавляющего большинства линий (~ 80%). Требуется дифференцировать линии по другим CR-генам для пирамидирования различных генов в одном генотипе и создания гибридов с надежной устойчивостью к заболеванию.

Об авторах:

Анастасия Дмитриевна Заставнюк – аспирант кафедры ботаники селекции и семеноводства садовых растений, младший научный сотрудник, автор для переписки, , ; ResearcherID: ADP-6159–2022 Григорий Федорович Монахос – кандидат с.-х. наук, генеральный директор,

Сократ Григорьевич Монахос – доктор с.-х. наук, профессор, заведующий кафедрой ботаники, селекции и семеноводства садовых растений, , Researcher ID: L-5962-2013, Scopus Author ID: 56052882900

Aboutthe Authors:

Anastasia D. Zastavnyuk – PhD student, Department of Botany, Plant Breeding and Seed Technology; Junior Researcher, Correspondence Author, ; ; ResearcherID: ADP-6159–2022 Grigory F. Monakhos – Cand. Sci. (Agriculture), General Director,

Sokrat G. Monakhos – Dr. Sci. (Agriculture), Prof., Head of the Department Botany, Plant Breeding and Seed Technology, ,

Researcher ID: L-5962-2013, Scopus Author ID: 56052882900