Получение кандидатного вакцинного штамма вируса высокопатогенного гриппа птиц подтипа A(H5N1) методом обратной генетики
Автор: Сергеева М. В., Кудря К. С., Плотникова М. А., Веретенников В. В., Джавадов Э. Д., Красков Д. А., Иванова А. А., Петрова П. А., Тарлавин Н. В.
Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology
Рубрика: Молекулярные технологии
Статья в выпуске: 6 т.60, 2025 года.
Бесплатный доступ
Высокопатогенный вирус гриппа птиц подтипа H5N1 активно циркулирует среди домашней и дикой птицы по всему миру и становится причиной массовой гибели домашних птиц. Основные способы борьбы против гриппа птиц - уничтожение поголовья птиц и вакцинация. Указанные меры позволили установить контроль за распространением вируса гриппа подтипа H5N1, обеспечить снижение числа новых вспышек данного заболевания и вирусной нагрузки на окружающую среду. Среди современных технологий создания вакцин против вирусов гриппа А получил распространение метод обратной генетики. В настоящей работе впервые описано создание рекомбинантного штамма вируса гриппа подтипа H5N1 клайда 2.3.4.4b с модифицированным гемагглютинином антигенно актуального вируса, выделенного на территории России в 2023 году. Мы показали, что сконструированный штамм обладает высокими производственными характеристиками в системе РКЭ (развивающиеся куриные эмбрионы) и в клеточной культуре MDCK. Также мы впервые применили его в составе вакцины с добавлением гидроксида алюминия в качестве адъюванта для иммунизации целевых животных и установили, что вакцинация стимулирует выработку антител у цыплят 1-суточного возраста. Нашей целью было конструирование методом обратной генетики вакцинного штамма-кандидата, который может быть использован для создания ветеринарной вакцины против современных вирусов высокопатогенного гриппа птиц подтипа H5N1. Работу проводили в 2024 году в ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России. Источником РНК служил лизированный образец, содержащий генетический материал вируса А/черноголовая чайка/Сыктывкар/19987/2023 (H5N1). Амплифицикацию полноразмерных кДНК копий вирусных генных сегментов HA и NA осуществляли с использованием набора универсальных пар праймеров. Полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) проводили с использованием набора ОТ-ПЦР Экстра микс (ООО «Биолабмикс», Россия) на приборе Gentier 96E («Xi'an Tianlong Science and Technology, Co., Ltd.», Китай). Полученные продукты клонировали в вектор pHW2000, предназначенный для сборки вирусов гриппа методом обратной генетики. Плазмидами трансформировали бактериальные клетки Escherichia coli DH5-a. Нуклеотидную последовательность отобранных клонов верифицировали методом секвенирования по Сэнгеру (ЗАО «Евроген», Россия). Для модификации сайта расщепления НА осуществляли поиск нуклеотидных последовательностей близкородственных низкопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 клайда 2.3.4.4b с использованием базы данных EpiFlu («GISAID», Германия). Нуклеотидные последовательности сайтов расщепления выбранных низкопатогенных вирусов использовали для модификации плазмиды, кодирующей ген НА методом сайт-направленного мутагенеза (ЗАО «Евроген», Россия). Для сборки рекомбинантного вируса методом обратной генетики использовали смесь плазмид на основе вектора pHW2000: модифицированный НА и NA подтипа H5N1 (описаны выше), а также плазмиды, кодирующие гены внутренних и неструктурных белков (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) высокорепродуктивного штамма-донора A/PR/8/34 (H1N1). Смесь плазмид трансфецировали в ко-культуру клеток НЕК293FТ/MDCK, выращенных в среде DMEM/F12. Для трансфекции использовали липосомы GenJect39 (ООО «Молекта», Россия). Через 1 сут проводили смену среды на бессыворочную с TPCK-трипсином («Sigma», США). Далее каждые сутки проверяли наличие цитопатического действия (ЦПД) вируса визуально в световой микроскоп AxioVert A1 («Carl Zeiss AG», Германия), а также контролировали появление вируса в культуральной среде с помощью реакции гемагглютинации (РГА). Для накопления вируса 10-11-суточные РКЭ заражали вируссодержащим материалом в различных разведениях в объеме 0,2 мл в аллантоисную полость. Для определения инфекционной активности в системе РКЭ из вируссодержащей жидкости готовили серии 10-кратных разведений на DPBS (ООО «БиолоТ», Россия) с добавлением антибиотика-антимикотика. Расчет 50 % эмбриональной инфекционной дозы (ЭИД50) проводили по методу L.J. Reed и H. Muench и выражали в lg ЭИД50/мл. Полногеномные нуклеотидные последовательности вируса получали методом секвенирования нового поколения по технологии «Illumina, Inc.» (США). Характерный для низкопатогенных вирусов гриппа птиц фенотип подтверждали по отсутствию репродукции в пермиссивной культуре клеток MDCK в отсутствие эндогенной трипсиноподобной протеазы. Антигенные свойства вируса изучали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) со специфическими крысиными антисыворотками, полученными к вирусам гриппа А подтипа Н5 различных лет выделения, и соответствующими вирусами из коллекции ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФ. Способность штамма вызывать формирование вирус-специфических антител оценивали на 1-суточных цыплятах кросса Декалб Уайт.
Высокопатогенный грипп птиц, вакцина, рекомбинатнтные вакцины, обратная генетика, инфекционные болезни птиц, конструирование плазмид, вирус гриппа а подтипа h5n1
Короткий адрес: https://sciup.org/142247722
IDR: 142247722 | УДК: 619:578.2:577.2 | DOI: 10.15389/agrobiology.2025.6.1071rus
A candidate vaccine strain of highly pathogenic avian influenza virus subtype A(H5N1) constructed by reverse genetics methods
The highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N1 actively circulates among domestic and wild poultry worldwide, causing widespread mortality. The primary methods of combating avian influenza include culling and vaccination. These measures have enabled control of the spread of the H5N1 influenza virus, reducing the number of new outbreaks and the viral load on the environment. Reverse genetics has become a widely used modern technology for creating vaccines against influenza A viruses. This study describes for the first time the creation of a recombinant strain of the H5N1 influenza virus subtype 2.3.4.4b with a modified hemagglutinin of an antigenically relevant virus isolated in Russia in 2023. We demonstrated that the constructed strain exhibits high production characteristics in the ECE (developing chicken embryos) system and in MDCK cell culture. We also used it for the first time in a vaccine with the addition of aluminum hydroxide as an adjuvant for immunization of target animals and found that vaccination stimulates antibody production in 1-day-old chickens. Our goal was to construct a candidate vaccine strain using reverse genetics that could be used to create a veterinary vaccine against modern highly pathogenic avian influenza viruses of the H5N1 subtype. The work was carried out in 2024 at the Smorodintsev Research Institute of Influenza of the Ministry of Health of the Russian Federation. The RNA source was a lysed sample containing the genetic material of the A/black-headed gull/Syktyvkar/19987/2023 (H5N1) virus. Amplification of full-length cDNA copies of the HA and NA viral gene segments was carried out using a set of universal primer pairs. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed using the Extra Mix RT-PCR kit (Biolabmix LLC, Russia) and a Gentier 96E instrument (Xi'an Tianlong Science and Technology, Co., Ltd., China). The resulting products were cloned into the pHW2000 vector, designed for assembling influenza viruses by reverse genetics. Escherichia coli DH5-α bacterial cells were transformed with plasmids. The nucleotide sequence of the selected clones was verified by Sanger sequencing (Eurogen CJSC, Russia). To modify the HA cleavage site, a search for nucleotide sequences of closely related low-pathogenic influenza A/H5N1 viruses of clade 2.3.4.4b was performed using the EpiFlu database (GISAID, Germany). The nucleotide sequences of the cleavage sites of the selected low-pathogenicity viruses were used to modify the plasmid encoding the HA gene by site-directed mutagenesis (Eurogen, Russia). To assemble the recombinant virus by reverse genetics, a mixture of plasmids based on the pHW2000 vector was used: modified HA and NA of the H5N1 subtype (described above), as well as plasmids encoding the genes of internal and nonstructural proteins (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) of the highly reproductive donor strain A/PR/8/34 (H1N1). The plasmid mixture was transfected into a coculture of HEK293FT/MDCK cells grown in DMEM/F12 medium. GenJect39 liposomes (Molecta, Russia) were used for transfection. In 1 day, the medium was changed to a serum-free medium with TPCK-trypsin (Sigma, USA). Then, every day, the presence of cytopathic effect (CPE) of the virus was checked visually using an AxioVert A1 light microscope (Carl Zeiss AG, Germany), and the appearance of the virus in the culture medium was monitored using the hemagglutination assay (HA). To accumulate the virus, 10- to 11-day-old ECEs were infected with virus-containing material in various dilutions in a volume of 0.2 ml into the allantoic cavity. To determine the infectious activity in the ECE system, a series of 10-fold dilutions were prepared from the virus-containing fluid in DPBS (OOO BioloT, Russia) added with an antibiotic-antimycotic. Calculation of 50 % embryonic infectious dose (EID50) was performed according to the method of L.J. Reed and H. Muench and expressed as lg EID50/ml. Whole-genome nucleotide sequences of the virus were obtained by next-generation sequencing using Illumina, Inc. (USA). The phenotype characteristic of low-pathogenic avian influenza viruses was confirmed by the absence of replication in a permissive MDCK cell culture lacking endogenous trypsin-like protease. The antigenic properties of the virus were studied in a hemagglutination inhibition assay (HI assay) with specific rat antisera to influenza A H5 subtype viruses of various years of isolation and corresponding viruses from the collection of the Smorodintsev Research Institute of Influenza. The ability of the strain to induce the formation of virus-specific antibodies was assessed in 10-day-old Dekalb White chickens. A recombinant vaccine strain A/Syktyvkar/PR8/6:2/HA20 (H5N1), a reassortant with a 6:2 genome composition, was assembled using reverse genetics, based on the highly reproductive donor A/PR/8/34 with surface antigens of the highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N1.
Текст научной статьи Получение кандидатного вакцинного штамма вируса высокопатогенного гриппа птиц подтипа A(H5N1) методом обратной генетики
Высокопатогенный вирус гриппа птиц подтипа H5N1 широко циркулирует среди домашней и дикой птицы по всему миру и становится причиной массовой гибели миллионов сельскохозяйственных птиц (1, 2). По данным Всемирной организации здоровья животных (ВОЗЖ; World Organisation for Animal Health, WOAH), в 2022 году более 25 млн домашних и диких птиц были инфицированы высокопатогенным вирусом гриппа птиц A/H5N1 (3). Этот вирус характеризуется пандемическим потенциалом (4, 5). Он обладает способностью преодолевать межвидовой барьер и поражать млекопитающих, в отношении которых ведется сельскохозяйственная деятельность (6). В октябре 2022 года сообщалось о резком увеличении смертности среди животных на ферме по разведению норок в Испании, причиной которой стал вирус A/H5N1 (7). В 2024 году на территории США было зафиксировано инфицирование крупного рогатого скота вирусом A/H5N1 (клайд 2.3.4.4b), при этом большое количество вирусной РНК было обнаружено в образцах молока (8). Основные способы борьбы против гриппа птиц и вызываемых им панзоотий — уничтожение поголовья и вакцинация (9). Указанные меры позволили установить контроль за распространением вируса гриппа подтипа H5N1, добиться снижения числа новых вспышек заболевания и вирусной нагрузки на окружающую среду (10). В настоящее время внедрение в практику специфических вакцин против высокопатогенного гриппа птиц подтипа H5N1 одобрили 58 % стран мира (11).
Среди современных технологий получения вакцинных штаммов вируса гриппа метод обратной генетики (12) занимает особое место, поскольку с его помощью можно не только создавать вакцины с требуемой антигенной специфичностью, но и быстро модифицировать их в случае значимых мутаций циркулирующих полевых штаммов (13). Вирусы, полученные при помощи методов обратной генетики, обладают антигенными свойствами полевых изолятов, при этом не патогенны при внутривенном введении (14).
В России с применением этой технологии несколькими научными группами были получены рекомбинантные вирусы гриппа на основе высоко- патогенного штамма А/курица/Курган/05/2005 (H5N1) (клайд 2.2) (15-17). Вакцина на основе штамма recPR8-H5N1 протестирована в остром эксперименте на цыплятах и показала эффективность в защите от гомологичного высокопатогенного вируса (15).
В Китае с 2004 года при помощи методов обратной генетики были созданы десятки вакцинных вирусов гриппа подтипа H5 для производства инактивированной вакцины. Вакцинный вирус гриппа H5-Re1, который получил гены гемагглютинина и нейраминидазы от изолята A/goose/Guangdong/1/1996 (H5N1), начал использоваться в 2004 году и обеспечил надежную защиту от вирусов гриппа подтипа Н5 клайда 0, клайда 1, клайда 2.2 и 2.3.4 (18). В марте 2008 года вирус H5-Re1 был заменен вирусом H5-Re5, который получил гены гемагглютинина и нейраминидазы от штамма A/duck/Anhui/1/2006 (H5N1). В связи с существенным изменением антигенных свойств циркулирующих вирусов подтипа Н5 в 2015 году был разработан новый вакцинный штамм H5-Re8 на основе вирусов клайда 2.3.4.4b, который, в свою очередь, в 2018 году был обновлен до H5-Re11 (19).
Таким образом, из-за высокой мутационной изменчивости вирусов гриппа птиц подтипа H5 для обеспечения надежной защиты требуется обновление вакцинных штаммов в составе вакцинных препаратов. С 29 апреля 2021 года на территории Евразийского Экономического союза патент на метод обратной генетики прекратил действие (20), и этот метод стал открытым для получения штаммов, в том числе вакцинных штаммов вирусов гриппа для коммерческого использования.
В настоящей работе впервые описано создание рекомбинантного штамма вируса гриппа подтипа H5N1 клайда 2.3.4.4b с модифицированным гемагглютинином антигенно актуального вируса, выделенного на территории России в 2023 году. Мы показали, что сконструированный штамм обладает высокими производственными характеристиками в системе РКЭ и в клеточной культуре MDCK. Также мы впервые применили его в составе вакцины с добавлением гидроксида алюминия в качестве адъюванта для иммунизации целевых животных и установили, что вакцинация стимулирует выработку антител у цыплят 1-суточного возраста.
Нашей целью было конструирование методом обратной генетики вакцинного штамма-кандидата, который может быть использован для создания ветеринарной вакцины против современных вирусов высокопатогенного гриппа птиц подтипа H5N1.
Методика. Исследование проводили в 2024 году в ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России. Все работы выполняли в условиях биологической безопасности для микроорганизмов III-IV групп патогенности, соблюдали требуемые ветеринарные, санитарные правила и нормы (21, 22). Источником РНК служил лизированный образец, содержащий генетический материал вируса А/черноголовая чайка/Сыктывкар/19987/2023 (H5N1). Амплификацию полноразмерных кДНК копий вирусных генных сегментов HA и NA осуществляли с использованием набора универсальных пар праймеров (Bm-HA-1/Bm-NS-890R: 5´-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGC-AGGGG-3´/5´-ATATCGTCTCGTTATTATAGAAACAAGGGTGTTTT-3´ для HA и Ba-NA-1/Ba-NA-1413R: 5´-TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAG-GAGT-3´/5´-ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3´ для NA), описанных в работе (23).
Полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) проводили с использованием набора ОТ-ПЦР Экстра микс (ООО «Биолабмикс», Россия) в полном соответствии с инструкцией производителя на приборе Gentier 96E (« Xi'an Tianlong Science and Technology,
Co., Ltd. », Китай). Температурный профиль реакции был следующим: 40 мин при 55 ° С (ревертирование); 5 мин при 93 ° С (активация полимеразы); 15 с при 93 ° С, 3 мин при 68 ° С (40 циклов амплификации); 4 мин при 72 ° С (дополнительная элонгация). Полученные продукты ОТ-ПЦР клонировали в вектор pHW2000, предназначенный для сборки вирусов гриппа методом обратной генетики (24).
Полученными плазмидами (лигазной смесью) трансформировали бактериальные клетки Escherichia coli DH5- a (коллекция лаборатории векторных вакцин ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России) по стандартному протоколу (25). Скрининг полученных колоний на наличие целевой вставки проводили методом ПЦР с использованием набора БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color (2½) (ООО «Биолабмикс», Россия) со служебными праймерами, фланкирующими ген-вставку (последовательности праймеров: INS-F: 5´-TGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTG-3´, INS-R: 5´-CTAGAAGGCACAGTCGAGGCTGATC-3´). Температурный профиль реакции: 5 мин при 95 ° С (денатурация); 10 с при 95 ° С; 10 мин при 55 ° С, 2,5 мин при 72 ° С (35 циклов). Нуклеотидную последовательность отобранных клонов верифицировали методом секвенирования по Сэнгеру (ЗАО «Евроген», Россия). Работу с нуклеотидными последовательностями проводили с использованием программного обеспечения UGENE v48.0 (ООО НЦИТ «УНИПРО», Россия).
Нуклеотидные последовательности генов НА и NA штамма А/чер-ноголовая чайка/Сыктывкар/19987/2023 (H5N1) получали из базы данных ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФ. Для модификации сайта расщепления НА осуществляли поиск нуклеотидных последовательностей близкородственных низкопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 клайда 2.3.4.4b с использованием базы данных EpiFlu («GISAID», Германия). Нуклеотидные последовательности сайтов расщепления выбранных низкопатогенных вирусов использовали для модификации плазмиды, кодирующей ген НА, методом сайт-направленного мутагенеза (ЗАО «Евроген», Россия). Соответствие внесенных замен также подтверждали секвенированием.
Для сборки рекомбинантного вируса методом обратной генетики использовали смесь плазмид на основе вектора pHW2000: модифицированный НА и NA подтипа H5N1 (описаны выше), а также плазмиды, кодирующие гены внутренних и неструктурных белков (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) высокорепродуктивного штамма-донора A/PR/8/34 (H1N1) из коллекции ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России. Смесь плазмид трансфицировали в ко-культуру клеток НЕК293FТ/MDCK, выращенных в среде DMEM/F12 (ООО «БиолоТ», Россия) с добавлением стабильного глутамина (GlutaMAX, «Gibco», США), 1 мM пирувата натрия (Sodium Pyruvate 100 mM, «Gibco», США), смеси пенициллин/стрептомицин/амфоте-рицин В (Anti-anti 100½, «Gibco», США) и 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ООО «БиолоТ», Россия). В работе были использованы клетки HEK293FT («Invitriogen», США) и клетки MDCK London Line, полученные из Международного ресурсного центра (International Reagent Resource, США). Для трансфекции использовали липосомы GenJect39 (ООО «Мо-лекта», Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Через 1 сут проводили смену среды на бессыворочную с TPCK-трипсином («Sigma», США). Далее каждые сутки проверяли наличие цитопатического действия (ЦПД) вируса визуально (световой микроскоп AxioVert A1, «Carl Zeiss AG», Германия), а также контролировали появление вируса в культуральной среде с помощью реакции гемагглютинации (РГА).
Для накопления вируса 10-11-суточные развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ) заражали вируссодержащим материалом в разных разведениях в объеме 0,2 мл в аллантоисную полость. Через 48 ч инкубации при 34 ° С количество вируса, накопленного в аллантоисной жидкости, определяли в РГА и методом титрования инфекционной активности в РКЭ.
Для определения инфекционной активности в системе РКЭ из ви-руссодержащей жидкости готовили серии 10-кратных разведений на DPBS (ООО «БиолоТ», Россия) с добавлением антибиотика-антимикотика. Каждым разведением заражали по 3-4 РКЭ. Через 48 ч инкубации определяли развитие инфекции в РГА с аллантоисной жидкостью. Расчет 50 % эмбриональной инфекционной дозы (ЭИД 50 ) проводили по методу L.J. Reed и H. Muench (26), представлены десятичные логарифмы 50 % эмбриональной инфекционной дозы (lg ЭИД 50 /мл).
Полногеномные нуклеотидные последовательности вируса получали методом секвенирования нового поколения по технологии «Illumina, Inc.» (США). Выделение вирусной РНК выполняли с использованием набора реагентов Qiagen RNeasy Mini kit («Qiagen GmbH», Германия). Для амплификации полного генома проводили ОТ-ПЦР по протоколу B. Zhou с соавт. (27) с использованием набора реагентов SuperScript III One-Step High Fidelity RT-PCR kit («Life Technologies», США). Полученные ампликоны очищали с помощью набора реагентов Qiagen QiaQuick PCR Purification kit («Qiagen GmbH», Германия). Для подготовки библиотеки был использован набор реагентов Illumina Nextera XT («Illumina, Inc.», США). Секвенирование проводили на платформе Illumina Miseq («Illumina, Inc.», США). Сборку полученных последовательностей на референс осуществляли в программе BWA . Для получения консенсусной последовательности использовали программу SamTools .
Характерный для низкопатогенных вирусов гриппа птиц фенотип подтверждали по отсутствию репродукции в пермиссивной культуре клеток MDCK в отсутствие эндогенной трипсиноподобной протеазы. Использовали 96-луночные культуральные планшеты («Nunc A/S», Дания) с суточным монослоем клеток МDСК London Line, которые культивировали в питательной среде АльфаMEM с добавлением 5 % эмбриональной телячьей сыворотки SС (ООО «БиолоТ», Россия). Из вируссодержащей жидкости готовили серии 10-кратных разведений в культуральной среде АльфаMEM с добавлением антибиотика-антимикотика и ТРСК-трипсина в концентрации 2,5 мкг/мл (или без добавления трипсина). Учет результатов проводили визуально по наличию ЦПД.
Антигенные свойства вируса изучали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (28) со специфическими крысиными антисыворотками, полученными к вирусам гриппа А подтипа Н5 различных лет выделения, и соответствующими вирусами из коллекции ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФ (21). Титром антигемагглютинирующих антител считали наибольшее разведение сыворотки, в котором отсутствовала агглютинация.
Способность штамма вызывать формирование вирус-специфических антител оценивали на 1-суточных цыплятах кросса Декалб Уайт. Вирус накапливали в РКЭ, инактивировали формалином (0,1 %, 24 ч при +4 ° С) и смешивали с гидроксидом алюминия (0,2 %). Животным вводили препарат вируса внутримышечно, 2-кратно с интервалом 14 сут. Доза составила 8,0 lg ЭИД 50 /гол. Наличие антител оценивали в РТГА на 28-е сут после начала эксперимента.
Результаты. Для получения высокорепродуктивного рекомбинантного штамма с поверхностными антигенами вируса гриппа А/H5N1 соответствующие гены гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) были клонированы в вектор pHW2000 из образца генетического материала высокопатогенного вируса гриппа птиц А/черноголовая чайка/Сыктывкар/19987/2023 (H5N1, клайд 2.3.4.4b).
Для выбора вариантов модификации сайта расщепления НА в базе данных был проведен поиск аминокислотных последовательностей низкопатогенных вирусов гриппа птиц подтипа H5, выделенных в последние 5 лет и близких к дикому высокопатогенному вирусу — источнику генов HA и NA. В результате поиска обнаружили, что большинство низкопатогенных вирусов имеют последовательность кливедж-сайта QRETR, содержащую две основные аминокислоты (на рис. 1, А представлена репрезентативная часть выравнивания).
Для снижения риска реверсии вирулентного фенотипа и обеспечения более высокой безопасности работ с вакцинными штаммами подтипа H5 принято оставлять только одну основную аминокислоту в сайте расщепления (29). В результате поиска были обнаружены два варианта сайта расщепления LIETR и QIETR, содержащие только одну основную аминокислоту, — они представлены соответственно в штаммах A/курица/Египет/МЕ-2018/2018 (H5N8, клайд 2.3.4.4b) и A/курица/Египет/rg-F192-VV/2020 (H5N8, клайд 2.3.4.4b). Эти варианты были реализованы при внесении мутаций в гемагглютинин-кодирующую плазмиду методом сайт-направленного мутагенеза (см. рис. 1, Б). В результате получены две конструкции: A/H5N1_HA18 и A/H5N1_HA20; нуклеотидную последовательность внесенных мутаций подтвердили секвенированием (см. рис. 1, В).
НА1 ----
НА1 ----
A/Black-headed_guU/Syktyvkar/KII-19987M/
A/H5N1 HA13
AJHSN1_HA2Q
Рис. 1. Модификация сайта расщепления гемагглютинина. А — выравнивание последовательностей гемагглютинина высокопатогенного штамма А/черноголовая чайка/Сыктывкар/19987/2023 (верхняя строка) и родственных низкопатогенных вирусов гриппа подтипа H5 (приведена часть выравнивания, содержащая регион сайта расщепления). Б — варианты модификаций сайта расщепления гемагглютинина, реализованные в настоящем исследовании A/H5N1_HA18 (сверху) и A/H5N1_HA20 (снизу). В — выравнивание нуклеотидных последовательностей гемагглютинина высокопатогенного штамма А/черноголовая чайка/Сыктывкар/19987/2023 (верхняя строка) и сконструированных мутантных вариантов плазмид (приведена часть выравнивания, содержащая регион сайта расщепления).
A/Black-headed_gull/Syktyvkar/RII-19987M/2023
EPI_ISL_697697_ \_A/chicken/Egypt/ME-2Ol 8/2018
EPI_ISL_4061493_\_A/chicken/Egypt/rg-F192-W/2020 EPI_ISL_16997727_ [_A/mallard/Denmark/Q9179-5/2022
EPI_ISL_17485951_ \_A/bird/Japan/NIE5-0000011/2022 EPI_ISL_16919095_ \_A/Ruddy tumstone/Ddaware/495/2022
|
----► HA2 |
||||||||||
|
R |
« |
R |
R |
K |
R |
G |
||||
|
HAI ---- |
||||||||||
Е
В итоге были сконструированы рекомбинантные плазмиды, кодирующие гемагглютинин с модифицированным сайтом расщепления (два варианта) и нейраминидазу высокопатогенного вируса гриппа птиц А/H5N1. 1076
Варианты модификации сайта расщепления были заимствованы из родственных низкопатогенных вирусов гриппа птиц подтипа Н5.
Получение рекомбинантных вирусов гриппа подтипа H5N1 с модифицированным гемагглютинином проводили методом обратной генетики. Сконструированные вирусы представляли собой реассортанты с составом генома 2:6. Два гена — гены модифицированных HA и NA были заимствованы от вируса гриппа подтипа H5N1 (описаны выше). Шесть генов (соответствующие белки PB2, PB1, PA, NP, M и NS) были заимствованы от вы-сокорепродукивного донора A/PR/8/34 (H1N1) генетической линии UW (30). Вирусспецифическое ЦПД и положительный результат РГА в культуральной среде наблюдали через 6 сут после трансфекции (рис. 2, табл. 1).
Этот материал был использован для заражения РКЭ с целью восстановления и накопления вирусов. Вариант A/H5N1_HA20 был получен уже после первого пассажа, средний титр вируса в РГА составил 64 ГАЕ. Вариант A/H5N1_HA18 в первом пассаже имел титр 2 ГАЕ, однако вирус не был инфекционно активен и на втором пассаже не репродуцировался, что может быть связано с неоптимальной последовательностью сайта расщепления. Далее работы проводили только с рекомбинантным вирусом A/H5N1_HA20. Материал рекомбинантного вируса A/H5N1_HA20, полученного на первом пассаже в РКЭ, аликвотировали и хранили в качестве основного банка при - 70 ° С. Полученному вирусу присвоено название A/Syktyvkar/PR8/6:2/HA20 (H5N1).
Рис. 2. Микрофотографии ко-культуры клеток HEK293FT/MDCK до и после трансфекции: верхний ряд — клеточный контроль, нижний ряд — A/H5N1_HA20; а, б — на дату трансфекции, в, г — 3 сут после трансфекции, д, е — 6 сут после трансфекции (увеличение 10½, микроскоп AxioVert A1, «Carl Zeiss AG», Германия; камера ICc5, «Carl Zeiss AG», Германия).
Низкопатогенный фенотип вируса A/H5N1_HA20 подтверждали по отсутствию репродукции в высокопермиссивной культуре клеток MDCK в отсутствие эндогенной трипсиноподобной протеазы. При заражающей дозе 0,005-0,00005 ТИД 50 /клетка, в присутствии трипсина продуктивная инфекция развивалась в 83-100 % лунок. В отсутствие трипсина вирус A/H5N1_HA20 не вызывал продуктивную инфекцию ни для одной из исследованных заражающих доз (табл. 2). Полученные данные подтверждают, что внесенная модификация сайта расщепления обеспечила вирусу наличие трипсинозависимого фенотипа, характерного для низкопатогенных штаммов, как было показано ранее в аналогичных исследованиях (31).
1. Результаты слепых восстановительных пассажей рекомбинантных вирусов гриппа A/H5N1, сконструированных методом обратной генетики
|
Вирус |
Пассаж M0 (трансфекция) РГА/ЦПД |
Пассаж Е1 (без разведения) РГА/ЭИД 50 |
Пассаж Е2 (без разведения) РГА/ЭИД 50 |
|
A/H5N1_HA18 |
1 ГАЕ/100 % |
2 ГАЕ/0,5 lg ЭИД 50 |
0/нп |
|
A/H5N1_HA20 |
4 ГАЕ/100 % |
32-128 ГАЕ/6,5 lg ЭИД 50 |
* |
Примечание. РГА — реакция гемагглютинации, ЦПД — цитопатогенное действие, ЭИД 50 — 50 % эмбриональная инфекционная доза, нп — не применимо; * — вирус восстановлен после первого пассажа, дальнейшие пассажи см. таблицу 4.
2. Результаты оценки репродукции вируса A/H5N1_HA20 в культуре клеток MDCK в присутствии и в отсутствие трипсина
|
Множественность инфи- |
Цитопатическое действие (ЦПД), % разрушения монослоя |
|
|
цирования, ТИД 50 /клетка |
с добавлением трипсина |
без добавления трипсина |
|
0,005 |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
0,0005 |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
0,00005 |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
Антигенные свойства вируса A/H5N1_HA20 оценивали в РТГА с антисыворотками, специфичными к различным вирусам гриппа А подтипа Н5. Анализ показал, что вирус A/H5N1_HA20 не взаимодействовал с антисыворотками против ранних вариантов высокопатогенных вирусов гриппа подтипа H5N1 (клайды 1, 2.2), при этом взаимодействовал с типоспецифической сывороткой к вирусам гриппа подтипа H5 клайда 2.3.4.4.b (табл. 3). Полученные данные подтверждают антигенную специфичность и антигенную актуальность вируса A/H5N1_HA20.
3. Антигенный анализ штамма A/Н5N1_НА20 (данные реакции торможения гемагглютинации РТГА)
|
Вирус |
Подтип (клайд) |
Крысиные антисыворотки против |
|||
|
NIBRG-14 |
А/chicken/ Kurgan/5/2005 |
А/common tern/Uvs-Nuur/26/2016 |
A/black headed gull/Syktyv-kar/19987/2023 |
||
|
NIBRG-14 H5N1 (1) 640а 40 < 10 < 10 А/chicken/Kurgan/5/2005 H5N1 (2.2) 40 160а < 10 < 10 А/common tern/Uvs- Nuur/26/2016 H5N8 (2.3.4.4b) <10 < 10 160а < 10 A/black headed gull/Syk- tyvkar/19987/2023 H5N1 (2.3.4.4b) <10 < 10 80 320а A/H5N1_HA20 H5N1 (2.3.4.4b) <10 < 10 40 160 Примечание. По главной диагонали (а) указаны титры против гомологичных вирусов. |
|||||
Способность штамма A/H5N1_HA20 вызывать формирование ви-русспецифических антител изучали на 10-суточных цыплятах. Введение инактивированного штамма A/Н5N1_НА20, сорбированного на гидроксид алюминия, вызывало формирование антигемагглютинирующих антител у привитых птиц в среднегеометрическом титре 1:147 (доверительный интервал 100-216) после 1-кратного введения и 1:388 (доверительный интервал
242-622) после 2-кратного введения на 28-е сут после начала эксперимента.
Для оценки стабильности репродуктивных свойств вируса, получения рабочего банка, а также референс-культуры штамма рекомбинантного вируса A/H5N1_HA20 проводили дополнительные пассажи в системе РКЭ (табл. 4). Уже начиная с третьего пассажа после трансфекции, вирус стабильно демонстрировал высокую репродуктивную активность. Материал пятого пассажа штамма был лиофилизирован в качестве референс-культуры. Отсутствие мутаций в генах гемагглютинина и нейраминидазы по сравнению с использованными для сборки вируса плазмидами было подтверждено полногеномным секвенированием. Образцы референс-культуры депонированы в Государственной коллекции вирусов II-IV групп патогенности на базе Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России.
4. Характеристика репродуктивных свойств рекомбинантного вируса гриппа A/H5N1_HA20 на протяжении пяти пассажей в системе растущих куриных эмбрионов (РКЭ)
|
Разведения, использованные для заражения РКЭ, и результирующие |
||
|
Пассаж |
титры, ГАЕ |
Титр, |„ □ШТгл/lITT |
|
10 0 J 10 - 1 1 10 - 2 1 10 - 3 1 10 - 4 1 10 - 5 1 10 - 6 1 10 - 7 1 10 - 8 1 10 - 9 |
lg ЭИД 50 /мл |
|
Е1 |
128 |
128 |
128 |
128 |
128 |
128 |
128а |
7,2 |
|||
|
128 |
128 |
128 |
128 |
128 |
128а |
128а |
|||||
|
E2 |
64 |
64 |
32-64 |
0 |
0 |
0 |
7,2 |
||||
|
64 |
64 |
0 |
0 |
0 |
0 |
||||||
|
64 |
64а |
64а |
4-8 |
0 |
0 |
||||||
|
E3 |
64 |
64 |
64 |
64 |
9,2 |
||||||
|
64 |
64 |
64 |
128а |
||||||||
|
64 |
64 |
128а |
64-128а |
||||||||
|
E4 |
128-256 |
128 |
256а |
256а |
128-256а |
0 |
0 |
8,2 |
|||
|
128 |
128-256 |
128 |
128 |
128 |
0 |
0 |
|||||
|
E5 |
256 |
64 |
64 |
0 |
9,5 |
||||||
|
64-128 |
128 |
256 |
32 |
||||||||
|
128-256 |
128 |
64-128 |
0 |
Примечание. В каждом пассаже число биологических повторностей (эмбрионов) не менее двух; а — эмбрионы, использованные для следующего пассажа.
В настоящее время вирусы гриппа подтипа H5N1 клайда 2.3.4.4b вызывают наибольший падеж диких и домашних сельскохозяйственных птиц на территории Российской Федерации (32). Для производства вакцин против высокопатогенного гриппа птиц в России используют различные вакцинные штаммы, которые, однако, не относятся к антигенно актуальной филогенетической группе 2.3.4.4b. Инактивированная вакцина ВНИИЗЖ-АвиФлуВак (ФГБУ ВНИИЗЖ, Россия) представляет собой инактивированный аминоэтилэтиленимином штамм Ямал подтипа H5N1 (33, 34). Штамм Ямал получен из низкопатогенного изолята A/wildduck/YaNAO/956-12/2021 (H5N1), который выделен в 2021 году и генетически удален от современных высокопатогенных вирусов (35). Тем не менее, по данным разработчиков, вакцина на его основе обеспечивает защиту от близкородственного современным штаммам вируса гриппа клайда 2.3.4.4 A/duck/KChR/1590-20/2020 (H5N8) (36).
Зарегистрированная в 2024 году инактивированная вакцина АВИ-ВАК-ГП-Н5N1R (ООО НПП «АВИВАК», Россия) изготовлена из рекомбинантного штамма PR8-H5N1R (37), полученного по технологии, схожей с описываемой в настоящей статье. К сожалению, разработчики не приводят данных о генетической принадлежности гемагглютинина используемого штамма, поэтому сложно сделать заключение о его антигенной актуальности.
Наиболее часто в России применяется вакцина против гриппа птиц инактивированная эмульгированная Флу Протект Н5 (ФКП «Ставрополь- ская биофабрика», Россия) (38, 39), которая представляет собой классическую суспензию инактивированного формальдегидом патогенного полевого штамма Новосибирский в смеси с масляным адъювантом. Штамм Новосибирский (40) наиболее близок к изолятам с озера Цинхай (Западный Китай), выделенным в мае 2005 году во время вспышки гриппа у дикой водной птицы, которые принадлежат к генетическому клайду 2.2. Таким образом, штамм Новосибирский является представителем антигенно устаревшей группы вирусов. В связи с циркуляцией на территории Российской Федерации вирусов гриппа птиц A/H5 клайда 2.3.4.4b возникает потребность обновления антигенного состава вакцины.
В настоящей работе мы сконструировали высокорепродуктивный рекомбинантный вакцинный штамм A/Syktyvkar/PR8/6:2/HA20 (H5N1), содержащий гемагглютинин и нейраминидазу антигенно актуального эпидемического вируса гриппа птиц A/H5N1 клайда 2.3.4.4b. При этом гемагглютинин был генетически модифицирован таким образом, чтобы обеспечить штамму фенотип низкопатогенных вирусов, что дает возможность нарабатывать вирус в РКЭ. Интересно, что из двух протестированных вариантов модификации только один оказался приемлемым. Несмотря на то, что у большинства родственных низкопатогенных вирусов имеется последовательность сайта расщепления, содержащая глутамин (QRETR), в нашем случает жизнеспособным оказался вирус, содержащий в соответствующем положении лейцин (LIETR). Полученные результаты подчеркивают не-тривиальность задачи получения высокорепродуктивного рекомбинантного штамма A/H5N1, которую ранее отмечали для реассортантов указанного подтипа (30).
Мы показали, что сконструированный в настоящей работе штамм A/Syktyvkar/PR8/6:2/HA20 взаимодействует с референсными антисыворотками против вирусов гриппа подтипа H5N1 клайда 2.3.4.4b, а также способен вызывать формирование антигемагглютинирующих антител в среднегеометрическом титре 1:388 (8,5 log 2 ) у привитых птиц при 2-кратном введении в составе инактивированной вакцины с добавлением в качестве адъюванта гидроксида алюминия до конечной концентрации 0,2 %. По данным литературы, для полноценной защиты птиц от высокопатогенного вируса гриппа необходимо формирование антител в титре не ниже, чем 1:32 в РТГА (5,0 log 2 ) (34). Таким образом, полученные нами предварительные результаты свидетельствуют о пригодности штамма A/Syktyvkar/PR8/6:2/HA20 (H5N1) для разработки на его основе полноценного вакцинного препарата для защиты птиц от высокопатогенного вируса гриппа подтипа H5N1.
Итак, нами получены плазмиды, кодирующие нейраминидазу и модифицированный гемагглютинин высокопатогенного вируса гриппа птиц А/черноголовая чайка/Сыктывкар/19987/2023 (H5N1). Генно-инженерным методом последовательность сайта расщепления гемагглютинина заменена на мотив, характерный для современных низкопатогенных вирусов гриппа птиц А(Н5). Методом обратной генетики собран рекомбинантный вирус гриппа A/Syktyvkar/PR8/6:2/HA20 (H5N1), представляющий собой реас-сортант с составом генома 6:2 на основе высокорепродуктивного донора A/PR/8/34 с поверхностными антигенами высокопатогенного вируса гриппа птиц A(H5N1). Штамм обладал высокой репродуктивной активностью в куриных эмбрионах. Сыворотка к полученному штамму взаимодействовала с вирусами гриппа H5N1 клайда 2.3.4.4b. Полученный вирус может быть использован для создания ветеринарной вакцины против высокопатогенного гриппа птиц H5N1.
