Получение наноразмерных частиц серебра, стабилизированных продуктами гидролиза дрожжевых биополимеров

DOI:

Серебро в ионной форме и в виде наночастиц обладает широким спектром противомикробного действия. Повышенный интерес к использованию серебра в качестве биоцида обусловлен его высокой токсичностью по отношению ко многим микроорганизмам и отсутствием у большинства микроорганизмов устойчивости к этому элементу.

Во многих работах для препаратов, содержащих коллоидные и наноразмерные частицы металла, отмечается большая эффективность в отношении микроорганизмов нежели у ионного серебра [1–3]. Утверждается, что значительная доля ионного серебра при попадании в желудочно-кишечный тракт образует нерастворимые соли и теряет биоцидную активность. Наноразмерное серебро, в тех случаях когда оно стабилизировано, обладает большей устойчивостью и может сохранять активность длительное время. Но стоит отметить, что существуют работы, показывающие обратный биологический эффект [4], а наночастицы рассматриваются как стабилизированный (но менее активный) источник ионного серебра [5].

Системы, содержащие наночастицы серебра, эффективны в борьбе с различными бактериями (кишечной палочкой, сальмонеллой, стафилококком, энтерококком, синегнойной палочкой) [6–8]. Гели с наночастицами серебра, стабилизированные органическими высокомолекулярными веществами, используют для лечения воспалительных заболеваний, вызванных Propionibacterium acne, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus , при этом отмечается большая активность по сравнению с ионными формами серебра. К настоящему времени предложено множество способов получения систем, содержащих коллоидное и нанодисперсное серебро [2, 9, 10–12]. Большинство исследований посвящено композициям, в которые для предотвращения самопроизвольного слипания наночастиц серебра вводятся поверхностноактивные вещества. Устойчивые коллоидные растворы серебра могут быть получены путем восстановления его солей гидразином и боргидри-дами в растворах, содержащих поверхностноактивные вещества, например, додецилсульфат натрия, полиоксиэтилен сорбитан моноолеат (Tween-20), бромид цетилтриметиламмония, поливиниловый спирт [13, 14].

Особый интерес представляют методы, в которых для восстановления серебра и стабилизации образующихся наночастиц используют соединения природного происхождения. В частности, привлекает внимание возможность использования полисахаридных и белковых матриц в качестве стабилизирующего компонента. Удачные примеры использования растительных и дрожжевых экстрактов для синтеза сферических наночастиц серебра приведены в обзоре [9] и работах [15, 16].

Простой метод получения композитов, содержащих наночастицы серебра, основан на процессах, протекающих в водно-щелочных растворах аммиачных комплексов серебра в присутствии природного полисахарида – арабиногалактана [17, 18]. Образование зародышей металлического серебра происходит за счёт восстановления комплексных ионов концевыми альдегидными группами полисахарида. Добавление щёлочи приводит к частичному гидролизу полисахарида и накоплению в растворе восстановителя – олигосахаридов, чем и обеспечивается оптимальный рост зародышей серебра.

Предложены способы, в которых для восстановления серебра в водных растворах используют микроорганизмы [9]. Считается, что ионизованные карбоксильные группы аминокислот, а также амидные группы ответственны за начальный этап образования наночастиц – сорбцию ионных форм серебра. Восстанавливающие группы в составе альдегидов и кетонов вовлекаются в процесс взаимодействия с ионами серебра и обеспечивают рост зародышей [19]. Например, при использовании для биосинтеза живой культуры Saccharomyces cerevisiae отмечается образование наночастиц не только внутри клеток, в среде богатой восстановителями, но и внутри клеточной стенки, повреждаемой во время гибели микроорганизмов [20].

Показано, что введением некоторого количества щёлочи в растворы ионного серебра, содержащие погибшую культуру клеток бактерий Aeromonas sp. SН10, можно ускорить образование металлических наночастиц на поверхности клеток и вблизи неё [21]. Характеристики получаемых наночастиц зависят от концентрации аммиачных комплексов серебра и рН раствора. Следует отметить, что растущие зародыши зафиксированы матрицей полимеров клеточной стенки и не имеют возможности агрегировать.

Сорбировать серебро способны многие микроорганизмы. Максимальная сорбционная ёмкость составляет 15–25 мг серебра на 1 г сухой биомассы [22]. Способность клеточной стенки микроорганизмов поглощать ионы тяжелых металлов с последующим образованием металлических гранул используется в химической технологии, в частности для извлечения металлов из промышленных растворов [23].

Цель работы – получение стабилизированных наночастиц серебра с использованием в качестве восстановителя и стабилизатора продуктов частичного гидролиза дрожжевой клеточной стенки.

Материалы и методы

В работе использованы следующие реактивы и материалы: аммиак марки x.ч., нитрат серебра марки x.ч. («Реахим»), D-(+) – глюкоза (99%, «Acros organics»), дрожжи Saccharomyces cerevisiae ГОСТ 171-81 (Новосибирский дрожжевой завод), ферментативный препарат «Целлолюкс 2000» 2000 ед./г (ПО «Сиббиофарм», г. Бердск, Новосибирской обл.).

Механоферментативный гидролиз дрожжей проводили согласно ранее опубликованной методике [24]. Для этого воздушно-сухую биомассу дрожжей с добавлением ферментного препарата «ЦеллоЛюкс 2000» механически активировали в планетарной мельнице АГО-2. Для протекания реакции гидролиза образовавшийся композит разрушенных дрожжевых клеток и ферментов прессовали в таблетки и прогревали при температуре действия ферментов.

Восстановление аммиачных комплексов серебра

К 200 мг исходных дрожжей или дрожжей, подвергнутых механической и ферментативной обработке, добавляли 1 мл рабочего раствора, содержащего 10 мл воды, 1 мл 1 мМ раствора АgNО 3 , 300 мкл концентрированного раствора аммиака. Препараты выдерживали при комнатной температуре в течение суток, после чего готовили образцы для электронномикроскопического исследования.

В случае восстановления ионного серебра глюкозой (эксперимент без стабилизатора) или в присутствии водорастворимых дрожжевых полимеров к 10 мл рабочего раствора на магнитной мешалке медленно добавляли по 1 мл раствора глюкозы (25 мг/мл) или дрожжевого экстракта.

Дрожжевой экстракт, содержащий растворимые полимеры, готовили, центрифугируя суспензию (200 г/л) механоферментативно гидролизованной дрожжевой биомассы (суспензия перемешивалась на магнитной мешалке при 120 об./мин при комнатной температуре в течение 15 мин).

Приготовление препаратов для просвечивающей электронной микроскопии

Каплю (20 мкл) образца помещали на плёнку «Парафильм», сверху накладывали медную сеточку с формваровой пленкой. Через 60 с сеточку снимали, излишек жидкости оттягивали фильтровальной бумагой, высушивали на воздухе и помещали в чашку Петри. Высушенные образцы исследовали с помощью электронного просвечивающего микроскопа Н-600 (Хитачи, Япония).

Приготовление препаратов для просвечивающей электронной микроскопии ультратонких срезов Образцы дрожжей фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида на растворе Хенкса в течение 16 ч, затем отмывали в растворе Хенкса и проводили обезвоживание в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и ацетоне. После обезвоживания образцы пропитывали в течение 12 ч в смеси ацетона и эпона-аралдита (1:1), затем полимеризовали в течение 48 ч. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме Райхерт-Янг (Австрия) и изучали в электронном микроскопе Н-600 (Хитачи, Япония).

Результаты и обсуждение

Для корректного достижения поставленной цели был проведён ряд экспериментов по постепенному усложнению системы «наночастицы серебра – стабилизатор». В основу способа получения наночастиц была положена классическая реакция восстановления аммиачного комплекса нитрата серебра. Далее при усложнении восстановителя/стабилизатора от мономерной глюкозы до частично гидролизованных клеточных стенок при помощи UV-Vis-спектроскопии    и просвечивающей электронной микроскопии установлено образование наночастиц серебра, изучены их размер, форма и стабильность.

Образование наночастиц, стабилизированных растворимыми биополимерами

В качестве самого простого случая изучено образование наночастиц серебра восстановлением при помощи глюкозы без добавления стабилизаторов. Из данных электронной микроскопии видно, что полученные частицы имеют сферическую форму и узкое распределение по размерам (рисунок 1) . Однако полученный коллоид неустойчив и спустя 3–5 ч выпадает в осадок из-за агрегации ничем не стабилизированных частиц (рисунок 2) .

Рисунок 1. Электронная микрофотография наночастиц серебра, полученных восстановлением глюкозой без стабилизатора (масштаб – 0,3 мкм)

• Figure 1.    Electron microphotograph of the silver nanoparticles obtained through reduction with glucose in absence of stabilizing agent (scale bar – 0.3 μm)

Рисунок 2. UV-Vis-спектр исходного коллоидного раствора (I) , раствора через 3 ч ( II) и через 5 ч (III)

• Figure 2.    UV spectrum of the initial colloid solution (I) , solution after 3 hours ( II ) and after 5 hours (III)

Из литературы известно, что для наночастиц серебра в диапазоне их диаметров от 20 до 100 нм наблюдается линейная зависимость между их размером и положением пика на спектре. Например, увеличение размеров частиц с 25 (390 нм) до 50 нм приводит к смещению пика к длине волны 420 нм [17, 25–28]. Проведённые эксперименты подтверждают литературные данные (рисунок 2) . Первоначально образование агрегатов проявляется на спектре в виде уширения исходного пика в длинноволновой области, а в последствии – в виде образования дополнительных широких пиков в области 500–600 нм.

Известно, что молекулы биополимеров влияют на рост наночастиц и способствуют образованию сложных дендритных структур, обладающих хорошей устойчивостью.

Так, в литературе отмечалось образование наноструктурированных дендритных структур при синтезе в присутствии синтетических полимеров [29, 30].

Согласно механизму образования зародышей элементного серебра [19] в подобных системах необходимо, чтобы биополимеры имели в своём составе не только восстанавливающие функциональные группы, но и группы, отвечающие за первичное образование солей. Наиболее подходящими для данной цели веществами являются полимеры, содержащиеся в дрожжевых гидролизатах. Входящие в их состав белковые молекулы участвуют в образовании солей и стабилизации полученных дендритов, а низкомолекулярные углеводы играют роль восстанавливающего реагента.

На рисунке 3 продемонстрирована микрофотография дендритных структур, синтезированных в присутствии растворимых биополимеров, выделенных из клеточной стенки дрожжей механически активированным ферментативным гидролизом.

Пик на UV-Vis-спектре в области 420 нм, приписываемый частицам с размерами около 50 нм, свидетельствует о том, что данные дендритные образования являются нанострукту-рированными (рисунок 4) . Отсутствие уширения и дополнительных пиков в длинноволновой области спектра свидетельствует об отсутствии агрегатов, а следовательно, о стабильности полученных частиц.

Рисунок 3. Наноструктурированные дендритные образования серебра, полученные в растворе биополимеров, электронная микрофотография образований (масштаб – 2 мкм)

• Figure 3.    Nano-structured dendritic formations of silver obtained in the solutions of biopolymers, electron microphotograph of the formations (scale bar – 2 μm)

Рисунок 4. Наноструктурированные дендритные образования серебра, полученные в растворе биополимеров: UV-Vis-спектр исходного раствора наноструктурированных образований (I) , раствора через 3 ч ( II ) и через 5 ч (III)

Figure 4. Nano-structured dendritic formations of silver obtained in the solutions of biopolymers: UV spectra of the initial solution of nanostructured formations (I) , solution after 3 hours ( II ) and after 5 hours (III) .

Использование полимеров, входящих в состав дрожжевой биомассы, позволяет получать стабилизированные наноструктурированные образования серебра. Это позволяет предполагать перспективность использования частично гидролизованных дрожжевых клеточных стенок в качестве стабилизирующей матрицы.

Образование наночастиц, стабилизированных полимерами клеточных стенок

Для оценки эффективности проведения механоферментативной обработки, как подготовки клеточных стенок к восстановлению и стабилизации наночастиц, были проведены эксперименты с нативной, механически активированной и механоферментативно гидролизованной дрожжевой биомассой.

В случае обработки исходных клеток S. cerevisiae аммиачным раствором нитрата серебра наблюдается лишь незначительное восстановление серебра. На микрофотографии (рисунок 5 –6) отчётливо видны две различные по составу части исходной клетки: слабо контрастированная клеточная стенка и сильно контрастированная внутриклеточная часть. Также в околоклеточном пространстве зафиксированы наноразмерные (15–25 нм) частицы серебра, полученные, по-видимому, восстановлением углеводами, которые присутствуют в исходном препарате дрожжей.

Отмеченная низкая способность исходных клеточных стенок восстанавливать серебро, по-видимому, связана с незначительным количеством доступных групп, способных служить центрами зародышеобразования. В нативной стенке полисахариды формируют устойчивые структуры, в которых содержание свободных восстанавливающих концов невелико [31, 32]. В этом случае часть растворенного серебра способна только проникнуть по каналам клеточной стенки внутрь клетки и восстанавливаться внутриклеточными компонентами.

Рисунок 5. Микрофотография исходных дрожжей, обработанных аммиачным раствором нитрата серебра: снимок целой клетки на формваровой пленке (масштаб – 1 мкм)

• Figure 5.    Microphotograph of initial yeast treated with ammonia solution of silver nitrate: image of the intact cell adsorbed on the formvar film (scale bar – 1 μm)

Рисунок 6. Микрофотография исходных дрожжей, обработанных аммиачным раствором нитрата серебра (ультратонкий срез клетки, масштаб – 1 мкм)

• Figure 6.    Microphotograph of initial yeast treated with ammonia solution of silver nitrate (ultrathin section of a cell, scale bar – 1 μm)

Как показано ранее [33], после механической обработки неразрушенные клетки имеют искажённую форму, целостность большинства клеток нарушается, супрамолекулярная структура разупорядочивается. Стенки разрушенных

Вестник ВГУИТ/Proceedings of VSUET, Т. 81, № 1, 2019 клеток имеют вид лент, слабо контрастированных при обработке аммиачным раствором нитрата серебра (рисунок 7) . Как и в случае исходных дрожжей, можно предположить, что низкая реакционная способность связана с недостаточным содержанием необходимых восстанавливающих функциональных групп.

Рисунок 7. Дрожжевые клеточные стенки после механической активации и обработки аммиачным раствором нитрата серебра (ультратонкий срез, масштаб – 0,5 мкм)

• Figure 7.    Yeast cell walls after mechanical activation and treatment with the ammonia solution of silver nitrate (ultrathin section; scale bar – 0.5 μm)

В сравнительных экспериментах установлено, что в ходе механической обработки реакционная способность компонентов клеточной стенки по отношению к ферментативному гидролизу значительно увеличивается. По-види-мому, имеет место нарушение взаимодействий между структурными элементами клеточной стенки (глюкан, гликопротеины, хитин), но этого нарушения недостаточно для образования и роста зародышей серебра. Таким образом, наблюдаемые изменения морфологии клеток слабо затрагивают надмолекулярную организацию структурных полимеров клеточной стенки, но создают условия для взаимодействия структурных элементов с растворами ферментов.

В аналогичных условиях исследованы образцы, подвергнутые механической обработке и последующему ферментативному гидролизу. Данные электронной микроскопии (рисунок 8 –9) показывают, что продукты механофермента-тивного гидролиза более активны в процессе получения наноразмерных частиц серебра, чем исходные дрожжевые клетки и клетки, подвергнутые механической активации.

Рисунок 8. Препарат дрожжей, подвергнутых механоферментативному гидролизу и обработанный аммиачным раствором нитрата серебра: снимок целой клетки на формваровой пленке (масштаб – 1 мкм)

Figure 8. Yeast after mechanoenzymatic hydrolysis and treated with the silver nitrate: cells on formvar film (scale bar – 1 μm)

Рисунок 9. Препарат дрожжей, подвергнутых механоферментативному гидролизу и обработанный аммиачным раствором нитрата серебра: электроноплотные частицы на фрагментах разупорядоченных клеточных стенок (ультратонкий срез, масштаб – 0,4 мкм)

Figure 9. Yeast after mechanoenzymatic hydrolysis and treated with the silver nitrate small electron dense silver nanoparticles are seen on fragments of cell walls, ultrathin section (scale bar – 0.4 μm)

Фрагменты клеточных стенок в препаратах после механической и ферментативной обработки покрыты частицами серебра, что говорит о повышении восстанавливающей способности клеточной стенки, по-видимому, за счет увеличения концентрации концевых карбонильных групп углеводов (рисунок 9) . Размеры образующихся частиц серебра не превышают 65–75 нм, варьируя условия обработки можно получать частицы в диапазоне 15–80 нм.

В ходе механической и ферментативной обработки полисахариды клеточной стенки гидролизуются (общее содержание полисахаридов в сухой клеточной стенке – около 70%), понижается степень их полимеризации, и клеточная стенка приобретает дополнительные карбонильные группы, необходимые для восстановления серебра.

Обнаружены изменения в восстановлении серебра в жидкой фазе в присутствии продуктов гидролиза клеток. Часть углеводов в результате гидролиза становится водорастворимой и экстрагируется в раствор. Это приводит к тому, что в межклеточном пространстве тоже проходят процессы восстановления. Присутствуют отдельные наночастицы (60–75 нм), полученные восстановлением из водного раствора углеводами с более низкой степенью полимеризации. Показано, что при механической обработке и ферментативном гидролизе образуется 7,8% (от массы клетки) растворимых сахаров,