Получение удвоенных гаплоидов Cucurbita pepo L

Cucurbita pepo L. объединяет однолетние травянистые растения, принадлежащие к Семейству Cucurbitaceae Juss, роду Cucurbita L. и имеет широкое распространение в мире ввиду большой экономической значимости. К этому виду относятся кабачок, патиссон, и сама тыква, плоды которой употребляют только в зрелом виде, и она имеет длительный срок хранения. Кабачок и патиссон зачастую называют летними овощными тыквами, и в англоязычной литературе они известны под общим названием «summer squash». Это сезонные и высокопродуктивные овощные культуры, которые часто используют в пищу в виде незрелых плодов через несколько дней после цветения, задолго до того, как плоды достигнут фазы биологической спелости. В переработку на икру идут более зрелые плоды кабачка и патиссона [1–3].

Наиболее ценными представителями вида C. pepo L. с точки зрения производства овощной продукции являются тыквы и кабачки. Согласно последним данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций за 2019 год, тройку стран лидеров по количеству произведенной продукции тыкв, кабачков и патиссонов (культуры не разграничены статистикой) составляют: Китай – 8,3 млн т., Украина – 1,3 млн т, Россия – 1,1 млн т. По возделываемым площадям лидируют Китай (материковая часть) – 450,6 тыс. га, Камерун – 176,1 тыс. га и Турция – 126,2 тыс. га. Всего в мире за 2019 год посевные площади, занятые под тыквенными культурами, составили около 1 539 023 га, с которых было собрано 22 900 826 т продукции. Посевные площади только под тыквами, кабачками и патиссонами составили 19,4% от общей площади, занятой под тыквенными культурами, урожай с них составил 9,6% от общего [FAOSTAT].

Основной мировой тенденцией в производстве овощей является использование гибридов F 1 . Помимо проявляющегося эффекта гетерозиса производство гибридных семян позволяет защищать авторские права производителей селекционно-семеноводческой продукции. Самыми крупными мировыми производителями семян овощей являются такие компании, как Semenis (дочерняя компания транснациональной корпорации Bayer), Syngenta (дочерняя компания китайской госкорпорации ChemChina), Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel BV (Нидерланды). Исходя из отчетов, представленных в открытых источниках, ассортимент семян тыквенных культур данных компаний состоит исключительно из гибридных форм.

На 2021 год в Государственном реестре селекционных достижений, допущенных к использованию в Российской Федерации, зарегистрировано 290 сортов и гибридов C. pepo L., оригинаторство 24 из которых принадлежит ФГБНУ ФНЦО, занимающегося селекцией тыквенных культур уже более 100 лет. 44% селекционных достижений культур данного вида составляют гибриды.

Небольшое количество гибридов и превалирование над ними сортов в российской селекции тыквенных культур свидетельствует об отсутствии у селекционеров возможности внедрять технологии, позволяющие быстро создавать родительские линии для гибридов F1. В связи с этим выровненный линейный материал приобретает особую ценность в селекционном процессе. Линии должны обладать комплексом хозяйственно ценных признаков: устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам внешней среды, женским типом цветения, высокими вкусовыми и технологическими качествами. Данные признаки тяжело совместить в одном образце, но при помощи методов биотехнологии можно ускорить селекционный процесс.

Создание выровненной по хозяйственно ценным признакам линии методами классической селекции может быть достигнуто только за счет проведения искусственного самоопыления (инцухтов) в течение 7-10 лет, но и в этом случае нельзя достигнуть полной гомозиготности. Для растений, относящихся к виду C. pepo , несмотря на наличие достаточно крупных цветков, с которыми легко проводить скрещивания, процесс искусственного самоопыления трудоемок ввиду особенностей культуры. У этого вида цветки раздельнополые, и достаточно тяжело подобрать мужские и женские цветки одного возраста. Все скрещивания необходимо проводить вручную и индивидуально изолировать каждый цветок. Все эти моменты обуславливают большие временные и трудовые затраты, необходимые для создания новых чистых линий и гибридных комбинаций F 1 . Использование технологий получения удвоенных гаплоидов (DH-технологии) позволяет создать 100% гомозиготную линию в течение 1-2 лет, что в свою очередь многократно повышает эффективность селекционного процесса. Кроме того, конъюгация и кроссинговер хромосом в профазе I мейоза, их случайное расхождение в анафазе I и сочетание в микроспорах и мегаспорах, значительно повышают число классов расщепления. Каждый удвоенный гаплоид является отдельным генотипическим и фенотипическим образцом с уникальным сочетанием гомозиготных аллелей. Наиболее ценные «исключительные» генотипы возникают с небольшой частотой, в связи с чем особенно важно повышать эффективность технологий, увеличивая выход удвоенных гаплоидов.

Получение удвоенных гаплоидов у C. pepo весьма актуально не только по причине ускорения селекционного процесса, но и за счет реализации значительного потенциала гаметоклональной изменчивости, заложенной у этого вида. Вид C. pepo отличается огромным многообразием форм. В связи с большой амплитудой изменчивости, присущей виду, A.N.Duchesne называл его Cucurbita polymorpha . Н.И. Вавилов отмечал, что в пределах C. pepo L. имеются формы, легко скрещивающиеся между собой и в то же время отличающиеся примерно в 1000 раз по массе плодов [5]. Вид характеризуется огромнейшим разнообразием формы плода (от круглой до очень длинной или до плоской) и окраски (зеленой, оранжевой, желтой, белой). При этом интенсивность окраски также сильно варьирует от яркой до бледной, окраска – от почти черной до почти белой. Цветовые узоры на плоде могут включать продольные полосы различной ширины и пятнистость, сетчатость, а также иметь сложный двухцветный узор, так что на поверхности одного плода может присутствовать сразу четыре цвета [3].

Среди вида C. pepo L. было выделено восемь групп, принадлежащих к двум подвидам (subsp. pepo и subsp. texana), отчетливо различающихся по форме плода и выращивающихся для кулинарных целей, которые в англоязычной литературе получили следующие названия: pumpkin, scallop, acorn, crookneck, straightneck, cocozelle, vegetable marrow, zucchini [6,7].

Проведенное молекулярное исследование генетического разнообразия рода Cucurbita с использованием SSR маркеров показало, что C. pepo L. содержит, безусловно, наибольшую генетическую изменчивость среди видов, относящихся к этому роду. Paris в 2016 году в своей работе представил наиболее полную характеристику вида C. pepo L., отражающую все генетическое разнообразие [3].

Получение генетически стабильных (100% гомозиготных) удвоенных гаплоидных (DH) линий за одно поколение может значительно ускорить селекционный процесс. Кроме того, поскольку у гаплоидов и удвоенных гаплоидов все гены находятся в гомозиготном состоянии, все рецессивные признаки у таких растений хорошо видны, так как они не маскируются под действием доминантных аллелей. Селекционеру удобно проводить отбор желаемых генотипов, фиксировать мутации и проводить скрининг уже в первом поколении. Кроме того, отбор на гаплоидном уровне может позволить исключить генотипы, обладающие нежелательными мутациями [8]. Полученные гомозиготные DH-растения могут напрямую стать новыми сортами или ценными родительскими линиями для получения гибридных растений F 1 [9]. Наличие DH-линий в большом количестве повышает эффективность селекционных программ, в связи с чем очень желательны надежные протоколы индукции гаплоидов для создания гомозиготных линий.

Исследования по получению удвоенных гаплоидов и их использованию для решения фундаментальных и практических задач уже проводятся в мире в течение 100 лет. На данный момент протоколы производства удвоенных гаплоидов уже описаны для 384 видов. Они разработаны путем применения различных in vivo и in vitro гаплоидных технологий, таких как опыление облученной пыльцой, межвидовые и внутривидовые скрещивания, скрещивание с естественно или искусственно полученными линиями гаплоидных индукторов, культура неопыленных завязей или семяпочек in vitro и культура изолированных пыльников или микроспор in vitro [10]. Для культур, относящихся к семейству Cucurbitaceae , большая часть протоколов разработана для огурца и дыни, в то время как для культур, относящихся к такому экономически значимому виду как C. pepo , их количество невелико, в связи с чем их разработка является крайне актуальной.

История открытия гаплоидов и первыегаплоиды у культур семейства Cucurbitaceae

Первые два гаплоидных покрытосеменных растения, для которых было получено цитологическое подтверждение, были обнаружены у дурмана обыкновенного (Datura stramonium L.) при проведении опытов с применением холодовой обработки для индукции хромосомных нарушений [11,12]. Однако, опираясь на сведенья Harland [13], можно предположить, что гаплоиды были впервые описаны несколько ранее на хлопке сорта Man Cotton, образующем относительно многочисленные пары близнецов в семенах [14]. Вскоре за этим последовали аналогичные открытия гаплоидов и у других видов, например, Nicotiana tabacum [15], Triticum compactum [16], Lucopersicum esculentum [17]. Список видов, у которых обнаруживались гаплоиды, стремительно пополнялся, многие ученые, занимающиеся генетикой и селекцией достаточно быстро поняли перспективность этого открытия, появилось большое количество научных работ, связанных с гаплоидией, и первые обзорные публикации [18,19]. На возможность получения гомозиготных линий путем удвоения хромосом еще в 30-е годы XX века указали в своих работах многие отечественные и зарубежные ученые [20–24], но разработка методики и практическое ее использование для ускоренного создания гомозиготных диплоидных линий были осуществлены лишь в 1949 году [25]. Chase признан одним из первых, кто включил гаплоиды в программу селекции, в данном случае путем индукции гаплоидов в кукурузе через партеногенез и с последующим удвоением их хромосомного набора [26]. Основной прорыв гаплоидных технологий произошел после открытия процесса анд-рогенеза, когда было показано, что гаплоидные растения могут быть получены из изолированных пыльников в культуре in vitro [27,28].

Несмотря на то, что открытие гаплоидных форм произошло в начале ХХ века, только через тридцать лет удалось обнаружить гаплоиды в семействе Cucurbitaceae . Первое упоминание об обнаружении гаплоидных близнецовых зародышей в семенах, полученных от межвидовых скрещиваний C. maxima x C. moschata , произошло в работе Hayase, вышедшей в 1954 году. Автору удалось не только подробно описать выращенные из близнецовых зародышей растения, но и получить кариологическое подтверждение гаплоидного набора хромосом. В работе отмечалось, что эти растения формировали женские цветки в большом количестве, в то время как мужские цветки либо вообще не образовывались (в полевых условиях), либо их можно было обнаружить (в условиях теплицы), но при этом пыльники в них были пустыми белого или коричневого цвета. При опылении женских цветков нормальной пыльцой различных диплоидных растений происходило завязывание плодов, однако семян в них не было [29].

В 1958 году L.E. Aalders, проводя опыты с семенами огурца Cucumus sativus L., обнаружил, что при помещении в воду большая часть семян огурца тонет, а другая часть остается на поверхности воды. При извлечении зародышей из плавающих на поверхности воды семян и помещении их на питательную среду в культуре in vitro , ему удалось обнаружить и вырастить гаплоиды. Всего им было получено 13 моноплоидных растений (термин «monoploids» автор использовал в своих статьях), но только восемь из них удалось довести в теплице до цветущего состояния [30]. Несмотря на произведенные обработки колхицином и образующиеся плоды, получить семян от самоопыления в этом исследовании так и не удалось. Способ выделения гаплоидов из флотирующих на поверхности воды семян, предложенный Aalders, до сих пор успешно используется с различными модификациями, как у огурца, так и у других культур семейства Тыквенные [31,32].

Гаплоидные растения также удалось получить у дыни в потомстве от межвидового скрещивания Cucumis melo L. (2n = 2x = 24) с Cucumis ficifoliu s A. Rich (2n = 4x = 48). При этом количество обнаруженных гаплоидов было крайне низким (до трех гаплоидных зародышей на 1000 семян) и зависело от генотипа и сезона [33].

Низкий уровень спонтанного образования гаплоидов в природных популяциях у культур семейства Cucurbitaceae (менее одного гаплоидного зародыша на тысячу семян) (Aalders, 1958) способствовал проведению исследований по индукции гаплоидии с использованием различных химических и физических факторов и биотехнологических методов in vitro. Однако по сравнению с другими сельскохозяйственными культурами, для которых уже в 70-х годах ХХ века были созданы сорта с использованием DH-линий (сорт рапса (Brassica napus) Maris Haplona [34], сорт Mingo у ячменя (Hordeum vulgare) в 1980 году [35] и т.п.), сообщения об успешном получении гаплоидов в этом семействе были крайне малочисленными.

Использование рентгеновских лучей (Х-лучи) в качестве мутагенного фактора широко использовалось учеными в 50-60-х годах XX века. В 1958 году при проведении опытов по облучению семян арбуза рентгеновскими лучами (48,000 r) было получено диплоидное растение, у которого одна из ветвей была гаплоидной. Листья и цветки на гаплоидной плети были меньшего размера, а стебель и лепестки были тоньше. Получить плод на этой ветви не удалось, несмотря на предпринятые попытки опыления [36]. Это одна из первых работ по индуцированному получению гаплоидов у культур семейства Cucurbitaceae .

Первые исследования по индукции андрогенеза в семействе Cucurbitaceae были проведены на Luffa cylindrica в 1979 году [37]. Пыльники, выделенные из бутонов длиной от 1 до 4 см, культивировали на питательной среде MS. Авторы протестировали большое количество разнообразных регуляторов роста в различных сочетаниях, добавленных в индукционную питательную среду, в результате чего удалось добиться образования белозеленого каллуса в растрескивающихся пыльниках. Цитологические исследования показали, что часть микроспор при культивировании переходила на спорофит-ный путь развития. Проведенные эксперименты по индукции органогенеза из полученного каллуса при его субкультивировании на различных питательных средах не увенчались успехом, и получить растения не удалось.

В 1983 году было сообщено о получении первого гаплоидного растения арбуза в культуре изолированных пыльников in vitro , однако при пересадке в грунт это растение погибло [38].

C тех пор как San Noeum в 1976 году получил первые гаплоидные растения в культуре неоплодотворенных завязей/семяпочек in vitro у ячменя Hordeum vulgare [39], работы по культивированию женского гаметофита были продолжены и на других сельскохозяйственных культурах. Первое сообщение об успешном получении удвоенных гаплоидов в семействе Cucurbitaceae было сделано Dumas de Vaulx R. и Chambonnet D. в 1985 году [40]. Авторам удалось индуцировать гиногенное развитие и получить растения C. pepo L. в культуре неопыленных семяпочек in vitro. В своей работе авторы изучили влияние стадии развития женского гаметофита на образование эмбриодов у семи коммерческих гибридов F1 (Ambassador, Black Beauty, Diamant, Greyzini, Opal, Tara, Tarmino). Наилучшие результаты были получены из семяпочек, извлеченных из женских цветков, находящихся на стадии за один день до распускания цветка. Максимальный выход составил 4,3 эмбриоида на 100 культивируемых семяпочек. При этом было отмечено, что из одной семяпочки могло образовываться сразу несколько эмбриоидов. Всего в теплицу было высажено более 50 растений, большинство из которых имели диплоидный набор хромосом, однако встречались мик-соплоиды, анеуплоиды, полиплоиды. При этом отмечалось, что фенотипы полученных в культуре неопыленных семяпочек диплоидных растений отличались от гибридных растений-доноров, и, кроме того, индивидуальные растения отличалось между собой. Потомство, получен- ное от самоопыления диплоидных растений-регенерантов при высадке на следующий год и оценке по морфологическим признакам, выглядело достаточно выровненным. Все это свидетельствовало о гаметофитном происхождении полученных растений [40,41].

Работы по индукции гаплоидии при культивировании неопыленных завязей/семяпочек в дальнейшем продолжились и на других культурах семейства Cucurbitaceae [42–46].

Одной из самых популярных технологий получения гаплоидов в семействе Cucurbitaceae является технологии спасения партенокарпических зародышей, индуцированных опылением γ-облученной пыльцой. Впервые об успешном получении гаплоидов при опылении пыльцой, обработанной Со⁶⁰, было сообщено для дыни Cucumis melo L. [47], а впоследствии эта технология была применена на огурце [48–50]. Значительно позже появились сообщения об использовании этой технологии у видов, относящихся к роду Cucurbita : для кабачка C. pepo [51], тыквы мускатной C. moschata [52] и тыквы крупноплодной C. maxima [53].

Основные достижения по получению удвоенных гаплоидов у культур семейства Cucurbitaceae были освещены в ряде обзоров [54–58] и опубликованы в виде протоколов, в том числе и в вышедшей в 2021 году книге «Doubled Haploid Technology» под редакцией Jose M. Segui-Simarro [10,59–63].

Современное состояние исследованийпо получению удвоенных гаплоидов C.pepo.L.

Для получения удвоенных гаплоидов у культур C. pepo L. обычно используют три различных метода: партеногенез in situ стимулированный обработанной/облученной пыльцой, гиногенез in vitro (культура неопыленных семяпочек in vitro ) и андрогенез in vitro (культура пыльников/микроспор in vitro ) [56,64]. При партеногенезе in situ индукция развития гаплоидного партеногенетического эмбриоида происходит из яйцеклетки под воздействием in vivo опыления облученной пыльцой. В качестве источника облучения пыльцы чаще всего применяют γ -лучи ( γ -облучение), используя ⁶⁰Co и ¹³⁷Cs, либо Х -лучи (рентгеновское облучение). Впоследствии, через 3-4 недели образовавшийся эмбриоид извлекается из семени и помещается на питательную среду в условия in vitro , для прорастания и развития во взрослое растение. При андрогенезе и гиногенезе, изолированные пыльники или семяпочки из неопыленных завязей культивируют на индукционной питательной среде в условиях in vitro . В этих случаях под воздействием различных индуцирующих факторов (температурные обработки, регуляторы роста растений и т.п.), происходит переключение программы развития мужского/женского гаметофита на спо-рофитный путь развития. Формирование взрослого растения при этом возможно как за счет прямого эмбриогенеза (этот путь более предпочтительный), так и через промежуточную стадию – образование каллуса. Поскольку во всех трех способах процесс происходит в гаплоидных клетках, то первоначально формирующейся эмбриоид или каллус будет иметь гаплоидный набор хромосом. На втором этапе под воздействием определенных факторов/агентов происходит удвоение хромосом, и образующийся организм приобретает диплоидный набор хромосом с гомозиготным состоянием аллелей.

У каждого из этих методов при использовании их для тыквенных культур имеются свои преимущества и ограничения, которые были освещены в ряде обзоров [55–57]. Для эффективного внедрения гаплоидных технологий в селекционный процесс необходимо добиваться увеличения выхода удвоенных гаплоидов, воспроизводимости разрабатываемых методик, что невозможно сделать без тщательной отработки всех этапов технологии. Полученные растения-регенеранты необходимо в дальнейшем обязательно исследовать на уровень плоидно-сти и на гомозиготность.

Партеногенез

Первые работы на C. pepo. L., целью которых было получить гаплоидные растения методами опыления облученной пыльцой, были начаты Kurtar, Sari, Abak в 2002 году [51] и продолжаются до настоящего времени [65] (табл. 1). За все время было изучено около 60 генотипов C. pepo. L. В большинстве экспериментах в качестве источника γ-облучения использовали Co60, ввиду легкости его применения, хорошей проникающей способности в ткани и индукции высокой скорости мутации при низкой летальность по сравнению с другими видами облучения. Только в исследовании Košmrlj et al., проведенном на тыкве голосемянной C. pepo ssp. pepo var. styriaca [8], сообщалось об успешном использовании Х-излучения (рентгеновское облучение). Облучению обычно подвергали либо мужские цветки (часто после удаления чашелистиков и лепестков) [66], либо заранее изолированные пыльники [8,51,62,65]. Обязательным условием являлась строгая изоляция женского цветка за сутки до распускания и сразу после опыления, чтобы избежать нежелательных опылений. Известно, что одним из важнейших факторов, определяющих успех этой технологии, будет правильно подобранная доза облучения (Гр мин-1). На практике оптимальной чаще всего оказывается критическая доза или полулетальная доза (LD50, то есть доза для ингибирования прорастания 50% пыльцы) [56]. Дозы облучения не должны быть такими высокими, чтобы полностью ингибировать прорастание пыльцевых трубок, но в то же время они должны быть достаточно высокими, чтобы нарушать нормальное оплодотворение и препятствовать образованию диплоидных гибридных эмбриоидов. Авторы проводили эксперименты с различными дозами облучения в диапазоне от 25 Гр [51,67] до 400 Гр [51] для γ-облучения и от 50 до 350 Гр для Х-облучения. Оптимальная доза в разных исследования значительно колебалась в зависимости от генотипа и составляла 50 Гр [51,65],150 Гр [65–67] и 200 Гр [8]. При использовании рентгеновского излучения было отмечено, что завязы-

Таблица 1. Краткие протоколы индукции гаплоидов Cucurbita pepo L. путем опыления облученной пыльцой. Table 1. Concise protocols of Cucurbita pepo L. haploid induction through pollination with irradiated pollen

Генотип дон. раст-я/ Genotype of donor plant	Источник излучения / доза облучения (Gy) / Radiation source / radiation dose (Gy)	Возраст зародыша (недель после опыления) / Embryo (weeks after pollination)	Индукционная среда / Induction medium	Рег. среда / Regeneration medium	Температурный режим / Temperature regime	Метод определения плоидности/ Method for ploidy determination	Идентифицированная плоидность/ Identified ploidy	Литературные источники/ References
Eskenderany, Acceste, Sakız, Urfa Yerli	25, 50, 75, 100, 200, 300, 400 (Co60)	4–5 недель	E20A + S 20 г/л + A 10 г/л + IAA 0,01 мг/л	E20A + S 20 г/л + A 10 г/л + IAA 0,01 мг/л	28 ± 1°C, Ph16/8, 3000 Lx	ППХ	H-43,7%, DH- 56,3%	Kurtar et al., 2002 [51]
Gleisdorfer O ̈ lku ̈rbis, GL Opal, GL Maximal, Gleisdorfer Diamant, Beppo, Elite F 1 , Slovenska golica, Rumena golica, Yellow Long, Turkey #2, Naked Seed, White Acorn, Muscade de Provence	0, 50, 100, 150, 200, 300, 350 (X-ray)	4 недели	E20A + S 20 г/л + A 10 г/л + IAA 0,01 мг/л	E20A + S 20 г/л + A 10 г/л + IAA 0,01 мг/л	23°C, Ph16/8	ПЦ	H, DH, TrP, TeP	Košmrlj K, Murovec J, Bohanec B, 2013 [8]
-	25, 50, 75, 100, 200 (Co60)	-	-	-	-	MA, ПЦ	H-38,6%, DH-61,4%	Ebrahimzadeh et al., 2013 [67]
14 селекционных образцов	150, 200, 300 (Co60)	4–5 недель	CP + S 30 г/л + A 8 г/л + B12 0,08 мг/л + IAA 0,02 мг/л	-	25°C, Ph 16/8	-	H-11%, DH-89%	Baktemur et al., 2014 [66]
17 селекционных образцов	150 (Co60)	3-4 недели	MS + S 30 г/л + A 7 г/л + IAA 0,1 мг/л	-	26°С±1°С, Ph16/8, 3000 Lx	MA	H, DH	Kurtar et al., 2017 [68]
14 селекционных образцов	150 (Co60)	3-4 недели	E20A + S 20 г/л + A 8 г/л + IAA 0,01 г/л	MS + S 30 г/л + A 7 г/л + IAA 0,1 мг/л + BAP1,0 мг/л	28°С±1°С, Ph16/8 5000 Lx	MA	H, DH	Kurtar et al., 2021 [62]

ваемость плодов значительно снижалась при 200 Гр, тогда как при 100 Гр наблюдалось снижение образования зародышей. Также интересным представлялся обнаруженный факт, что образование тетраплоидных зародышей коррелировало с повышенным уровнем излучения, используемого для пыльцевых зерен [8].

Вторым важным моментом технологии будет определить, на какой стадии необходимо изолировать образовавшийся партеногенетический зародыш и сколько дней от опыления должно пройти. Этот показатель также может варьировать в зависимости от генотипа донорного растения и использующейся питательной среды для «спасения зародыша». В опубликованных исследованиях возраст плода, из которого извлекали зародыш, составлял от 3-4 недель после опыления [67,68] до 4-5 недель [8,51,68]. В плодах более длительного срока созревания – 5-6 недель увеличивался процент некротических эмбриоидов коричневого и черного цвета. Поскольку самым трудозатратным в этой технологии будет процесс извлечения зародышей из семян, то этому этапу уделяется особенное место. При рассмотрении экономической эффективности (трудозатраты, затраченное время, микробные загрязнения, сохранность эмбриоидов) наилучшими методами считается «посев семян непосредственно в питательную среду» и «осмотр семян под флуоресцентным источником света» [32]. Наиболее распространенный метод, применяемый у тыквенных культур, — это проверка серии семян одно за другим под стереомикроскопом. Именно этот метод применяли и для C. pepo L. Стадия развития, на которой находились зародыши при извлечении их из семян, могла быть от глобулярной до семядольной, что также влияло на последующее развитие зародыша во взрослое растение-регенерант и на конечный выход гаплоидов и удвоенных гаплоидов. Было отмечено, что из эмбриоидов на глобулярной стадии развития развивались только гаплоидные растения (2n = 20), тогда как из зародышей на семядольной стадии развития развивались диплоиды (2n = 40). Из эмбриоидов на стадии торпеды и из сердцевидных зародышей могло образоваться до 53,8% и 23,1% гаплоидных растений соответственно [51,66]. Хотелось бы отметить, что образование диплоидных растений не всегда будет связано с процессом спонтанной диплоидизации первоначально гаплоидных эмбриоидов. В работе Košmrlj et al. [8], при проверке полученных диплоидных растений с использованием SSR-маркеров было показано, что все они являются зиготическими зародышами.

В качестве индукционных питательных сред, на которые помещали незрелые зародыши, использовали среды E20А [8,51,68] и MS [69] c добавлением IAA (0,01 мг / л) [65] и среда CP [70] дополненная витамином B12 (0,08 мг/л) и IAA (0,02 мг / л) [66]. Kurtar et al., [65] в 2021 году модифицировал питательную E20A, увеличив содержание Na 2 EDTA и FeSO 4 *7H 2 O в 2 раза и снизив концентрацию агара с 10 г/л до 8 г/л. В качестве регенерационной питательной среды в дальнейшем использовали E20А[51], и MS с добавлением IAA (0,01 мг / л) и BAP (0,01 мг/л) [67].

Режим культивирования в разных протоколах мог несколько варьировать по температуре от 23°С [8], 25°С [68], 26°С [65,67] и до 28°С [51,62]. Культивирование во всех случаях проводили на свету при 16-часовом фотопериоде и интенсивности освещенности от 3000 люкс

[51,65] до 5000 люкс [67]. Максимальный выход по этой технологии был получен Kurtar et al. в 2021 году [65]. Авторам удалось получить 64 семенника, из которых было выделено 7034 семени с 521 зародышем. Всего регенерировано 144 растения, из которых 28 – гаплоидных, 77 – диплоидных и 6 – миксплоидных растений. Среднее количество семян на один семенник/завязь составило 110 штук, а количество образовавшихся зародышей на одну завязь – 8 шт. Полученный результат является хорошим достижением, но учитывая большую генотипспецифичность, для массового включения этой технологии в селекционные программы его еще нужно улучшать.

Андрогенез

Число публикаций, в которых сообщается об успешной индукции андрогенеза у C. pepo L. крайне ограничено [44,63,71–73], впрочем, как и для всех представителей семейства Cucurbitaceae . Первое упоминание об исследовании, в котором сообщалось об успешном получении нескольких гаплоидных растений C. pepo было проведено ShailJW, Robinson RW в 1987 году [74]. На данный момент нет ни одного сообщения об использовании культуры изолированных микроспор для этого вида, хотя именно эта технология является наиболее перспективным способом получения удвоенных гаплоидов, поскольку отсутствие соматических тканей в культуре in vitro позволяет не ставить под сомнение происхождение полученных растений. Хорошо известно, что на индукцию андро-генеза влияют многие факторы, такие как генотип, условия роста донорных растений, стадия развития микроспор, использующиеся предварительные температурные обработки, состав индукционной и регенерационной питательной среды, условия культивирования и субкультивирования.

Сорт Eskandrani оказался относительно отзывчивым к андрогенезу и использовался практически во всех опубликованных протоколах [71–73] в качестве исходного материала. В 2006 году [73] в исследования были включены и другие генотипы (Arlika F 1 , E 82-110 F 1 , Giad F 1 , Rula F 1 , Queen F 1 , Yellow Bik F 1 ), среди которых наибольшая отзывчивость к андрогенезу была выявлена у образца Yellow Bik F 1 .

Все исследователи использовали мужские цветочные бутоны, собранные рано утром. Оптимальный размер бутонов, содержащий пыльники с микроспорами на средней или поздней стадии развития, для этого вида составляет 9-10 мм (длина) и 4–6 мм (ширина). Плотно закрытые бутоны с такими параметрами бутонов отбирают для введения в культуру in vitro и выделяют из них пыльники.

Поскольку мужские бутоны кабачка имеют опушение и более чувствительные к температурной обработке покровные ткани, по сравнению с женскими бутонами и партено-карпными плодами, то использовать стерилизацию 96% спиртом с последующим краткосрочным обжиганием для этой технологии не подходит. Во всех исследованиях по андрогенезу рекомендовалось проводить ступенчатую стерилизацию материала с использованием 70% водного раствора этанола и 5,2% гипохлорита натрия.

Хорошо известно, что для перехода микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития необходимо использовать индуцирующие стрессовые факторы. Чаще всего с этой целью используют разнообраз-

Таблица 2. Краткие протоколы индукции гаплоидов Cucurbita pepo L. в культуре пыльников in vitro Table 2. Concise protocols of Cucurbita pepo L. haploid induction through anther culture in vitro

Генотип дон. раст-я/ Genotype of donor plant Холодовая предобработка/ Cold pretreatment Индукционная среда/ Induction medium (mg/l) Условия культивирования до образования каллуса / Cultivation conditions before callus formation Рег.среда/ Regeneration medium Условия регенерации каллуса / Callus regeneration conditions Условия культ-я растений R0/ Cultivation conditions for R0 plants Метод определения плоидности/ Method for ploidy determination Идентифицированная плоидность/ Identified ploidy Литературные источники/ References Eskandarani 4°C - 4 с. MS + S (30, 60, 90, 120, 150 г/л) + A 8 г/л + 2,4-D (0,1, 1,0, 2,5, 5) мг/л. в темноте 35 °C в течение 7 с., далее в темноте 25 °C в течение 28 с. MS + S 30 г/л + A 8 г/л + KT 0,05 мг/л + NAA 0,05 мг/л; MS б/г 25 ± 1 °C, Ph 16/8 , 1000 Lx, (4 недели); 25 °C, Ph16/8, 3000 Lx (4 недели) ППХ H-50%, DH-50% Metwally et al., 1998a [71] Eskandarani 4°C - 4 с. MS + S 100 г/л + A 8 г/л + 6 мг/л 2,4-Д в темноте 35°С в течение 7 c., далее 4 недели 25°С MS + S 30 г/л + A 8 г/л + KT 0,05 мг/л + NAA0,05 мг/л 25 °C, холодный белый свет, Ph16/8 (4 недели); MS + IВA 1 мг/л, 25°C, Ph16/8 (3000 Lx) ППХ H- 60%, DH -13%, AnP -17% Mohamed, Refaei, 2004 [72] Arlika F1, Eskandrani cv., E 82-110 F1, Giad F1, Rula F1, Queen F1, Yellow Bik F1 4°C - 4 с. MS + 100 г/л S + A 8 г/л + 2,4-D 5 мг/л в темноте 32°C в течение 7 c.; далее в темноте 25°C 4 недели MS + 30 г/л S + KT 0,05 мг/л + IAA 0,05 мг/л 25°C, 16/8 Ph, (3000 Lx), 4 недели; MS б/г (4 недели) MS б/г, 25°C, Ph16/8 ППХ H - 48,3%, DH-51,7% T.A. Shalaby, 2006 [73] Межвидовые гибриды C.pepo 4°C - 4 с. MS + S (50, 120, 150 г/л) + 8 г/л A + 2,4-D (1,0, 5,0 мг/л) в темноте при 35 °C в течение 7 с., далее 25 °C (пересадка на 5 неделе) MS + KT 0,05 мг/л + NAA 0,05 мг/л в течение 4 недель, далее MS б/г 25 ± 1 °C, Ph 16/8 (пересадка с отрезанием корней через 10 с) MS б/г 4 недели; MS + NaCl 0,5 мг/л (10 с), MS + NaCl 0,5 мг/л (10 с) ППХ H, DH Rakha et al., 2012 [44] Eskenderany F1, Acceste F1, Sakiz, Urfa Yerli Без х. о. MS + S 120 г/л + A 7 г/л + 2,4-D 2 мг/л + BAP 0,5 мг/л 35 °C -7 c. в темноте; 26 °C, Ph 12/12, 1500 Lx(7 c) далее Ph16/8 (пересадка каждые 10 с) MS + A 8 г/л + BAP 4 мг/л, NAA 0,05 мг/л 26 °C, Ph 12/12, 1500 Lx (7 c), 26 °C, Ph 16/8, 3000 Lx (3-5 недель) MS + IAA 0,01 мг/л ; 26 °C, Ph16/8, 3000 Lx - - Kurtar E.S., Seymen M. (2021) [63] ные предобработки и обработки пониженными и повышенными температурами, либо сочетание контрастных температурных режимов культивирования [75]. Впервые об успешном использовании предварительной холодовой обработки было сообщено в 1973 году при культивировании пыльников дурмана [76], и в последующем она использовалась при андрогенезе у многих культур. Во всех опубликованных для C. pepo исследованиях рекомендовалось также использовать холодовую предобработку бутонов при 4°С в течение 4 суток (табл. 2).

Все исследователи в качестве индукционной питательной среды использовали агаризованную среду MS [69] с различными концентрациями сахарозы: от 30 г/л до 150 г/л [71]. Концентрации сахарозы, оптимальные для индукции каллусообразования у культивируемых пыльников, находились в достаточно широком диапазоне от 90 до 150 г/л [44,63].

Культивировать пыльники рекомендуется в темноте при использовании обработки повышенной температурой в течение 7 дней при 350С [71,72] или 320С [73], а затем при 250С (табл. 2).

Metwally et al. [71] получил максимальный выход при использовании индукционной среды с добавлением сахарозы в концентрации 150 г/л в сочетании с 2,4-D в концентрации 5 мг/л. Всего удалось получить в этом варианте опыта 19,3 растения или 30 растений на 100 пыльников. Во время исследования был проведен подсчет хромосом у 20 полученных растений-регенерантов, из которых 10 были диплоидными, а 10 – гаплоидными.

Исследования Mohamed, Refaei по изучению влияния сезонного фактора на выход андрогенных растений [72] показали, что максимальный выход растений-регенератов был получен из пыльников, высеянных в ноябре, что превышало в два раза число у высеянных в марте и составило 260 растений на 100 пыльников. Анализ уровня пло-идности показал, что 60% образовавшихся в культуре пыльников растений были гаплоидными, 23% – диплоидными и 17% – анеуплоидными.

Shalaby [73] было отмечено, что самым отзывчивым к каллусообразованию генотипом оказался Yellow Bik F 1 , у которого наблюдали самый высокий процент образования эмбриогенного каллуса – 38,7%, а количество регенерированных растений на каллус составило 8,9 шт. В общем количестве полученных и проанализированных на уровень плоидности растений 48,3% оказались гаплоидными, а 51,7% – диплоидными.

Существенный прорыв в получении удвоенных гаплоидов при использовании мужского гаметофита у вида C.

Таблица 3. Краткие протоколы индукции гаплоидов Cucurbita pepo L. в культуре неопыленных завязей/семяпочек in vitro Table 3. Concise protocols of Cucurbita pepo L. haploid induction through unpollinated ovary/ovule culture in vitro

Генотип дон. раст-я/ Genotype of donor plant	Стадия бутона /Bud Stage	Холодовая предобр-ка/ Cold pre-treament	Индукционная среда/ Induction medium	Условия культ-я семяпочек/ Conditions for the cultivation of ovules	Рег. среда/ Regeneration medium	Условия культ-я растений R 0 / Cultivation conditions for R 0 plants	Метод определения плоидности/ Method for ploidy determination	Идентифицированная плоидность/ Identified ploidy	Литературные источники/ References
Ambassador, Black Beauty, Diamant, Greyzini, Opal, Tara, Tarmino	Fl; Fl-1; Fl-2	без х.о.	C + S 30г/л + A 8 г/л + 2,4 D 0,1 мг/л + КТ 0,1 мг/л	25 °С, Ph 12/12	С б/г + S 30 г/л + A 8 г/л	25°С, Ph 12/12	ППХ, МА	DH, AnP	Dumas de Valux, Chambonnet, 1986 [41]
Eskandarani	Fl-1	без х.о. без х.о., 4 °C - 2 с, 4 °C - 4 с, 4 °C - 8 с	MS + S 30 г/л + A 8 г/л + 2,4-D (0,1, 1,0, 5,0, 10 мг/л)	25±1 °C, Ph16/8 (4 недели)	MS б/г	25 ± 1°C Ph 16/8 (3000 Lx)	ППХ	H-25%, DH-75%	Metwally et al., 1998b [77]
-	Fl; Fl-1	без х. о.	N6 + S 30 г/л + A 8 г/л + 2,4-D + NAA + BAP	25°C Ph 14/10 (2000 lx)	N6 б/г + S 30 г/л /G 20 г/л + A 8 г/л	25°C Ph 14/10 (2000 Lx)	ЦА	H, DH	Xie et al., 2006 [82]
MHTC77, Queen , Raad, Reveneu, Rosita, Rola , Yellow Bik	FL	без х.о.	MS + S (30, 60, 90 г/л) + A 8 г/л + 2,4 D 1 мг/л + КТ 1 мг/л	4 °С(4,7,12 с); 32 °С(4,7,12 с.); 25°С; Ph 12/12 (пересадка каждые 4 нед.)	MS б/г	25 °С, Ph 16/8 (3000 Lx)	ППХ	H-65%, DH-35%	Shalaby, 2007 [73]
Межвидовые гибриды C.pepo	FL - 1	без х.о.; 4 °С (7, 14 с.)	Ms + S 30 г/л + A 8 г/л + 2,4D 1, 5 мг/л; через 28c: MS б/г. + S 30 г/л + A 8 г/л	25 °С ± 1 °С, Ph 16/8	MS б/г + S 30 г/л + A 8 г/л (28c); MS б/г. + S 30 г/л + A 8 г/л + NaCl 0,5 мг/л (10 с); MS б.г. + S 30 г/л + A 8 г/л + NaCl 1 мг/л	25 °С, Ph 16/8 (пересадка с отрезанием корневой системы каждые 10 с.)	ППХ	H-60%, DH-40%	Rakha et al, 2012 [44]
22 селекционных образца	FL	без х/о, 4 °C - 1c, 4 °C - 2c	IMC + S 30 г/л + A 8 г/л + Amp 200 мг/л + 2,4 D (1мг/л, 2 мг/л); IMC + S 30 г/л + A 8 г/л + Amp 200 мг/л + TDZ (0,02мг/л, 0,2 мг/л)	25 °С, Ph 16/8 (2500 Lx)	Ms б./г. + S 20 г/л + Pht 3 г/л; CBM + S 20/г + Pht 3 г/л + NAA 0,2 мг/л + BAP 0,2 мг/л	25 °С, Ph 16/8 (2500 Lx)	ППХ, МА, ПЦ,	H, DH, TrP, TeP, AnP	Domblides et al., 2020 [80]
-	FL	без х. о.	MS + S 20 г/л + A 8 г/л + 2,4-D 2,0 мг/л	35 °C 3c темн., 26 °C, Ph 12/12 (1500 Lx- 7 с), далее Ph 16/8 3–4 нед.	MS + S 20 г/л+ A 8 г/л 2,0 мг/л 2,4-D + 0,5 мг/л BAP; MS + 4,0 мг/л BAP + 0,05 мг/л NAA + 0,1 мг/л TDZ; MS + 0,01 мг/л IAA + 1,0 мг/л BAP	26 °C Ph 16/8 (1500 Lx); 26°C, Ph 16/8 (3000 Lx) (пересадка каждые 7-14 с)	-	-	Kurtar, Seymen, 2021 [59]