Получение удвоенных гаплоидов огурца (Cucumis sativus L.)

Огурец (Cucumis sativus L.) является однолетним травянистым растением, принадлежащим к семейству тыквенных (Cucurbitaceae Juss) к роду Cucumis L. Согласно последним данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций (FAOSTAT 2017), огурец занимает 6-е место по посевной площади, 3е – по производству, 4-е – по урожайности среди всех овощей, выращиваемых в мире, что составляет 28,7% от общего объема производства овощей в мире. Среди сельскохозяйственных культур семейства Cucurbitaceae на огурец приходится 52,2% всех убираемых площадей и 78,6% от общего производства продукции тыквенных культур в мире. В России огурец входит в пятерку самых выращиваемых культур, как в открытом, так и в защищенном грунте. По данным 2018 года, из 543,6 тыс. га, занятых под овощными культурами, огурец занимал 44,3 тыс. га. Урожайность огурца может быть значительно увеличена за счет использования гибридов, так как они демонстрируют высокий уровень гетерозиса – превосходство в продуктивности по сравнению с их родителями (инбредными / чистыми линиями) (Mulualem, Abate, 2016).

В случае C. sativus L. традиционные методы размножения часто требуют 6–8 лет самоопыления, чтобы получить инбредные родительские линии (Gémes Juhász et al., 2002). Использование гаплоидных технологий существенно повышает скорость селекции у этой культуры. Для получения полностью гомозиготной линии с использованием DH-технологии требуется не более одного года. Кроме того, селекционеры могут оценивать линии удвоенных гаплоидов (DH-линии) с большей скоростью, точностью и достоверностью, поскольку все гены у DH-растений находятся в гомозиготном состоянии, и рецессивные признаки видны, а не маскируются под действием доминантных генов. Гаплоидные и удвоенные гаплоидные растения также удобно использовать в генетических и фундаментальных исследованиях (Dong et al., 2016; Can et al., 2019). Например, Lofti и др. (2003) использовали гаплоидные и удвоенные гаплоидные растения в селекции для создания дыни с множественной устойчивостью к вирусным болезням. Gonzalo et al. (2005) использовали популяцию DH-линий для построения генетической карты дыни. Производство DH-растений является важным этапом в недавно разработанной технологии обратной селекции (Reverse breeding), где полученные рекомбинантно-инбредные популяции могут быть подвергнуты скринингу с помощью молекулярных маркеров, чтобы идентифицировать популяции с комплементарными комбинациями хромосом и дать возможность восстановить первоначального гетерозиготного родителя путем гибридизации двух DH-индивидуумов (Dirks et al., 2009). На определенных стадиях развития удвоенные гаплоиды могут использоваться в качестве удобных мишеней для индукции мутаций и трансформации, а также в качестве моделей для изучения регуляции клеточного цикла растений, деления клеток и этапов раннего эмбриогенеза.

Историческая справка об обнаружении гаплоидов и применения их в селекции. История удвоенных гаплоидов (Doubled Haploids – DHs) началась с обнаружения двух спорофитных гаплоидных растений Datura stramonium L. (дурман обыкновенный), о которых было сообщено в 1922 году в виде небольшого специального сообщения «A haploid mutant in the Jimson weed, «Datura stramonium»» в журнале «Science» (Blakeslee et al., 1922). В 1924 году Blakeslee A. F. и Belling J. выпустили уже большую статью, в которой представили фото гаплоидного растения, схему его образования, а также сообщили о возможности получения из него гомозиготной линии. В этой статье впервые делается вывод о практическом использовании гаплоидов, поскольку они предоставляют новый материал для ускоренного преобразования гетерогенного селекционного материала в чистую линию (Blakeslee, Belling, 1924). Вскоре за этим последовали аналогичные открытия гаплоидов у других видов, например, Nicotiana tabacum (Сlausen, Mann, 1924), Triticum compactum (Gains, Aase, 1926), Lycopersicum esculentum (Lindstrom, 1929). В 1932 году была получена первая гомо- зиготная линия томата, получившая коммерческое название "Supreme Marglobe" (Morisson, 1932). Многие ученые, занимающиеся генетикой растений, и селекционеры заинтересовались этим открытием и поняли перспективность его использования, возросло количество публикаций по гаплоидии (Карпеченко, 1935; Иванов, 1937; Kostoff, 1942). Так в 1932 году Н.И. Вавилов писал «…надлежит уделить особое внимание методике получения полиплоидных форм (амфидиплоидов и гаплоидов), изучению количественных и качественных различий у полиплоидов, наследственности признаков у полиплоидных форм и, наконец, разработке методики получения гомозиготных растений путем удвоения хромосом у гаплоидных, диплоидных и других форм» (Вавилов, 1932). Эти слова легли в качестве предисловия в монографию, написанную коллективом сотрудников кафедры генетики и дарвинизма Саратовского университета «Гаплоидия у покрытосеменных растений». Это была одна из первых в научной литературе крупных работ по гаплоидии, после одноименного обзора Kimber G. и Riley R., выпущенного в 1963 году (Kimber, Riley, 1963), где рассматривались генетические закономерности возникновения гаплоидов, их классификация, распространение, методы выявления и получения, результаты собственных исследований, а также вопросы генотипических и фенотипических изменений и экспериментальный мутагенез при переходе на гаплоидный уровень. В этой же работе был приведен самый полный на тот момент список видов (152 вида и 10 гибридных комбинаций), у которых были установлены гаплоиды, и обширная библиография по гаплоидии (Хохлов и др., 1970).

Большой интерес к гаплоидам повлек за собой организацию и проведение Первого международного симпозиума «Haploids in Higher Plants», который состоялся в Гуэлфе (Канада) в 1974 году (Kasha, 1974). В начале 1970-х был создан с использованием DH-линий сорт рапса ( Brassica napus ) Maris Haplona (Thompson, 1972), за ним последовало создание сорта Mingo у ячменя ( Hordeum vulgare ) в 1980 году (Ho, Jones, 1980).

Основные этапы технологий получения DH-растений, их преимущества и трудности, с которыми сталкиваются исследователи, базовые протоколы более чем для 200 видов сельскохозяйственных растений освещены в ряде опубликованных обзоров (Maluszynski et al., 2003; Forster et al., 2007; Turaev et al., 2009; Dunwell, 2010; Germana, 2011). Список видов, у которых получены гаплоиды и удвоенные гаплоиды, постоянно пополняется, появляются новые обзорные публикации, посвящённые гаплоидии, проводятся генетические и фундаментальные исследования на DH-линиях, создаются новые сорта и гибриды на основе линий удвоенных гаплоидов, в том числе и у овощных культур семейства Cucurbitaceae , куда относится и огурец.

Первые сообщения об обнаружении гаплоидов в семействе Cucurbitaceae (Тыквенные). Несмотря на то, что с момента описания первых гаплоидов в 1922 году, интерес к этой теме у генетиков и селекционеров резко возрос, и одно за одним стали появляться сообщения о спонтанном и индуцированном получении гаплоидов у различных сельскохозяйственных культур, первые сообщения об обнаружении гаплоидов в семействе Cucurbitaceae появились лишь в 50-х годах прошлого века и были крайне немногочисленными.

Первая публикация датируется 1954 годом, когда были обнаружены гаплоидные близнецовые зародыши в семенах, полученных от межвидовых скрещиваний C. maxima x C.moschata . Полученные из этих зародышей растения имели гаплоидный набор хромосом, что было подтверждено цитологическим анализом. По морфологическим признакам растения выглядели несколько меньше, чем диплоидная родительская форма. Также было отмечено, что мужские цветки при культивировании в поле отсутствовали и образовывались только в теплице. При этом пыльники в них были пустыми, белого или коричневого цвета. Женские же цветки формировались в изобилии и при опылении их нормальной пыльцой различных диплоидных растений завязывали плоды, однако семян в них обнаружить не удалось

(Hayase, 1954). Аналогичным способом впоследствии гаплоидные растения были получены у дыни при скрещивании Cucumis melo L. (2n = 2x = 24) с Cucumis ficifolius A. Rich (2n = 4x = 48), однако наблюдаемый уровень гаплоидии был низким, максимально можно было обнаружить до трех гаплоидных зародышей на 1000 семян. Однако эти показатели сильно зависели от генотипа и времени года (Dumas de Vaulx, 1979).

В 1958 году Aalders опубликовал статью, в которой описал изобретенный им простой метод обнаружения спонтанных гаплоидов (в своих статьях автор использовал термин – моноплоид (monoploids)) огурца. Он обнаружил, что диплоидные семена обычно тонут в воде, а вот из плавающих на поверхности семян можно извлечь зародыши, имеющие гаплоидное число хромосом. Впервые 13 гаплоидных растений огурца были получены им из эмбриоидов, извлеченных из нормальных флотирующих/плавающих в воде семян, при использовании технологии спасения зародышей в культуре in vitro . Для оценки уровня плоидности растений огурца он использовал фиксатор «Уксусный алкоголь» с последующим 20-ти минутным окрашиванием в горячем ацетокармине, а также использовал оценку с использованием размера замыкающих клеток устьиц листа (в эксперименте она составила 15,67 мкм для гаплоидных и 21,59 мкм для диплоидных растений). Только восемь растений из 13 смогли вырасти в теплице до цветущего состояния и перенести обработку точек роста водным раствором колхицина. Основной проблемой, с которой столкнулся автор в последующем, это получение потомства от самоопыления. У гаплоидов после обработки колхицином крайне редко образовывались мужские цветки с нормально сформированными пыльниками. За все время на растениях образовалось только четыре полноценных мужских цветка, но в силу отсутствия одновременно раскрывшихся женских цветков на растении (даже при хранении мужского цветка в холодильнике в течение 3 суток) для нормального опыления смогли использовать только один мужской цветок, давший начало двум плодам. Однако ни в одном из плодов, вызревших и внешне не отличающихся от нормальных, семян обнаружить не удалось. Несмотря на то, что в этом исследовании не удалось получить потомство от самоопыления гаплоидных растений, эта работа стала отправной точкой для дальнейших исследований по гаплоидии в семействе Cucurbitaceae . В этой работе были вскрыты основные проблемы, характерные для этого семейства и предложены некоторые пути их возможного решения. Способ отделения гаплоидов из флотирующих на поверхности воды семян, предложенный Aalders, до сих пор успешно используется с различными модификациями, как у огурца, так и у других культур семейства Тыквенные (Lofti, Salehi, 2008; Baktemur et al., 2013).

Известно, что гаплоиды самопроизвольно образуются у огурца с очень низкой частотой: на тысячу семян обычно образуется менее одного гаплоидного зародыша (Aalders 1958). Эта частота встречается у многих растений, но ее недостаточно для применения в селекционных программах, в связи с этим стали предприниматься попытки по индукции образования гаплоидов с применением различных химических и физических факторов и биотехнологических методов in vitro .

Одним из популярных в то время направлений было использование рентгеновских лучей (Х-лучи) для индуцирования различных мутаций у растений. В 1958 году была опубликована работа, в которой описывалось образование у арбуза одной гаплоидной плети на растении, выращенном из семени, которое подверглось рентгеновскому облучению 48000 Р (48,000 r), в то время как остальные плети у растения были диплоидными. Листья и цветки на гаплоидной плети были меньшего размера, а стебель и лепестки были тоньше. Несмотря на предпринятые попытки опыления, получить плод на этой ветви не удалось (Swaminathan, Singh, 1958).

Современное состояние исследований по получению удвоенных гаплоидов огурца. Основные достижения по получению удвоенных гаплоидов у огурца за послед- ние 30 лет были освещены в ряде обзоров (Przyborowski, 1996; Gal^zka, Niemirowicz-Szczytt 2013; Dong et al., 2016).

В настоящее время гаплоидные и удвоенные гаплоидные растения в семействе Cucurbitaceae получают при использовании:

• 1.    партеногенеза in situ (опыление неполноценной (облученная или обработанная химическими веществами) пыльцой);

• 2.    андрогенеза (культуры пыльников/микроспор in vitro );

• 3.    гиногенеза (культура неопыленных семяпочек in vitro ).

• У каждого из этих способов есть свои преимущества и ограничения.

Партеногенез. В основе этой технологии получения удвоенных гаплоидов лежит индуцированный партеногенез in situ . Как правило, применяют опыление женских цветков облученной пыльцой с последующим выделением и помещением в культуру in vitro гаплоидных зародышей, образовавшихся за счет партеногенеза из яйцеклетки. В качестве источника облучения пыльцы чаще всего применяют / -лучи ( / -облучение), используя в качестве источника облучения

• ⁶⁰Co и облучение ¹³⁷Cs (цезий использовался только в опытах с дыней (Lim, Earle, 2008; Lofti et al., 2003; Dal et al., 2016)), либо Х-лучи (рентгеновское облучение). Имеется лишь одно сообщение об успешном использовании Х-лучей в дозе 300 Гр. для индукции гаплоидов у огурца (Antos et al., 2001). Наибольшее распространение у культур семейства Cucurbitaceae получило использование / -облучения с использованием ⁶⁰Co, поскольку его легко применять, оно обеспечивает благоприятное проникновение в ткани, индуцирует высокую скорость мутации и имеет низкую летальность по сравнению с другими видами облучения (Kurtar and Balkaya, 2010). Было доказано, что облучение является эффективным для индуцирования образования гаплоидов у тыквенных культур, но выход эмбриодов остается нестабильным и зависит от влияния различных факторов, таких как генотип, сезон введения в культуру, условия окружающей среды и дозы облучения (Ficcadenti et al., 1995). Еще одним недостатком этого метода является и то, что исследователю приходится работать с источником излучения и требуется дополнительное оснащение оборудованием биотехнологических лабораторий.

Об успешном образовании гаплоидных эмбриодов и растений при использовании технологии спасения парте-нокарпических зародышей, индуцированных опылением у -облученной пыльцой у тыквенных культур, впервые было сообщено для дыни (Sauton & Dumas de Vaulx, 1987), а впоследствии она была применена и на огурце (Truong-Andre, 1988; Sauton, 1989; Niemirowicz-Szczytt & Dumas de Vaulx, 1989; Cagalar, Abak, 1999; Sztangret-Wisniewska et al.,2006; Smiech et al., 2008; Galazka et al., 2015). Суммарные данные по использованию этого метода для получения удвоенных гаплоидов огурца представлены в таблице 1.

Облучению обычно подвергают либо мужские цветки (часто после удаления чашелистиков и лепестков), либо заранее изолированные пыльники. Обязательным условием является строгая изоляция женского цветка за сутки до распускания и сразу после опыления, чтобы избежать нежелательных скрещиваний. Одним из важнейших факторов, определяющих успех технологии, будет правильно подобранная доза облучения. На практике оптимальной чаще всего оказывается критическая доза или полулетальная доза (LD 50 , то есть доза для ингибирования прорастания 50% пыльцы) (Dong et al., 2016). Дозы облучения не должны быть такими высокими, чтобы полностью ингибировать прорастание пыльцевых трубок, но в тоже время они должны быть достаточно высокими, чтобы нарушать нормальное оплодотворение и препятствовать образованию диплоидных гибридных эмбриоидов. В исследованиях чаще всего используют дозы облучения / -лучами от 100 до 500 Гр., более высокие дозы оказываются не эффективными и приводят к снижению индукции образования гаплоидов огурца. В большинстве исследований оптимальной оказалось облучение от 100 до 300 Гр (Przyborowski, Niemirowicz-Szczytt 1994; Niemirowicz-Szczytt et al. 1995; Faris et al. 1999; Lofti, Salehi, 2008; Galazka et al., 2015).

Через 3-5 недель после опыления облученной пыльцой плоды огурца созревали, и из образовавшихся семян можно было извлечь зародыши. Способ обнаружения и выделение гаплоидных эмбриодов также является важным этапом технологии. Наиболее распространенный метод – это проверка серии семян один за другим под стереомикроскопом. Эффективным способом обнаружения эмбриоидов является применение рентгеновской радиографии семян – например, в семенах дыни и огурца, полученных при опылении женских цветков облученной пыльцой, сформировавшиеся гаплоидные эмбриоиды могли быть определены с помощью рентгеновских лучей (Savin et al., 1988; Sauton, 1989; Deunff, Sauton, 1994; Claveria et al., 2005; Dolcet-Sanjuan et al., 2006). Однако использование дополнительного рентгеновского излучения снижает жизнеспособность образовавшихся зародышей и требует оснащения лаборатории дополнительным оборудованием. Lofti M. и Salehi S. в 2008 году провели исследование на образцах дыни, в котором сравнили трудозатраты по четырем основным методам, использующимся для обнаружения зародышей: «проверка серии семян один за другим под стереомикроскопом», «прямой посев семян в питательные среды», «осмотр семян под флуоресцентным источником света», «плавающие семена на жидких средах» и «плавающие семена на жидких средах после поверхностной стерилизации». При рассмотрении экономической эффективности (трудозатраты, затраченное время, микробные загрязнения, сохранность эмбриоидов) наилучшими методами оказались «посев семян непосредственно в питательную среду CP (Chee et al., 1992)» и «осмотр семян под флуоресцентным источником света» (Baktemur et al., 2013).

Стадия развития, на которой находились зародыши при извлечении их из семян, могла быть от глобулярной до семядольной, что также влияло на последующее развитие зародыша во взрослое растение-регенерант и на конечный выход гаплоидов и удвоенных гаплоидов. Есть мнение, что низкая частота образования гаплоидных проростков может быть объяснена присутствием в семенах незрелых зародышей (Sauton, Dumas de Vaulx 1987), а также отсутствием эндосперма в семенах (Sauton, 1989). В то же время, эмбриологические исследования, проведенные на семенах огурца, выделенных из плодов, развившихся после опыления облученной пыльцой, выявили одновременное присутствие в них эндосперма и эмбриоидов на ранних стадиях развития; однако эндосперм не был типичным и выглядел недоразвитым (Przyborowski, 1996). Также отмечалось, что у гаплоидных зародышей огурца семядоли могли быть различного размера, либо у зародыша могла присутствовать только одна из них (Faris et al., 1999). В связи с этим, без помещения таких незрелых и недоразвитых зародышей на питательную среду (технология спасения зародышей in vitro ), получить проростки из них было бы невозможно. c agalar g. и a bak K. (1999c) отмечали в своих исследованиях, что эмбриоиды на сердцевидной стадии развития обладают наибольшей регенерационной способностью при помещении в культуру in vitro , по сравнению с более ранними стадиями развития зародыша, и именно эта стадия является оптимальной.

Состав питательной среды также влиял на успешное развитие эмбриоида. Для культивирования недозрелых эмбриоидов тыквенных культур, извлеченных из семян, на первом этапе обычно используются среды: CP (Chee et al. 1992), среда E20A (Sauton, Dumas de Vaulx 1987), среда MS (Murashige, Skoog 1962) или среда N6 (Chu et al. 1975). Для эмбриоидов огурца наилучшие результаты были получены при использовании среды E20A. Cagal и Abak (1999c) в своих исследованиях отмечали, что гаплоидные зародыши огурца на среде E20A хорошо развиваются в проростки и могут быть легко клонированы. Claveria et al. (2005) добились очень хороших результатов (83% эмбриодов превратились в растения) при использовании среды E20H8, дополненной 0,011 мг/л IAA и 2,5 мг/л AgNO 3 .

Большинство исследователей для успешного клонирования и укоренения образовавшиеся побеги огурца в фазе 57 листьев переносили на безгормональную среду MS. Для размножения использовали черенкование побегов на сегменты, содержащие по одному междоузлию, которые также культивировали на среде MS (Przyborowski and Niemirowicz-Szczytt, 1994).

Анализ публикаций показал, что выход гаплоидов может зависеть и от сезона закладки опытов. Было отмечено, что летний сезон гораздо более благоприятен для развития гаплоидного зародыша, чем весна (Przyborowski and Niemirowicz-Szczytt, 1994). Çagalar и Abak (1999b, c) обнаружили, что большее количество гаплоидных растений огурца было получено из эмбриоидов, культивируемых с мая по сентябрь, а наибольшее количество гаплоидных растений было получено в июне и июле. Точно также наибольшее образование партеногенных зародышей огурца было индуцировано опылением в период с мая по июль, в другие же месяцы выход гаплоидов был более нестабильным (Claveria et al. 2005).

Оценить эффективность разработанного метода можно по количеству полученных гаплоидных и удвоенных гаплоидных растений в пересчете на один использованный в исследовании плод/завязь. В своих исследованиях на огурце Sauton (1989) получил в среднем 0,9 гаплоидных эмбриоидов на плод (завязь). Przyborowski и Niemirowicz-Szczytt (1994) смогли получить до 1,2 эмбриоидов, а Cagalar G. и Abak K. (1999b) до 4,8 эмбриоида/завязь. Galazka G. et al. (2015) разработали детальный протокол (от опыления до готовой DH-линии) и смогли получить удвоенные гаплоидные растения от всех включенных в исследование образцов, однако выход оказался недостаточно высоким и составил от 0,19 до 0,59 эмбриоидов на плод.

Технология получения удвоенных гаплоидов огурца с использованием опыления облученной пыльцой считается наиболее разработанной, удобной и обеспечивающей стабильный выход DH-линий, по сравнению с технологиями получения в культуре пыльников/микроспор и неопыленных семяпочек in vitro (Ga lq zka, Niemirowicz-Szczytt 2013). Однако в последнее время большая часть исследований по получению удвоенных гаплоидов огурца посвящена изучению процессов андрогенеза и гиногенеза и разработке эффективных протоколов с использованием этих методов (Шмыкова и др., 2015; Dong et al., 2016).

Андрогенез. Под андрогенезом понимают способность мужского гаметофита под воздействием индуцирующих факторов в культуре in vitro переходить с гаметофитного пути развития на спорофитный с образованием эмбриоида или андрогенного каллуса, из которых впоследствии возможна регенерация гаплоидных/удвоенных гаплоидных растений. Впервые на возможность массового получения гаплоидов при культивировании гаплоидных клеток и тканей растения с последующей регенерацией из них взрослых гаплоидных растений указал в 1949 году Chase S. и Troits B. (Chase, Troits, 1949). А в 1964 году из молодых пыльников с 2-3х клеточной пыльцой в культуре in vitro у двух видов дурмана (Datura innoxia и Datura stramonium) были получены эмбриоиды, которые в дальнейшем дифференцировались в зародыши с двумя семядолями. Из этих зародышей впоследствии образовались проростки с гаплоидным числом хромосом (Guha, Maheshwari, 1964, 1966, 1967). После этих удачных экспериментов были предприняты попытки получения гаплоидов в культуре пыльников и у других видов. Eun J.S. и Bak H.B. в 1974 году сообщили об индукции каллуса в культуре изолированных пыльников огурца, но регенерировать растения им так и не удалось (Eun, Bak, 1974). В последующих немногочисленных исследованиях результат также ограничивался лишь получением каллуса из пыльников огурца (Lazarte, Sasser 1982; Dryanovska, 1985). Огурец считается плохо отзывчивой к андрогенезу культурой. И только в последнее время количество успешных работ по андрогенезу у тыквенных культур значительно увеличилось, и было изучено большое количество факторов (генотип, оптимальная стадия развития мужского гаметофита, температурные предобработки, состав питательной среды, ее консистенция (жидкая или твердая), оптимальное сочетание регуляторов роста, положение пыльника на питательной среде, температурный и световой режим культивирования) способных повлиять на эффективность этого процесса (Kumar et al., 2003, 2004; Ashok Kumar and Murthy, 2004; Song et al., 2007; Zhan et al., 2009; Rakha et al., 2012; Hamidvand et al., 2013; Abdollahi et al., 2015, 2016; Kurtar et al., 2016; Asadi et al., 2018; Amirian et al., 2019). Однако выход растений-регенерантов остается достаточно низким и очень сильно зависит от генотипа донорного растения (Abdollahi et al., 2016; Kumar & Murthy, 2004; Kumar et al., 2003; Song et al., 2007). Наилучший достигнутый результат для культуры пыльников составил 3 эмбриоида на 1 культивируемый пыльник и 0.93 DH-растения/пыльник (Song et al., 2007). На наш взгляд, наибольшее количество факторов, способных повлиять на индукцию андрогенеза в культуре пыльников путем прямого и непрямого эмбриогенеза, было изучено в исследовании Asadi et al. (2018). Авторы апробировали на двух генотипах десять различных протоколов, опубликованных для семейства Cucurbitaceae, после чего им удалось разработать свой собственный детальный протокол для образца «Betta Alpha» и получить до 5,34 DH-растений на 100 культивируемых пыльников. Дальнейшая модификация этой технологии привела к тому, что в 2019 году был достигнут результат для культуры пыльников огурца, составивший для образца «Dastgerdi» 1,81 эмбриоид на 1 культивирующийся пыльник (Amirian et al., 2019).

Чаще всего при культивировании пыльников происходит образование каллуса, а случаи прямого эмбриогенеза встречаются достаточно редко (Ashok Kumar, Murthy, 2004; Asadi et al., 2018). Song Н. et al. (2007) отмечали регенерацию эмбриоидов только из каллуса. При этом цвет и структура этого каллуса могли быть различными. Кроме того, при культивировании пыльников достаточно часто образование каллуса происходит из соматических тканей стенок пыльника (из низкодифференцированных клеток эндотеция) и связника (Kumar et al., 2003; Ashok Kumar, Murthy, 2004; Song et al., 2007; Suprunova, Shmykova, 2008; Asadi et al., 2018), что значительно усложняет отбор истинных гаплоидов. Пыльники огурца имеют несимметричную форму и важно правильно расположить их на питательной среде, чтобы уменьшить вероятность образования каллуса из соматических тканей (Asadi et al., 2018). Включение в протокол получения удвоенных гаплоидов в культуре пыльников огурца обязательного этапа оценки с использованием молекулярных маркеров является необходимостью. Только использование SSR маркеров позволило отделить истинные DH–растения от диплоидных, образовавшихся из соматических тканей пыльника (Asadi et al., 2018; Amirian et al., 2019).

Культура изолированных микроспор является наиболее перспективным способом получения удвоенных гаплоидов. Эта технология достаточно проста в исполнении, экономически эффективна и обеспечивает большой выход DH-растений при оптимизации технологии под конкретный вид и генотип. Отсутствие соматических тканей в культуре микроспор in vitro позволяет не ставить под сомнение происхождение полученных растений. Однако у тыквенных культур эта технология на данный момент еще cлабо разработана, и имеются лишь единичные работы по индукции и образованию эмбриоидов в культуре микроспор in vitro (Suprunova, Shmykova, 2008; Chen et al., 2008; Zhan et al., 2009; Chen et al., 2018). Так, например, при использовании этой технологии в лаборатории биотехнологии ВНИИССОК (сейчас ФГБНУ ФНЦО), после подробного изучения процесса микроспорогенеза огурца, в 2008 году удалось достичь образования каллуса в культуре микроспор in vitro, причем цитологические наблюдения показали, что деления начинались в вегетативной клетке (Suprunova, Shmykova, 2008). В этом же году Chen et al. (2008) запатентовали метод получения изолированной культуры микроспор огурца (Patent CN 101317548), однако из опубликованных данных невозможно было сделать вывод об эффективности этой технологии. В 2009 году было опубликовано исследование, в котором сообщалось об успешном получении 14 растений при использовании культуры изолированных микроспор in vitro. В этом исследовании эффективность техно- логии для образца сорта «Changchun Mici» составила до 21,7 эмбриоида на чашку Петри (Zhan et al., 2009). Другие же исследователи, несмотря на использование в исследовании трех генотипов огурца, восьми вариантов жидких питательных сред, различных вариантов плотности суспензии микроспор, различных вариантов холодовых предобработок и обработок повышенными температурами, так и не смогли индуцировать деления в культуре микроспор (Kielkowska, Havey, 2011). Chen et al. в 2018 году получили патент «Метод получения гаплоидных, дигаплоидных и удвоенных гаплоидных растений в культуре изолированных микроспор семейства Сucurbitaceae» (Patent US2018/0213736). Предложенная технология, по заявлению авторов, в отличие от предыдущих технологий, не является генотип-специфичной. В патенте описано успешное получение 40 растений, 17 и 19 из которых были удвоенными гаплоидами и октоплоидами, соответственно, в то время как гаплоидных растений авторам обнаружить не удалось.

Краткие протоколы по использованию андрогенеза для получения гаплоидных и удвоенных гаплоидных растений представлены в таблице 2.

Первоначально для индукции процесса андрогенеза необходимо определить оптимальную стадию для введения в культуру in vitro . Подробное описание процесса микроспорогенеза у огурца и соотношение этих стадий с параметрами бутона было проведено в исследовании Suprunova, Shmykova (2008). Большинство авторов отмечали, что бутоны огурца, содержащие микроспоры от средней до поздней одноядерной вакуолизированной стадии развития, были оптимальными. Размер бутонов необходимо подбирать индивидуально для каждого образца (Ashok Kumar, Murthy, 2004; Song et al., 2007; Suprunova, Shmykova, 2008; Asadi et al., 2018; Amirian et al., 2019).

В большинстве опубликованных исследований проводится изучение факторов, влияющих на индукцию андроге-неза у огурца. Известно, что микроспорам нужен сигнал для перехода от гаметофитного к спорофитному пути. Чаще всего для этих целей используется холодовая предварительная обработка бутонов или температурная обработка повышенными температурами пыльников/микроспор сразу после введения в культуру in vitro , в том числе и у тыквенных культур. Во многих экспериментах благоприятное влияние на андрогенез оказывала предварительная холодовая температурная обработка бутонов при температурном режиме 4°C (Kumar et al., 2003, 2004; Song et al., 2007), однако ее продолжительность в разных исследованиях варьировала. Kumar et al. (2003) указали, что оптимальной была холодовая предварительная обработка бутонов в течение 2-3 х-суток, а при увеличении ее продолжительности до 4, 5 или 7 суток, эмбриогенный потенциал резко снижался. Также в проведенных исследованиях было отмечено, что холодоустойчивые образцы хорошо реагируют на холодовую предобработку, тогда как образцы огурца, предназначенные для выращивания в умеренных широтах, лучше реагировали на обработку повышенными температурами (Song et al., 2007). Достаточно часто используют комбинацию холодовой и последующей высокотемпературной обработки 32…35°C (табл.2).

Состав питательной среды также оказывает огромное влияние на успех технологии. Многие исследователи использовали среду MS в качестве основы индукционной среды для культуры пыльников in vitro (Song et al., 2007; Abdollahi et al., 2015, 2016). Только Suprunova и Shmykova (2008) использовали среду MSm (Masuda et al., 1981). Для культуры микроспор огурца в качестве индукционной среды используют среду NLN (Lichter, 1982) (Suprunova and Shmykova, 2008; Zhan et al., 2009). Интересно, что среды NLN и B5 не показывали значительных различий по индукции эмбриоидов для культуры микроспор огурца (Zhan et al. 2009). В культуре пыльников огурца наблюдались различия между сортами при культивировании на средах MS с измененной концентрацией макроэлементов (половинной, полной, 1,5-кратной и двукратной). Максимальное количество эмбриоидов (1,26 и 1,23 эмбриоида/пыльник) было получено на среде MS с полной и половинной концентрацией мак- роэлементов, в то время как двукратное увеличение в среде макроэлементов приводило к увеличению каллусогенеза (Abdollahi et al., 2016).

Большое влияние на индукцию будут оказывать регуляторы роста, присутствующие в питательной среде. Эмбриоиды и морфогенные каллусы получают в культуре пыльников или микроспор на питательных средах, содержащих различные концентрации 6-бензиламинопурина (БАП/BAP), 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д/2,4-D) и кинетина (КТ). За андрогенезом следует стадия дифференцировки, для которой не желательно присутствие в питательной среде 2,4-Д, поэтому в питательные среды обычно добавляют (различные варианты по концентрации и соотношению между собой) БАП, 1-нафталинуксусной кислоты (НУК/NAA) и KТ (Kumar & Murthy, 2004; Kumar et al. al., 2003; Song et al., 2007; Abdollahi et al., 2016; Asadi et al., 2018).

Несмотря на определенные успехи, достигнутые в последнее время при разработке технологии получения удвоенных гаплоидов огурца в культуре пыльников и микроспор, о массовом применении этих технологий пока речи не идет. Кроме того, использование культуры пыльников и микроспор имеет ограничения, поскольку проблематично использовать андрогенез для женских растений огурца (гиноцийные формы), а также в связи с тем, что селекция тыквенных культур, в первую очередь, направлена на создание форм с женским типом цветения, закрепленным генетически. Однако полученные в 2019 году данные позволяют делать оптимистичные выводы по использованию андроге-неза для получения DH-растений огурца. Предложенная авторами технология включала обработку донорных растений (в том числе, и гиноцийные формы) при выращивании нитратом серебра (AgNO 3 ) и гиббереллиновой кислотой (ГК/GA 3 ). Обработки этими веществами вызывали не только образование мужских цветков у гиноцийных образцов, но и увеличивали образование андрогенных каллусов и эмбриоидов. Было отмечено, что количество мужских цветков у растений, обработанных ГК, было в три раза меньше, чем у растений, обработанных AgNO 3 , однако пыльники растений, обработанных ГК, производили больше эмбрио-генных каллусов и эмбриодов у гиноцийных форм (Amirian et al., 2019).

Гиногенез. Наибольшей популярностью в последнее время в семействе Cucurbitaceae пользуется получение удвоенных гаплоидов в культуре неопыленных семяпочек in vitro. В основе этой технологии лежит гиногенез. Отличие гиногенеза от индуцированного партеногенеза заключается в том, что в культуру вводят неопыленные завязи (фрагменты завязи) или выделенные семяпочки, а не неполноценные зародыши, выделенные из семян. При культивировании на искусственных питательных средах гаплоидные клетки зародышевого мешка переходят с гаметофитного пути развития на спорофитный с образованием из них эмбриоидов (прямой эмбриогенез) или морфогенного каллуса, из которого в последующем образуется растение (непрямой эмбриогенез). Chambonnet D. и Dumas de Vaulx R. (1985) впервые получили в культуре неоплодотворенных семяпочек in vitro гаплоидные растения кабачка, и с этого времени гиногенез является альтернативным источником получения удвоенных гаплоидов у овощных культур семейства Cucurbitaceae (Dong et al., 2016). На процесс индукции гиногенеза влияет большое число факторов: генотип растения, условия выращивания донорного растения, стадия развития женского гаметофита, состав питательной среды, стрессовые обработки. При использовании культуры неопыленных семяпочек, так же, как и культуры пыльников, всегда остается открытым вопрос: из каких тканей (соматических или гаметофитных) произошло образование эмбриоида/каллуса, что требует в дальнейшем проведение анализа выравненности полученного потомства. Регенерацию диплоидных растений из клеток нуцеллуса и интегументов наблюдали в культуре неопыленных семяпочек риса (Kuo, 1982) и табака (Wu and Chen, 1982), а аналогичных работ для тыквенных культур нам не встречалось, тем не менее, использование молекулярных маркеров поможет отделить истинных удвоенных гаплоидов от диплоидов, образовавшихся из соматических тканей.

Впервые упоминание о получении удвоенных гаплоидов с помощью неопыленных семяпочек огурца было зарегистрировано в виде патента в 1996 году от компании Nuhmes Zaden BV, в котором Robert Dirks подробно описал процесс гиногенеза для этой культуры (US Patent 5492827). Дальнейшее изучение процесса гиногенеза было исследовано Gémes Juhasz A. и др. (1997), в ходе которого были успешно получены гаплоидные растения. Краткие протоколы по использованию метода культуры неопылен-ных семяпочек in vitro (гиногенеза) у огурца представлены в таблице 3.

Чаще всего технология получения растений-регенерантов в культуре неопыленных семяпочек включает в себя пять основных этапов. Первый этап – индукция эмбриогенеза, обеспечивающая переход клеток зародышевого мешка с гаметофитного пути развития на спорофитный с образованием эмбриоидов или морфогенного каллуса. Второй и третий этап включает регенерацию растений и их укоренение в культуре in vitro . Четвертый этап – это адаптация растений к условиям in vivo и пятый – самопыление полученных растений- регенерантов R 0 и получение семенного потомства. На каждый этап будут влиять свои критические факторы. Изучение этих факторов позволяет оптимизировать технологию под конкретный вид и генотип.

На первом этапе одним из критических факторов является стадия развития зародышевого мешка. У тыквенных культур зародышевый мешок образуется по Polygonium-типу, он полностью созревает и готов к оплодотворению через несколько часов после раскрытия цветка. Оптимальной стадией для введения в культуру in vitro является почти зрелый зародышевый мешок за 6 часов до распускания цветка (Gémes Juhász et al., 2002). Li et al. (2013) изучали влияние стадии развития завязи огурца при введении его в культуру in vitro , они установили, что лучшее время для введения эксплантата в культуру – за один сутки до распускания цветка, в случае если сбор был проведен раньше на 12 часов, то разница в количестве отозвавшихся семяпочек может достигать девяти раз. В связи с этим бутоны необходимо изолировать с вечера, а рано утром срывать. Для большинства тыквенных культур оптимальным будет полураскрывшийся бутон (Шмыкова, Супрунова, 2009; Шмыкова и др., 2015; Domblides et al., 2019).

При создании технологии получения удвоенных гаплоидов огурца используют два разных способа введения в культуру in vitro . В первом случае молодая завязь огурца после поверхностной стерилизации разрезалась продольно (Gémes Juhász et al., 2002; Li et al., 2013; Tantasawat et al., 2015; Sorntip et al., 2017; Ozsan et al., 2017) или поперечно (Diao et al., 2008; Moqbeli et al., 2013; Ozsan et al., 2017) на фрагменты, которые сразу же помещались на индукционную питательную среду, и только после трехчетырех недель культивирования развившиеся семяпочки (либо образовавшийся из них каллус и эмбриоиды) извлекали и пересаживали на свежую питательную среду для последующей регенерации из них растений. Во втором случае семяпочки сразу выделяли из молодой завязи огурца и помещали на индукционную питательную среду (Шмыкова, Супрунова, 2009; Plapung et al., 2014a,b; Tantasawat et al., 2015; Шмыкова и др., 2015; Domblides et al., 2019).

Оптимальный состав питательной среды является одним из важнейший компонентов, обеспечивающих успех технологии получения удвоенных гаплоидов. Обычно в технологии используют две питательных среды – индукционная питательная среда и регенерационная питательная среда. В качестве индукционных сред применяют разные питательные среды. Среда Miller (Miller, 1963) с добавками была использована Dirks в 1996, а среду CLC (Chee et al., 1992) первоначально использовал в своих исследованиях Gémes Juhasz a. (1997). Специально для тыквенных культур позднее им была разработана индукционная среда CBM (Cucumber Basal Medium) (Gemes Juhasz et al., 2002), которую успешно использовали большое количество исследовательских групп (Suprunova, Shmykova, 2008; Li et al., 2013;

Ozcan et al., 2017). При культивировании семяпочек тыквенных культур часто использовали и питательную среду MS в своих исследованиях в качестве основы для индукции гиногенеза (Diao et al., 2009; Moqbeli et al., 2013; Tantasawat et al., 2015; Sorntip et al., 2017). Suprunova, Shmykova (2008) использовали в своих исследованиях среду МСм (Masuda et al., 1981). В лаборатории биотехнологии ФГБНУ ФНЦО была разработана питательная среда IМС (Induction Medium for Cucurbitaceae ), которая была успешно использована для огурца (Шмыкова и др., 2015; Domblides et al., 2019). Состав этой питательной среды значительно отличается от среды СВМ и MS. Эта среда содержит повышенное содержание KNO 3 (2496,3 мг/л), увеличенное содержание никотиновой кислоты (5 мг/л), а также обогащенный аминокислотный состав.

Большое значение для индукции гиногенеза будут иметь использующиеся регуляторы роста растений (цитокинины, ауксины) и разнообразные добавки в составе индукционной среды. Большинство исследований было сделано о влиянии добавления тидиазурона в индукционную питательную среду (Suprunova and Shmykova, 2008; Diao et al., 2009; Li et al., 2013; Moqbeli et al., 2013; Ozcan et al., 2017). Впервые тидиазурон TDZ при гиногенезе в культуре неопыленных семяпочек огурца применили в своих исследованиях (Gémes Juhász et al.,1997; 2002), отметив что TDZ повышает скорость развития и формирования зародыша. Suprunova and Shmykova, 2008 изучили как влияют концентрации TDZ: 0,02 мг/л, 0,1 мг/л, 0,2 мг/л и пришли к выводу, что для каждого сорта необходимо подбирать, свое количество цитокинина. Для двух генотипов огурца подошла концентрация 0,2 мг/л, а для одного – 0,1 мг/л, при этом они отметили, что при отсутствии в индукционной среде CBM хелата железа ((FeSO 4 х 7H 2 O, Na 2 ЭДТА) семяпочки с любой концентрации TDZ не развиваются. Diao et al. (2009) изучили концентрации 0,01 мг/л, 0,02 мг/л и 0,04 мг/ л TDZ, и отметили, что для всех изученных генотипов оптимальной оказалась концентрация 0,04 мг/л, а при отсутствии TDZ зародыш не развился совсем. Изучая концентрации TDZ 0,03 мг/ л, 0,05 мг/ л, 0,07 мг/ л и 0,09 мг/л (Li et al., 2013) также получили разные данные, один генотип лучше отозвался на концентрацию 0,03 мг/л, а другой – на 0,07 мг/л, при этом все концентрации TDZ показали результат выше, чем у контроля. Эти результаты подтверждают выводы Suprunova and Shmykova (2008). Moqbeli et al. (2013) и Ozcan et al., (2017) также изучили влияние пониженных концентраций тидиазурона от 0,01 до 0,04 мг/л и подтвердили выводы сделанные раннее, что для каждого генотипа необходима своя концентрация TDZ, в их работах лучше всего на индукцию эмбриоидов повлияли концентрации 0,03 мг/л и 0,04 мг/л.

Чаще всего в качестве дополнительной добавки в индукционную питательную среду использовали нитрат серебра (AgNO 3 ) (Diao et al., 2009; Li et al., 2013). Diao et al., 2009 отметил, что использование AgNO 3 в концентрации 10 мг/л ускоряло появление и развитие эмбриодов. В экспериментах Li et al. (2013) оптимальной оказалась концентрация 5 мг/л для одного генотипа и 10 мг/л – для другого генотипа, более же высокие и более низкие концентрации не оказывали значимого влияния на индукцию и развитие эмбриоидов. В своих исследованиях Sorntip et al. (2017) экспериментировал с различными добавками (поливинил-пирроли-дон (PVP), кокосовое молоко, банановый экстракт, томатный экстракт) в индукционные и регенерационные питательные среды. Было отмечено, что PVP удаляет фенольные соединения, и за счет этого каллус дольше остается зеленым и не требует постоянных пересадок. В средах без PVP каллус достаточно быстро становился коричневым и черным. А вот добавление кокосового молока, бананового экстракта, томатного экстракта в индукционную среду приводило к снижению количества образовавшихся эмбриоидов. Sorntip et al. (2017) также использовали в одной их своих индукционных сред 0,02 мг/л триаконтанола (TRIA) и 1 мг/л трииодобензойной кислоты (TIBA), однако добавление их в питательную среду не вызвало положительного эффекта, а наоборот, снижало процент образования эмбриодов и каллуса.

Следующим важным фактором были условия культивирования и использования температурной обработки. Культивирование семяпочек в первые две недели можно проводить как на свету, так и в темноте. Для индукции эмбриогенеза у огурца эффективно применять температурную обработку в течение 7-10 дней при 32 ° С в темноте и лишь затем переносить на свет и 25 ° С (Domblides et al., 2019).

После индукции гиногенеза и успешного образования из неопыленных семяпочек эмбриоидов или каллуса, образовавшиеся структуры необходимо переносить на регенерационные питательные среды. Этот этап во многом схож с аналогичными этапами при андрогенезе и партеногенезе. В качестве среды для регенерации чаще всего используется регенерационная среда CBM (Gémes Juhász et al.,2002, Suprunova and Shmykova, 2008, Moqbeli et al., 2013;) или среда MS (Gйmes Juhбsz et al.,1997, Suprunova and Shmykova, 2008; Diao et al., 2009; Tantasawat et al., 2015; Sorntip et al., 2017). В случае прямого эмбриогенеза и образования хорошо сформированного эмбриоида можно использовать безгормональные питательные среды (Gémes Juhász et al.,1997, Li et al., 2013), но такое у огурца происходит не часто, по сравнению с другими тыквенными культурами, и тогда необходимо вводить в питательные среды регуляторы роста. Чаще всего для этих целей используют ауксины и цитокинины в различном соотношении. Gémes Juhász et al. (2002), Suprunova and Shmykova (2008) использовали в своих средах 0,05 мг/л НУК и 0,2 мг/л БАП. Moqbeli et al. (2013) использовали концентрацию 0,05 мг/л НУК и 1,5 мг/л БАП. Suprunova and Shmykova (2008) использовали также только НУК 0,04 мг/л и 0,2 мг/л, а Diao et al. (2009) использовали только БАП в концентрации 0,3 мг/л и 1,5 мг/л.

Об эффективности созданной технологии обычно судят по выходу гаплоидов/удвоенных гаплоидов на 1 культивируемую завязь или числу полученных растений из 1 завязи. Так, в опубликованном патенте US Patent 5492827 эффективность разработанной технологии составляет 240 эмбриоидов из 300 завязей огурца (то есть 0,8 эмбриоидов на 1 завязь) (Dirk, 1996), в исследованиях Gemes-Juvaz et al. (2002) на огурце максимально она составляет 18.4 эмбрио-да и 7.1 растения на 100 культивированных завязей (то есть 0,18 эмбриоидов и 0,07 растений на 1 культивируемую завязь). Diao et al. (2009) сообщили, что смогли добиться на огурце наибольшего процента индукции гиногенеза в семяпочках (89.4%) и максимального процента регенерации (9.0%). При этом им удалось получить из 366 культивируемых завязей 33 растения, что составляет 0,09 растений на 1 завязь. Li et al., (2013) сообщили об образовании эмбриоидов с частотой 12.4% (0,12 эмбриоидов на 1 культивируемую завязь. Другие исследователи смогли получить до 9 эмбриоидов и одного растения огурца из 18 культивируемых завязей, что составит 0,5 эмбриоидов и 0,05 растений на 1 культивируемую завязь (Ozsan et al., 2017). Наилучший результат был получен в лаборатории биотехнологии ФГБНУ ФНЦО (ВНИИССОК) где удалось достичь индукции гиногенеза у одного из образцов до 62,9% (Шмыкова, Супрунова, 2009) и получить до 20 растений из одной завязи (Шмыкова и др., 2015; Domblides et al., 2019). Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования технологии получения удвоенных гаплоидов в культуре неопыленных семяпочек in vitro .

Заключение

Важнейшим фактором, препятствующим использованию гаплоидов в селекции огурцов (Cucumis sativus L.), является отсутствие эффективного способа их производства в больших масштабах. Разработка эффективной системы производства удвоенных гаплоидов и ее дальнейшее применение в программах селекции тыквенных культур может сократить время, необходимое для получения гомозиготной линии, а также обеспечить селекционера разнообразным линейным материалом, необходимым для создания новых высокоурожайных гибридов с комплексом хозяйственно ценных признаков. Большое количество исследо- ваний, появившихся в последние годы по получению удвоенных гаплоидов в культуре неопыленных семяпочек и, особенно, культуре пыльников и микроспор, позволяет надеяться, что скоро будет создана перспективная технология получения удвоенных гаплоидов огурца. Основная проблема, которую необходимо решить, для всех трех технологий, это как эффективно перевести полученные растения из гаплоидов в удвоенные гаплоиды. Основными успешными подходами в данном направлении, как нам видится, будет не использование обработок колхицином, а стимулирование вторичного эмбриогенеза на ранних стадиях развития образовавшихся эмбриоидов, за счет которого происходит достаточно часто спонтанное удвоение, либо использование листовых эксплантов гаплоидных растений для повторной регенерации из них растений. Также в связи с физиологическими особенностями огурца у растений после культуры in vitro достаточно часто бывает трудно добиться одновременного распускания мужского и женского цветка, чтобы провести самоопыление, в связи с этим необходимо на этапе регенерации проводить клональное размножение, чтоб получить как можно больше растений одного генотипа, а также использовать обработки различными стимуляторами, например, нитратом серебра и гиббериллиновой кислотой.

Список сокращений/Abbreviations:

DH – doubled haploid-удвоенный гаплоид;

2,4-D – 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid – (2,4-Д);

IAA – Indole-3-acetic acid (ИУК);

NAA – α -naphthaleneacetic acid (НУК);

TDZ – thidiazuron 1-Phenyl-3-

(1,2,3-thiadiazol-5-yl)urea (тидиазурон);

КТ – Kinetin (кинетин);

BAP – 6-Benzylaminopurine (БАП);

PVP – Polyvinylpyrrolidone (ПВП);

TRIA – Triacontanol – 1-Триаконтанол;

TIBA –2,3,5-Triiodobenzoic acid –

2,3,5-Трийодбензойная кислота

Таблица 1. Краткие протоколы по использованию метода опыления облученной пыльцой ( γ -облучение, 60Co) завязей огурца (партеногенез in situ)

Table 1. Concise protocols for the use of pollination of cucumber ovaries with irradiated pollen ( γ -ray, 60Co) (parthenogenesis in situ)

Доза облучения/ Radiation doze	Время года/ Time of the year	Возраст растения, недели/ Developme ntal stage, weeks	Индукционная среда (мг/л)/ Induction medium (mg/l)	Регенерационная среда/ Regeneration medium	Методы оценки растений/ Plant evaluation	Идентифицир ованная плоидность полученных растений/ Plant ploidy identified	Литературный источник/ References
300 -1000 Гр						Н, М	Sauton, 1989
300 Гр			Е20		Метод Фельгина	DH, H	Niemirowicz-Szczytt, Dumas de Vaulx, 1989
300 Гр	Лето	3–5	E20A	MS	ЦА , МО, ППХ	DH, H, M	Przyborowski, Niemirowicz-Szczytt, 1992
300 Гр	Лето					H	Caglar, Abak, 1996 a
200 Гр,	Весна	4	MS + 0,01 мг/л IAA+3% сахароза	MS	ППХ	DH, H	Deunff, Sauton, 1994
300 Гр	Лето		E20A			DH, H	Caglar, Abak, 1999 a,b,с
100, 200 Гр		3–5	E20A	1/2 MS	ППХ	DH, H	Faris, Niemirowicz-Szczytt, 1999
250, 500 Гр		3–5	E20H8 + 0,011 мг/л IAA + 2,54 мг/л AgNO 3	E20H8 + 0,011 мг/л IAA + 2,54 мг/л AgNO 3	ПЦ, ММС	DH, H	Claveria et al., 2005
100-400 Гр		2–35	MS	MS +0,2 мг/л BAP+ 3% сахароза	МО, ПП, ПС	DH, H, M	Lei et al., 2006
250, 500 Гр			E20H8 + 0,06 мкм/л IAA + 15 мкм/л STS		ПЦ, ММС	DH, H, M	Dolcet-Sanjuan et al., 2006
300 Гр		3–5	E20A	MS	ММС	DH, H	Smiech et al., 2008
250 Гр		21–23	E20A	E20A			Lofti, Salehi, 2008
300 Гр		5-6 недель	E20A	½ MS + 1,5 мг/л 2,4-D		DH, H	Galazka et al., 2015

Примечание: ППХ – Прямой подсчет хромосом; ММС – Использование молекулярных маркеров (SSR, RAPD, ALFP); ЦА – Цитологический анализ (в том числе размер устьиц, количество хлоропластов в замыкающей клетках, длина замыкающих клеток); МО – Морфологическое описание; ПП – Показатели пыльцы; ПС – Прорастание семян; DH – Удвоенный гаплоид; H – Гаплоид; M – Миксоплоид.

Таблица 2. Краткие протоколы по использованию метода культуры пыльников и микроспор in vitro (андрогенеза) у огурца Table 2. Concise protocols for the use of anther and microspore cultivation in vitro (androgenesis) in cucumber

Метод/ Method	Стадия цветения	Холодовая предобработка/ Cold pretreatment	Обработка повышенной температурой/ Heart shock	Индукционная среда / Induction medium (mg/l)	Регенерационная среда/ Regeneration medium	Методы оценки растений	Идентифиц ированная плоидность полученных растений	Литературный источник/ References
КП	СПОС	4°C в течение 2 дней	32°C в течение 1 дня	B5 + 0,44 мг/л 2,4-D + 0,23 мг/л BAP	B5 + 0,06 мг/л KT + 0,055 мг/л NAA	ППХ	DH,H	Kumar et al., 2003, 2004, Kumar, Murthy, 2004
КП	СПОС	4°C в течение 2-3 дней		B5 + 0,442 мг/л 2,4-D + 0,225 мг/л BAP + 5% сахароза		ППХ	H	Xie et al., 2005
КП	СПОС	4°C	33°C в течение 1 часа	MS + 1,0 мг/л BAP + 1,1 мг/л KT + 0,5 мг/л 2,4-D + 3% сахароза	MS + 0,5 мг/л BAP + 6% сахароза	ППХ, ММС	DH,H	Song et al., 2007
КП	ПОС		35°C в течение 72 часов	MSm + 2,0 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP + 8% сахароза	MS + 0,2 мг/л BAP + 0,05 мг/л NAA + 2% сахароза			Suprunova, Shmykova, 2008
КМ	ПОС		22°C	NLN + 10% сахароза + 2,0 мг/л 2,4-D				Suprunova, Shmykova 2008
КМ		4°C в течение 2 дней		NLN + 0,5 мг/л 2,4-D + 0,2 мг/л BAP + 13% сахароза, pH=5,8	MS+0,2 мг/л BAP + 3% сахароза + 0,8% агар. pH=5,8	ППХ, ММС, ПЦР	DH	Chen et al. 2008 (patent)
КМ	ПОС	4°C в течение 2-3 дней	33°C в течение 1 дня	NLN+ 0,5 мг/л 2,4-D+ 0,2 мг/л BAP + 13% сахароза	MS + 0,2 мг/л BAP + 3% сахароза	ППХ	DH,H	Zhan et al., 2009
КП	СПОС		25 °C в течение 4 дней	MS + 0,44 мг/л 2-4-D + 0,23 мг/л BAP + 0.37 мг/л KT + 2,5% сахароза	MS + 3,0 мг/л BAP + 0,1 мг/л NAA + 3% сахароза	ППХ	DH,H	Hamidvand et al., 2013
КП	СПОС		25°C	MS + 0,5 мг/л 2,4-D + 1.0 мг/л BAP + 1,15 мг/л KT + 3% сахароза	MS + 0,1 мг/л NAA + 30мг/л BAP + 3% сахароза	ППХ	DH,H	Abdollahi et al., 2016
КП	СПОС	4 °С в течение 2 дней	35°C в течение 1 часа потом 25°C 20 дней	MS + 3% сахароза + 0,8 агар	MS + 0,05 и 0,1мг/л NAA (0,05 и 0,1 мг/л) и BAP (3,4 мг/л) + агар MS + BAP (0,680,91 мг/л)	ММС, ПЦ	T, DH	Asadi et al., 2018
КМ		4°C в течение 2 дней		NLN + 0,5 мг/л 2,4-D + 0,2 мг/л BAP + 13% сахароза, pH=5,8
КМ		4°C до 4 дней	0…33°C, от 24 до 72 часа	1)    MS-B5 + 30-170 г/л углеводы + 10 мг/л SAHA + 0,5 мг/л 2,4-D + 0,2 мг/л BAP + 0.5-50 мг/л PAA + 10-100 мг/л активированный уголь На 7-10 день добавление 100 мг/л путрисцина 2)    На глобулярной стадии перенос эмбрионов на двухслойную среду: Нижний слой: MS-B5 + 30120 г/л углеводы + 7 г/л агар + 100 мг/л путрисцин + 0,5 мг/л 2,4-D + 0,2 мг/л BAP +1-5 г/л активированный уголь Верхний слой: MS - B5 + 30-170 г/л углеводы + 10 мг/л SAHA + 100 мг/л пут-рисцин + 0,5 мг/л 2,4-D + 0.2 мг/л BAP + 0,5-50 мг/л PAA + 10-100 мг/л активированный уголь	1/2 MS-B5 + 30120 г/л углеводы + 7 г/л агар + 0,5-2 мг/л BAP	ППХ, ММС, ПЦР	DH, TH,T, A	Chen et al. 2018 (patent)
КП	ПН	4°С в течение 2 дней	25±1°С -20 дней	MS + 7 г / л агар, 4% сахароза, 4,52 мкМ/л - 2,4-D, 4,44 мкМ/л BAP, 1,16 мкМ/л - KT, аминокислоты: Arg, Asp, Cys и Gln по 0,5 мМ каждая, рН: 5,7 ± 0,1. MS + NАА - 1,08 мкМ/л, 4,44 BAP, 7,5 г/л - агар и 8,5% - сахароза	MS + 2,22 мкМ/л BAP + 6% сахароза.	ММС, ЦА	DH, H	Amirian et al., 2019

Примечание: КП - Культура пыльников; КМ - Культура микроспор; ПОС - Поздняя одноядерная стадия; СПОС -Среднепоздняя одноядерная стадия; ПН- Поздней неядерная стадия; ПЦ - Проточная цитометрия; ППХ - Прямой подсчет хромосом; ММС использованием молекулярных маркеров (SSR, RAPD, ALFP); ЦА - Цитологический анализ (в том числе размер устьиц, количество хлоропластов в замыкающей клетках, длина замыкающих клеток;DH- Удвоенный гаплоид; H-Гаплоид; M - Миксоплоид, T- Триплоид TH- Тетроплоид, А-Анеуплоид

Таблица 3. Краткие протоколы по использованию метода культуры неопыленных семяпочек in vitro (гиногенеза) у огурца Table 3. Concise protocols for the use of unpollinated ovule cultivation in vitro (gynogenesis) in cucumber

Эксплантат/ Explant	Стадия развития цветка/ developmental stage of flower	Обработка повышенной температурой/ heart shock	Индукционная среда / Induction medium (mg/l)	Регенерационная среда/ Regeneration medium	Методы оценки растений	Идентифицированная плоидность полученных растений	Литературный источник/ References
Фрагменты завязи	1-3 дня до раскрытия цветка	27°C	Среда Miller + орг. добавки по Fujii + 0,1 mM FeEDTA+ 3% сахароза + 9 мг/л витамин В1 + 0,79 мг/л BAP + агар. pH 5,8	безгормональная инлукционная среда		DH, H	Dirks, 1996 (patent)
Фрагменты завязи	Во время раскрытия		1)    CCL + 4% сахароза + 0,02 мг/л TDZ (10 суток) 2)    CCL + 4% сахароза + 0,05 мг/л NAA + 0,2 мг/л BAP 3)    CCL + 4% сахароза + 0,02 мг/л NAA + 0,04 мг/л BAP	MS+3% сахароза	ППХ	H	Gemes-Juhasz et al., 1997
Фрагменты завязи	За 6 часов до раскрытия цветка	35°C в течение 2-4 дней	CBM + 4% сахароза + 0,02 мг/л TDZ	CBM+3% сахароза +0,05 мг/л NAA+ 0,2 мг/л BAP	ППХ, ПЦ	DH, H, M	Gemes-Juhasz et al., 2002
Семяпочки	6 часов до раскрытия цветка	22°C	MSm + 5% сахароза + 0,2 мг/л TDZ + 0,2 мг/л BAP	MSm + 3% сахароза+ 0,05 мг/л NAA+ 0,2 мг/л BAP			Suprunova,S hmykova, 2008
Семяпочки	Полураскрытый бутон	22…24°С	1)    МСм + 0,1/ 0,2 мг/л TDZ + 5% сахароза + 0,7% агар 2)    СBM + 1/2 хелата железа ((FeSO4X 7H2O– 13,9 мг/л и Na2ЭДТА – 18,6 мг/л) + 0,02/0,2 мг/л TDZ + 5% сахароза + 0,7% агар	MSm или CBM+ 0,4 мг/л BAP + 0,02 мг/л NAA 3% сахороза			Супрунова, Шмыкова, 2009
Фрагменты завязи	1 день до раскрытия цветка	35°C 3 дня, затем 25°C	MS + 3% сахароза + 0,04 мг/л TDZ	MS + 0,3 мг/л BAP	ППХ, ПЦ	DH, H, T	Diao et al., 2009
Фрагменты завязи	Во время раскрытия цветка	35°C 4 дня в темноте	CBM + 4% сахароза + 0,03-0,07 мг/л TDZ	CBM + 3% сахароза+ 0,05 мг/л NAA + 0,2 мг/л BAP	ПЦ	DH, H, M	Li et al., 2013
Фрагменты завязи	1 день до раскрытия цветка	35°C 3 дня	MS + :0; 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 мг/л TDZ + 3% сахароза MS+1,5 мг/л GA3	MS + 0,05 мг/л NAA + 1,5 мг/л BAP	ППХ	DH, H	Moqbeli et al., 2013
Семяпочки	1 день до раскрытия цветка	25°C	CBM + 5,0 мг/л AgNO 3	MS + 2,0 мг/л + BAP + 1,0 мг/л IAA	ЦА, ППХ	DH, H	Plapung et al. (2014a,b)
Семяпочки	1 день до раскрытия цветка	35°C в течение 3 дней	MS + 1,0 мг/л TDZ + 1,0 мг/л BAP	MS + 0,2 мг/ л BAP + 0,05 мг/л NAA	ЦА		Tantasawat et al., 2015
Фрагменты завязи	1 день до раскрытия цветка	35°С в течение 4 дней, потом 25°С	MS +1,5 мг/л 2,4-D + 4 мг/л BAP + 3% сахарозы + 0,8% агар. pH=5,8				Golabadi et al., 2017
Фрагменты завязи	1 день до раскрытия цветка	27 ± 2°С	MS+1 мг/л TDZ+1 мг/л BAP+800 мг/л Gln+30 г/л - сахарозы + 3 г/л - гелита, pH 5,7	1) D2: MS + 0,05 мг/л NAA + 0,2 мг/л BAP + 0,02 мг/л TRIA + 100 мг/л Pro + 20 мг/л + 2 мг/л AgNO3 + 3 г/л гелита; pH 5,7 2) MST3 +:MS + 0,05 мг/л IBA + 1 мг/л TDZ + 0,5 мг/л GA3 + 0,02 мг/л TRIA + 1,38 г/л Pro + 30,7 мг/л глутатиона + 2 мг/л AgNO3 +100 мл/л кокосовой воды + 50 г/л томатов + 30 г/л сахарозы + 3 г/л гелита + 0,1 мг/л ABA + 10 г/л PVP + 50 г/л банана; рН 5,7	ППХ, ПЦ	DH, H, T	Sorntip et al., 2017
Фрагменты завязи	1 день до раскрытия цветка	35°С в течение 3 дней, в темноте, потом 25°С в течение 2 дней	CBM + 1,0 г / л КT +0,1 мг/л + 0,037 г/л FENAEDTA	СBM + 0,05 мг/л NAA + 0,2 мг/л BAP			Ozsan et al., 2017
Семяпочки	Полураскрытый бутон	32°C в течение 7-10 дней в темноте	IMC (Induction medium for Cucurbitaceae)+ 0,02/ 0,2 мг/л TDZ+ 0,0001 мкМ/л epibrassi-nolid	MS + 2% сахороза + 3 г/л фитогель	ППХ, ПЦ, МО, ЦА	H, DH, M	Domblides et. al, 2019

Примечание: ППХ - Прямой подсчет хромосом; ПЦ - Проточная цитометрия; МО - Морфологическое описание; ЦА -Цитологический анализ (в том числе размер устьиц, количество хлоропластов в замыкающей клетках, длина замыкающих клеток); DH - Удвоенный гаплоид; H - Гаплоид; M - Миксоплоид; Т- Тетраплоид.

Об авторах:

Белов Сергей Николаевич – м.н.с. лаб.

репродуктивной биотехнологии в селекции с.-х. растений

Elena A. Domblides – Ph.D. in Agriculture, Head of Laboratory of Reproductive Biotechnology in Crop Breeding

Sergey N. Belov – Junior Researcher of Laboratory of Reproductive Biotechnology in Crop Breeding

Alexey V. Soldatenko – Dr. Sci. (Agriculture)

Victor F. Pivovarov – Academician of the RAS, Dr. Sci. (Agriculture)