Популяционный полиморфизм клубеньковых бактерий люцерны ( Sinorhizobium meliloti) по генам симбиотической эффективности и конкурентоспособности

Клубеньковые бактерии (ризобии), которые формируют N₂-фик-сирующие симбиозы с бобовыми растениями, относятся к наиболее широко используемым в сельском хозяйстве микроорганизмами: масштабы их ежегодного выпуска в составе биопрепаратов для инокуляции бобовых культур по площадям исчисляются сотнями миллионов гектаров (1). До недавнего времени штаммы ризобий для приготовления препаратов получали методами аналитической селекции — посредством выделения из почв и клубеньков растений. С использованием транспозонового (Tn5) мутагенеза у ризобий люцерны ( Sinorhizobium meliloti ) была получена коллекция мутантов по eff -генам, которые повышают симбиотическую эффективность (СЭ) бактерий — способность увеличивать продуктивность (биомассу, количество накапливаемого азота, урожай семян) у инокулируемых растений (2). Многие из этих генов, обозначенных как негативные регуляторы симбиоза, кодируют метаболизм поставляемых растениями С-сое-динений, включая их транспорт в клетку ( eff-798 ), запасание в форме по-

Работа поддержана грантом РФФИ ¹ 14-04-01441 и Программой ЕврАзЭС, контракт ¹ 14.М04.12.0011 (тестирование симбиотической активности), а также Российским научным фондом, грант ¹ 14-26-00094 (молекулярное генотипирование популяций).

ли-Р-гидроксибутирата (phbA) и расходование на синтез поверхностных полисахаридов ( exoZ , rkpC , eglC ). Эти гены расположены в различных частях генома S. meliloti (хромосома, мегаплазмиды), что создает предпосылки для их использования в конструировании штаммов с повышенной СЭ (3). Большой интерес для конструирования таких штаммов представляют также cmp -гены, определяющие способность ризобий конкурировать за образование клубеньков с находящимися в почве малоактивными аборигенными штаммами (4). Перспективными источниками исходного материала для этой работы служат природные популяции ризобий, изменчивые по наличию eff - и cmp -генов.

В настоящей статье впервые показан популяционный полиморфизм S. meliloti по генам, контролирующим симбиотическую эффективность и конкурентоспособность, который может быть использован для отбора хозяйственно ценных штаммов ризобий.

Методика . Штаммы клубеньковых бактерий люцерны ( Sinorhizo-bium meliloti ) выделяли по стандартной методике (5) из солончаковой почвы Уральской области (Казахстан), а также из черноземной почвы Тернопольской области (Украина) и из клубеньков произрастающей на ней люцерне разных видов ( Medicago lupulina, M. sativa ). Гены, контролирующие хозяйственно ценные симбиотические признаки, идентифицировали ранее на основе анализа Tn5-мутантов эффективных штаммов СХМ1-105 и СХМ1-188, обладающих повышенной симбиотической эффективностью ( eff-798 и phbA ) либо сниженной конкурентоспособностью ( cmp-107 ) (2, 6, 7).

Для ПЦР-амплификации фрагментов ДНК, содержащих изучаемые гены, использовали следующие праймеры:

Smb21375 ( eff-798 ) — 5´-GAGAACAGCCGGGAGGAAA-3´ и 5´-CAGAACACAGCAGCCAAAGC-3´;

phbA ( eff-152 ) — 5´-CCTTCGGCAATACTCTCGC-3´ и 5´-GTTGA-GACCCGAAGCGTTG-3´;

Sma0907 ( cmp-107 ) — 5´-CCACCCTCCAGATCCAAGGT-3´ и 5´-CCTACGAGCTTTCCGGTCTC-3´.

Протокол проведения ПЦР: предварительная денатурация — 3 мин при 95 °С; 30 циклов — денатурация 30 с при 94 °С, отжиг праймеров 30 с при 54 °С, синтез ДНК 1 мин при 72 °С; финальный синтез ДНК — 5 мин при 72 °С (Термоциклер C1000 TM , «Bio-Rad», США; ЦКП «Геномные технологии и клеточная биология» Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии). Полученные ПЦР-продукты разделяли в 1 % агарозном геле по стандартной методике (8). В качестве ДНК-матрицы в ПЦР использовали лизаты изучаемых штаммов ризобий. Для этого свежую культуру бактерий вносили в 20 мл лизирующего буфера (0,25 мM NaOH; 0,25 % SDS), денатурировали в ПЦР-машине (95 °С, 15 мин), добавляли 180 мл бидистиллированной воды, центрифугировали 1 мин и хранили при -20 °С. Хромосомный локус IGS (участок между генами 16S- и 23S-рРНК), а также плазмидный локус, содержащий ген nifH (кодирует малую субъединицу нитрогеназы), анализировали по описанной ранее методике (9).

Симбиотическую эффективность штаммов S. meliloti изучали в стерильных микровегетационных опытах на люцерне посевной ( M . sa-tiva ) сорта Вега (5).

Для статистической обработки данных использовали t -критерий Стьюдента (10).

Результаты. Для изучения популяционной изменчивости ризобий люцерны (S. meliloti) по генам эффективности и конкурентоспособности в зависимости от экологических условий (тип почвы, возможность вступления в симбиоз) был проанализирован полиморфизм генов eff-798, phbA и cmp-107 у изолятов из контрастно различающихся почв: бедной, лишенной растительности солончаковой почвы Уральской области Казахстана и богатой черноземной почвы Тернопольской области Украины, на которой произрастают многочисленные популяции разных видов люцерны хмелевидной и посевной (M. lupulina и M. sativa).

1. Встречаемость генов эффективности и конкурентоспособности среди штаммов Sinorhizobium meliloti различного происхождения

Анализ полученных данных показал (табл. 1), что ген eff-798 (кодирует ABC-транспортер, обеспечивающий поступление в бактериальную клетку С-соединений) присутствует у всех штаммов S. meliloti независимо от источника выделения. Фрагмент ДНК, содержащий ген phbA (кодирует β-кетотиолазу, участвующую в накоплении бактериями поли-β-гидрокси-бутирата), имеется у всех штаммов из почв Уральской области, однако выявляется только у 82,2 % штаммов из почв Тернопольской области. Еще более низкая встречаемость гена phbA (30,8 %) была характерна для штаммов из клубеньков люцерны, собранных в Тернопольской области.

Логично предположить, что полиморфизм ризобий по гену phbA , выявленный в популяции из Тернопольской области, отражает снижение способности бактерий накапливать углерод в форме поли-β-гидроксибу-тирата, связанное с переключением на симбиотрофное питание углеродом, в избытке поставляемым растениями. Вероятно, циркуляция бактерий между богатой углеродом черноземной почвой и растениями способствует ослаблению отбора в пользу штаммов, активно накапливающих запасные питательные вещества. В то же время отбор в пользу этого признака, определяющий однородность популяции из Уральской области по наличию гена phbA , может обеспечить ей максимальную выживаемость в бедной питательными веществами и лишенный растительности солончаковой почве. Отсутствие в изученных популяциях полиморфизма по гену eff-798 , возможно, связано с тем, что кодируемый им АВС-транспортер необходим для переноса в клетку широкого спектра питательных веществ, получаемых как от растения-хозяина, так и из почвы.

Анализ СЭ S. meliloti в микровегетационных опытах показал, что все штаммы, у которых не удалось обнаружить ген phbA , эффективны (инокуляция достоверно повышала сухую массу растений люцерны сорта Вега), тогда как среди штаммов, содержащих этот ген, 29±8,1 % неэффективны. Однако для эффективных штаммов степень СЭ не зависит от присутствия гена phbA , что может быть связано с варьированием генетического фона, на котором осуществляется экспрессия этого гена.

В обеих почвенных популяциях S. meliloti был выявлен одинаково высокий полиморфизм по гену cmp-107, Tn5-мутация в котором снижает конкурентоспособность бактерий (см. табл. 1). В то же время среди изоля-тов из клубеньков, собранных в Тернопольской области, ген встречается реже, чем среди почвенных изолятов. Это позволяет предположить участие гена cmp-107, кодирующего белок с неизвестными функциями, в конкуренции бактерий не только за клубеньковые, но и за почвенные экологические ниши.

При проведении контрольных опытов по анализу полиморфизма ризобий по маркерам, не связанным непосредственно с количественным проявлением активности симбиоза, оказалось (табл. 2), что, во-первых, изменчивость по локусу IGS для клубеньковых изолятов выше, чем для ризосферных, что отражает описанное ранее общее повышение популяционного полиморфизма ризобий при переходе из почвы в клубеньковую нишу (9); во-вторых, не было обнаружено различий между популяциями по локусу nifH , который кодирует малую субъединицу нитрогеназы, но не участвует в количественном определении азотфиксирующей активности клубеньков. Таким образом, различие почвенных и клубеньковых субпопуляций по наличию генов phbA и cmp107 определяется именно их участием в контроле количественных признаков симбиоза.

2. Показатели структуры почвенной и клубеньковой субпопуляций Sinorhizo-bium meliloti по локусам igs и nifH (Тернопольская обл.)

* Различие клубеньковой и почвенной популяций достоверно (P0 < 0,05).

Ранее у разных видов клубеньковых бактерий был описан ряд генов, контролирующих симбиотическую эффективность (11-17) и конкурентоспособность (18-22), однако исследования популяционного полиморфизма этих генов не проводились.

Итак, нами впервые показан популяционный полиморфизм клубеньковых бактерий люцерны ( Sinorhizobium meliloti ) по генам, контролирующим хозяйственно ценные признаки — симбиотическую эффективность ( phbA ) и конкурентоспособность ( cmp-107 ). Высокая изменчивость популяции из богатой питательными веществами черноземной почвы Тернопольской области по гену phbA , контролирующему образование поли-β-гидроксибутирата, может быть связана с высокой доступностью углерода, получаемого посредством гетеротрофного либо симбиотрофного питания, которая снижает интенсивность отбора в пользу штаммов, активно запасающих С-соединения. Анализ полиморфизма генов, выполняющих роль негативных регуляторов симбиотической эффективности, может быть использован при отборе штаммов, перспективных для инокуляции бобовых культур.