Последовательности, схожие с МГЭ II класса, в геномах видов рода Brassica L

Первые образцы овощных и масличных культур семейства поступили в коллекцию ВИР в 1921 году в результате экспедиций Н.И. Вавилова в страны Западной Европы, США и Канаду, затем в Афганистан, Иран, Армению. Российские селекционные и местные сорта были привлечены сначала через Всесоюзную сельскохозяйственную выставку, затем в ходе экспедиций в Северо-Западный регион, на Алтай и Дальний Восток. Были организованы экспедиции в страны древней земледельческой культуры: в Средиземноморье, Эфиопию, Западный Китай — под руководством Н.И. Вавилова, в Малую Азию — П.М. Жуковского, в Индию — В.В. Марковича и др. Еще при жизни Н.И. Вавилова коллекция капусты, например, уже включала 1500 образцов. В результате этой деятельности сложился «...исходный потенциал видового разнообразия морфологических и физических свойств, необходимых для селекции и генетики» (1). Ботанико-географическое изучение масличных и овощных корнеплодных растений семейства осуществлялось в ВИР под руководством Е.Н. Синской с 1921 года, капустных культур — под руководством Т.В. Лизгуновой с 1926 года. Результатами этих исследований стали монографии, в которых была описана классификация, особенности изменчивости признаков, характеристики сортов и сортотипов, генетические основы селекции (2-5).

Происхождение, эволюция и филогенетические отношения шести представителей рода Brassica , входящих в треугольник U (треугольник

Brassica ) — B . nigra (L.) Koch., B. oleracea L., B. rapa L., B. napus L., B. juncea (L.) Czern., B . carinata A. Braun в целом определены. N. U (6) предложил графическое изображение их филогенетических взаимоотношений, когда аллотетраплоидные формы образуют стороны треугольника и находятся между слагающими их диплоидными формами, расположенными на вершинах треугольника. Согласно N. U, B . napus (AACC, 2 n = 4* = 38), B . juncea (AABB, 2 n = 4* = 36) и B . carinata (BbCc, 2 n = 4* = 34) произошли при естественной межвидовой гибридизации между парами диплоидных видов — соответственно B. rapa (AA, 2 n = 2* = 20) * B. oleracea (CC, 2 n = 2* = 18), B . rapa * B . nigra (BB, 2 n = 2* = 16) и B . nigra * B . oleracea .

Степень морфологической вариации этих культивируемых видов огромна. Однако таксономическое положение некоторых диких представителей рода, а также внутривидовых таксонов у капусты огородной B . oleracea и репы B . rapa остается предметом дискуссии (7-9). Так, крупнейший современный ботаник и систематик семейства Brassicaceae C. Gomez-Campo (7) разделил виды рода Brassica на два подрода: Brassica (27 видов) и Brassicaria (Godr.) Gomez-Campo (11 видов). В подрод Brassica входят пять секций: Brassica , Rapa (Miller) Salmeen, Micropodium DC, Brassicoides Boiss. и Sinapistrum Willkomm. Секция Brassica объединяет капусту огородную B . oleracea , капусту абиссинскую B . carinata ( n = 17, геном ВС), а также родственные капусте огородной средиземноморские виды ( n = 9, геном С). Предполагается, что гены последних интрогрессировали в вид B . oleracea и, следовательно, в становлении различных культурных разновидностей капусты участвовали дикие виды — B . cretica Lam., B . incana Ten, B . rupes-tris Rafin, B . macrocarpa Guss., B . montana Pourret, B . villosa Raimondo and Mazzola, B . insularis Moris., B . hilarionis Post., B . botteri Vis. В то же время T. Gladis и K. Hammer (9) включают их в вид B . oleracea в ранге подвидов. Неясно таксономическое положение близких таксонов, предварительно описанных как виды, — B . alboglabra Bailey и единственного дикого вида на территории бывшего СССР, эндемика Крыма B . taurica Tzvel. Большинство исследователей относят B . alboglabra к B . oleracea , а B . taurica — к B . incana в ранге подвидов (8, 10). До сих пор остается неизвестным происхождение капусты Турнефора B . tournefortii Gouan. ( n = 10).

Секция Rapa объединяет репу B . rapa , рапс B . napus и горчицу са-рептскую B . juncea . Вид B . rapa L. включает важные масличные, овощные и кормовые культуры, листовые и корнеплодные и широко распространен на земном шаре. Вид представлен столь огромным разнообразием форм, возникшим в процессе эволюции и доместикации, что многие внутривидовые таксоны имели в предыдущих классификациях ранг видов (11, 12). G. Olsson (13), доказав свободную скрещиваемость по Бейли (11) и общую кариологию, объединил их в один вид — B . rapa . Последние классификации вида (8, 9, 14) все еще носят предварительный характер из-за недостаточности знаний о происхождении, становлении и внутривидовых взаимоотношениях и требуют доработки на основе молекулярно-генетиче-ских исследований, которые также позволяют устанавливать факторы, вли-яющие на частоту и спектр генотипической изменчивости и определяющие морфобиологические вариации у видов рода Brassica .

В целом триба Brassiceae содержит примерно 240 видов, включая виды рода Brassica. Различные методы анализа позволили разделить виды Brassica на две эволюционные ветви: B. nigra (В геном) и B. rapa (A)/B. oleracea (С), которые генетически обособились 7,9 млн лет назад. Геном A произошел от уже сформированного генома С 3,3-4,0 млн лет назад. Ге- номная редукция, ставшая результатом делеций, была обнаружена в трип-лицированных блоках B. oleracea, B. rapa и B. napus при сравнении с соответствующими геномными районами Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Примерно у 1/з генов Brassica имеются гомологи в соответствующих областях генома арабидопсиса. Однако геном Brassica содержит намного больше транспозоноподобных последовательностей и псевдогенов.

Полиплоидия, столь широко представленная в роде Brassica , играет одну из основных ролей в эволюции растительных геномов (15). Подобный факт, вероятно, объясняется тем, что полиплоидизация не только приводит к определенному увеличению генома относительно предшествующего, но также сопровождается связанными с этим структурными и функциональными модификациями, которые, несомненно, представляют собой важный источник новообразований (16, 17). Недавние исследования продемонстрировали, что геном формирующихся полиплоидов, как правило, нестабилен, динамичен и к тому же подвержен влиянию генетической и эпигенетической регуляции (18, 19). Одним из факторов, определяющих такое состояние, могут быть мобильные генетические элементы, придающие хозяйскому геному растений пластичность, столь необходимую для адаптации организма к стрессорам.

Мобильные генетические элементы (МГЭ) были описаны 60 лет назад у кукурузы. По механизму перемещения (наличие или отсутствие промежуточной РНК при транспозиции) их подразделяют на два класса: к I классу относятся ретротранспозоны, у которых перемещение происходит через образование РНК-посредника с использованием обратной транспо-зазы для его перевода в ДНК, ко II — ДНК-транспозоны, осуществляющие транспозицию напрямую от ДНК к ДНК. Наши исследования посвящены МГЭ II класса. Первым детально исследованным мобильным элементом стал Activator (Ac) (20, 21). Ас — просто устроенный и сравнительно небольшой (всего 4565 п.н.) автономный мобильный элемент, содержащий концевые инвертируемые повторы (TIR — terminal inverted repeats) длиной 11 п.н., у которых самые дальние от середины нуклеотиды некомплементарны (22). Благодаря размеру, структурной организации и последовательности нуклеотидов в TIR Ас имеет значительное сходство с элементом Tam3 у Antirrhinum majus (23), а также с hobo и P элементами у Drosophila melanogaster (24, 25). Нуклеотидный состав Ас тенденциозен. Так, содержание G + C на участках размером 240 п.н. с 5'- и 3'-конца составляет соответственно 45 и 40 %. В противоположность этому доля G + C в длинной нетранслируемой последовательности равна 68 %, а в кодирующей части элемента — 38 % (26). Столь невыравненная нуклеотидная композиция разных сегментов Ас отражает их неодинаковые функции. Кроме того, многочисленные CpG мотивы на концах Ас могут означать, что эти последовательности защищены белками (возможно, всегда), поскольку многие из них с одержат сайт узнавания транспозаз (27, 28).

Следующий МГЭ II класса, который контролирует транспозицию мобильных элементов семейства Mutator (Mu) у кукурузы, — MuDR. Американские ученые установили, что существуют два основных MuDR-гомологичных транскрипта, наличие которых коррелирует с активностью элементов Mu. Все активные формы Mutator содержат MuDR. Например, у типичных Mu-форм имеется от 5 до 30 таких элементов (29), хотя у некоторых был обнаружен всего один элемент MuDR (30, 31). В однокопий-ных линиях элиминация MuDR приводит к потере активности элемента Mutator (30). Мультикопийные Mu-формы, спонтанно утратившие активность, продолжают сохранять в геномах элементы MuDR (32, 33). Несмотря 102

на присутствие MuDR, инактивированные линии не экспрессируют транскрипты MuDR (29). Следовательно, такие транскрипты могут кодировать белки, необходимые для транспозиции элементов Mu (34). Именно поэтому мы остановили выбор на MuDR для дизайна одного из классов праймеров.

Сходством с транспозазами Mutator обладают FHY3 (far-red elongated hypocotils 3) и FAR1 (far-red impaired response) — гомологичные белки, необходимые для контролируемого фитохромом А ответа на воздействие светом дальней красной области спектра ( X ® 730 нм) у Arabidopsis thaliana (35, 36). В геноме арабидопсиса существуют 12 дополнительных сопутствующих генов FHY3/FAR1. У полипептидов из этого семейства длина варьирует от 531 до 851 аминокислоты и в молекуле по всей длине от 12,0 до 82,4 % позиций представлены идентичными аминокислотами. Проработка существующих баз данных и филогенетический анализ позволили установить, что последовательности, схожие с последовательностями генов FHY3/FAR1, имеются у разных покрытосеменных растений. Они подразделяются на несколько филогенетических кластеров, перемежающихся семейством Mutator, кодирующим транспозазы, и подобными им последовательностями (36).

К характерным особенностям одной из групп транспозонов II класса, получивших название элементов САСТА, относится наличие наиболее отдаленных от середины инвертированных концевых повторов (TIR) длиной обычно 10-28 п.н., которые заканчиваются консервативным мотивом 5'-САСТА-3'. При этом внутренние последовательности элементов САСТА высоковариабельны. Кроме того, указанная группа МГЭ II класса перед инсерцией обычно образует целевой сайт дупликации из 3 п.н. Субконцевые повторы, как правило, служат местом связывания транспозаз и совместно с концевыми инвертированными повторами действуют как cis-эле -менты транспозонов (37, 38). Впервые элементы САСТА обнаружили в 1953 году у кукурузы (39). Это были En (Enhancer)-I (Inhibitor) и Spm (Suppressor-Mutator)-dspm МГЭ. С тех пор подобные элементы нашли у львиного зева (38), сои (40), моркови (41), сорго (42), петунии (43), гороха (44), риса (45) и арабидопсиса (46).

Следует отметить, что, несмотря на столь обширный материал баз данных и множество опубликованных результатов, среди видов растений, изученных на наличие упомянутых выше МГЭ II класса, нет представителей рода Brassica. Исключение составляет A. thaliana с полностью секвени-рованным геномом (, у которого ранее были обнаружены элементы Far1 и САСТА. Однако роды Arabidopsis и Brassica относятся к разным трибам семейства.

Сравнительный анализ, проведенный с привлечением методов биоинформатики, показал, что геномы модельного растения A. thaliana L. и капусты огородной B. oleracea L. (n = 9, геном СС), от которого произошел вид B. rapa, несут одни и те же мобильные элементы, хотя и в разных соотношениях, обусловленных в том числе различиями в размере генома (47). Этот результат соответствует высокой степени геномного консерватизма у двух видов, дивергировавших 15-20 млн лет назад (48). У Arabidopsis , который содержит все известные типы мобильных элементов, геном полностью секвенирован (49), тогда как у Brassica до сих пор только очень малая часть таких элементов изучена на молекулярном уровне, при этом главным объектом исследования были МГЭ I класса. Ранее установлено, что в геноме B. oleracea среди МГЭ II класса наиболее широко распространены элементы САСТА (47). В роде Brassica САСТА транспозон Bot1 прошел несколько раундов амплификации только в геноме B. oleracea в отличие от генома B. rapa, что сыграло главную роль в недавней диверген- ции двух геномов (50). Теми же авторами выявлен специфичный для С-генома сегмент Botl. В геномах B. rapa и B. napus (AACC) они обнаружили присутствие Botl-подобных элементов САСТА, определили их размер и идентифицировали TIR-последовательности. В наших исследованиях с помощью S-SAP анализа (sequence-specific amplification polymorphism) удалось установить, насколько широко Botl-подобные элементы CACTA распространены в геноме B. rapa, и было показано, что полученные на основе их последовательностей специфичные маркеры можно использовать для уточнения внутривидовой классификации B. rapa. Кроме того, эти эксперименты продемонстрировали эффективность совместного применения двух типов молекулярных маркеров, созданных на основе различных групп повторяющихся последовательностей ДНК (тандемно организованных микросателлитов и дисперсно покрывающих геном мобильных элементов САСТА) для филогенетических построений у вида B. rapa (51).

Целью настоящей работы было установление наличия в геномах видов рода Brassica последовательностей, схожих с мобильными генетическими элементами II класса — Ас, MuDR, Far1 и CACTA. Это позволяет глубже раскрыть генетическую природу изменчивости, филогенетического родства и механизмов эволюции видов, что Н.И. Вавилов относил к основным задачам генетико-селекционного изучения коллекций генетических ресурсов.

Методика . Исследование проводили на генетически и морфологически разнообразных представителях четырех из пяти секций подрода Brassica . Всего было изучено 45 образцов из коллекции Всероссийского НИИ растениеводства (ВИР), включая горчицу полевую Sinapis arvensis L., содержащую геном S.

ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, которая содержала Трис-HCl (66 мМ, pH 8,4), сульфат аммония (16 мМ), хлорид магния (2 мМ), Твин 20 (0,1 %), глицерин (7 %), бычий сывороточный альбумин (100 мкг/мл), dNTP (по 0,2 мМ), праймер (для каждого по 5 пМ) и 1,25 ед. Taq-полимеразы. Реакцию проводили в следующих условиях: денатурация при 95 ° С (1 мин), элонгация при 72 ° С (1 мин), температура отжига и число циклов амплификации — оптимизированы в зависимости от эксперимента (52-54) (амплификатор C1000 фирмы «BioRad», США); электрофоретический маркер молекулярных масс — 100 kb Ladder («Gibco BRL», Великобритания, «Fermentas», Литва). Праймеры были гомологичны участкам последовательности Ас и MuDR в геноме кукурузы, а также Far1 и CACTA — в геноме арабидопсиса. Для Ас использовали праймеры (соответственно прямые и обратные) E16 (5'-AAT CCC GTA CCG ACC GTT ATC-3') и E17 (5'-AGA GAG GCA GAG CAG CGT TC-3'), E15 (5'-CAG GGA TGA AAG TAG GAT GGG A-3') и D3 (5'-GAA ACG GTC GGG AAA CTA GCT C-3'), E20 (5'-TGA CAG ATG AGC CTT GGT TGT AAT-3') и E21 (5'-CGA ACG GGA TAA ATA CGG TAA TCG-3'), D2 (5'-CCC GTC CGA TTT CGA CTT T-3') и E22 (5'-TTA ACT TGC GGG ACG GAA AC-3'); для MuDR (соответственно прямые и обратные) — D12 (5'-GGT TGA AGC AGT TAA GGC CTC A-3') и D13 (5'-ATG CTA TTC AAG AAA TGA GGA GGC-3'), D14 (5'-TCA TCT ACG GAA GGG TTG TC-3') и D15 (5'-GGT CGT TTA TCT CTT CGA ACC TGT-3'), E4 (5'-CGC GGT ATT TGT TGC TGA GA-3') и E5 (5'-TTG CTG AGA AGG AGG CCA AG-3'), E6 (5'-CCT CAT CGA ATG TGG TAT GGA TTA-3') и E7 (5'-TTT CCC ATA GCT CTG GAT CTT CTG-3'); для Far1 (соответственно прямые и обратные) — D10 (5'-CAT GGC TTG CTG ATT CGT GAA-3') и D11 (5'-TTG GGC AGA ACT CAA ATG CTC-3'), E11 (5'-TCG GCA TGC TTT GAT GAT TC-3') и E13 (5'-TGG TTG CAA GCT CTG TTG AGA-3'); для САСТА — D5 (5'-

CCC TTG GTT GTG CAT GAA GA-3') (прямой), а также D6 (5'-GCA CCT GAC GCA TCC AGA A-3') и D7 (5'-AGC AGT GCG GCT CTC ATA GG-3') (обратные).

Результаты . В качестве объектов изучения отобрали достаточно разнообразных генетически представителей четырех из пяти секций подрода Brassica , в том числе полиплоидных (табл. 1).

Для выполнения молекулярно-генетического анализа с применением ПЦР нами были сконструированы праймеры, гомологичные 5'- и 3'-области последовательности Ас в геноме кукурузы (52), а также участкам из области MudrB (53) МГЭ MuDR, имеющимся в базе данных GenBank (Na-

• 1.    Образцы рода Brassica L., исследованные на наличие последовательностей, схожих с МГЭ II класса, и использованные при этом праймеры (мировая коллекция ВИР, Всероссийский НИИ растениеводства)

  № по каталог	у ВИР |      Название     | Происхождение | Набор пар праймеров
  Капуста огородная Brassica oleracea L. (геном C) Белокочанная B. oleracea convar. capitata var. capitata f alba
  к-2418	Белоснежка              Украина            D5-D7, E16-E17
  к-2516	Русиновка                Беларусь            D5-D7, E16-E17 Краснокочанная B. oleracea convar. capitata var. capitata f rubra
  к-172	Herbst rot                Германия            D5-D7, E16-E17
  к-173	Late Winter               Нидерланды         D5-D7, E16-E17 Савойская B. oleracea convar. capitata var. sabauda
  к-328	Hammer                 Нидерланды         D13-D14, D5-D7, E16-E17
  к-346	Chieftain Savoy             Канада               D5-D7, E16-E17 Кольраби B. oleracea convar. acephala var. gongylodes
  к-231	Kashmere                Пакистан           D5-D7, E16-E17
  к-279	Knaufs Ideal              Германия            D5-D7, E16-E17 Брюссельская B. oleracea convar. acephala var. gemmifera
  к-151	Pilar F 1                    Нидерланды         D5-D7, E16-E17 Листовая B. oleracea convar. acephala var. acephala
  к-362	Пальмира               Россия             D5-D7, E16-E17
  к-363	Краски Востока           Россия              D13-D14, D5-D7, E16-E17 Цветная B. oleracea convar. botrytis var. botrytis
  к-592	Отечественная           Россия             D5-D7
  к-609	Cambridge 6              Великобритания      D5-D7, E16-E17 Брокколи B. oleracea convar. botrytis var. italica
  к-285	Clipper F 1                 Нидерланды         D5-D7
  к-292	Emerald city F 1             Япония             D5-D7
  Средиземноморские виды, родственные B . oleracea L. (геном С)
  вр. 2	B . incana                 Германия            D5-D7, E16-E17
  к-6587	B . villosa                   Италия               D5-D7
  к-6343	B . cretica                  Италия               D5-D7
  к-7356	B . insularis                 Италия               D5-D7 B. tournefortii Gouan. (геном T)
  вр. 9	Капуста Турнефора       Франция           E11-E14, D5-D7 B. rap a L. (г е н о м А) Капуста пекинская B. rapa ssp. pekinensis Hanelt
  к-312	Ducre                   Корея              D5-D7 Капуста розеточная B. rapa ssp. rosularis Hanelt
  к-117	Cяо-байе-тацай          Китай              D5-D7 B. na pu s L. (геном AC) Брюква B. napus rapifera
  к-591	Мустиала               Швеция            D5-D7
  к-264	Гофманская белая        Германия           D5-D7
  к-415	Бангольмская            Германия           D5-D7
  к-437	Вышегородская           Россия              E11-E14, D5-D7, E16-E17
  к-679	Куузику                 Эстония            D13-D14, D5-D7, E16-E17 Рапс B. napus oleifera Metzg.
  к-4719	f. annua , Juvel              Швеция              E11-E14, D5-D7
  к-4721	f. annua , Westar            Канада               E11-E14, D5-D7
  к-4920	f. annua , Ратник           Россия               E11-E14, D5-D7
  к-4963	f. biennis , Polo              Польша              D5-D6, D5-D7 Горчица сарептская B. juncea (L.) Czern. (геном AB)
  к-4619	Тавричанка 10            Россия              E11-E14, D5-D6, D5-D7
  к-4630	Yalisko                   Мексика            D13-D14, E11-E14, D5-D6
  к-4667	Siromo                  Австралия           D13-D14, D5-D6, D5-D7
  к-4512	Суздальская              Россия              E11-E14, D5-D6, D5-D7 Горчица черная B. nigra (L.) Koch. (геном В)
  к-2666	Местная                Франция            E11-E14, D5-D7
  к-2669	Дания              E11-E14, D5-D6, D5-D7

• 2.    Частота встречаемости амплифицированных фрагментов ДНК МГЭ II класса у образцов родов Brassica L. и Sinapis L. с разными геномами (мировая коллекция ВИР, Всероссийский НИИ растениеводства)

  Пара праймеров	Размер ампликона, п.н.	Число образцов, несущих аллель/общее число образцов с указанным геномом
  		А	В	С		АВ	АС	ВС	АВС	T	S
  				культурные	дикие
  D13-D14	320	-	-	-	-	2/4	1/9	-	-	-	-
  E11-E14	150	-	4/4	-	-	3/4	-	4/4	-	-	-
  	270	-	2/4	-	-	-	-	-	-	-	-
  	330	-	2/4	-	-	-	-	-	-	-	-
  	400	-	-	-	-	3/4	4/9	-	-	-	-
  	520	-	4/4	-	-	-	-	-	-	-	-
  	620	-	-	-	-	-	-	-	-	1/1
  	1000	-	4/4	-	-	1/4	-	2/4	-	-	-
  D5-D6	200	-	3/4	-	-	4/4	-	4/4	-	-	-
  	280	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1/1
  	480	-	-	-	-	-	-	2/4	-	-	-
  	820	-	3/4	-	-	-	-	-	-	-	-
  D5-D7	200	2/2	4/4	15/15	4/4	4/4	9/9	4/4	1/1	1/1	1/1
  	320	-	-	-	1/4	-	1/9	-	-	-	-
  	400	-	-	-	1/4	1/4	4/9	-	-	-	-
  	550	-	-	12/15	4/4	1/4	4/9	-	-	1/1	-
  E16-E17	150	-	-	2/15	-	-	-	-	-	-	-
  	200	-	-	1/15	-	-	-	-	-	-	-
  	370	-	-	12/15	1/4	-	2/9	-	-	-	-
  Примечание. МГЭ — мобильные генетические элементы.					Прочерки означают			что ампликоны			соот-
  ветствующего размера не выявлялись.

Продолжение таблицы 1

к-2671	Местная	Германия	E11-E14, D5-D6, D5-D7
к-2673	Alaska	Австралия	E11-E14, D5-D6, D5-D7
	Капуста абиссинская	B. carinata R. Braun (ген	о м ВС)
к-4517	BCRIDA - 171	Индия	E11-E14, D5-D6, D5-D7
к-4676	Местная 3/10	Эфиопия	E11-E14, D5-D6, D5-D7
к-4677	Местная 10/5	Эфиопия	E11-E14, D5-D6, D5-D7
к-4704	BRA 1031/79	Австралия	E11-E14, D5-D6, D5-D7
	Синтетический гексаплоид B. composita (геном ABC)
к-4		Россия	D5-D7
	Горчица полевая	Sinapis arvensis L. (геном	S)
вр. 11		Франция	D5-D6, D5-D7

Примечание. МГЭ — мобильные генетические элементы. Праймеры соответствуют приведенным в таблице 2, с которыми у указанного генотипа получена амплификация. Пропуски означают, что название отсутствует.

tional Center for Biotechnology Information — NCBI). Дополнительно аналогичным образом создали праймеры, которые использовались при изучении последовательностей Farl и CACTA (54).

Проведенное изучение показало достаточно высокую степень межвидового полиморфизма между членами рода Brassica и близкого рода Sinapis . Всего наблюдали 19 полиморфных фрагментов (табл. 2) при размере ам-плифицированных от 150 до 1000 п.н. Были обнаружены фрагменты, видоспецифичные для всех естественных форм, содержащих В-геном: ампликоны размером 150 п.н., полученные с праймерами E11-E14, и 200 п.н. — с D5-D6, а также фрагменты, свойственные только исходному диплоидному виду (горчица черная, геном В), длиной 270, 330 и 520 п.н., полученные с праймерами E11-E14. В то же время синтетический гексаплоид B . composita (геном АВС) содержал только фрагмент, присутствующий у всех исследованных образцов рода Brassica и у горчицы полевой Sinapis arvensis (геном S) (200 п.н., праймеры D5-D7).

Отмечался фрагмент (550 п.н., праймеры D5-D7), свойственный подавляющему большинству членов видов с геномом С — капусте огородной, родственным ей диким средиземноморским видам и капусте Тур-нефора (B. tournefortii, геном T). Такой же фрагмент наблюдали у полови- ны образцов рапса и брюквы с геномом АС. В то же время указанный фрагмент нельзя считать специфичным для генома С, поскольку у образцов капусты абиссинской с геномом ВС он не выявлялся. Однако этим подтверждается известное заключение о близости геномов А и С и удаленности от них генома В. У некоторых разновидностей вида капусты огородной (например, у образца кольраби из Пакистана) обнаруживались редкие аллели, но насколько они специфичны для названных ботанических таксонов, предстоит выяснить в дальнейшем. Наличие общего фрагмента (370 п.н., праймеры E16-E17) у средиземноморского вида B. incana и некоторых образцов культурных разновидностей капусты огородной и рапса может свидетельствовать об участии B. incana в их формировании, возможно, в результате интрогрессии генетического материала вида в предковую форму B. oleracea. По результатам наших исследований можно отметить отдельное положение капусты Турнефора как вида и предположить две возможности его происхождения: вследствие интрогрессии генетического материала комплекса B. oleracea/B. rapa в геном горчицы черной B. nigra или наоборот. У капусты Турнефора мы не нашли фрагментов, общих для видов, содержащих В-геном, но обнаружили ампликон, присущий многим С-геномным видам. Фрагменты, которые были бы маркерными для генома А, выявить не удалось. Имелся фрагмент, специфичный только для горчицы полевой (280 п.н., праймеры D5-D6). На электрофоретических профилях амплифицируемые фрагменты чаще были представленные одной, редко двумя, еще реже — тремя-четырьмя полосами, то есть полиморфизм был низким.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о наличии в геномах представителей всех изученных видов рода Brassica последовательностей, схожих с МГЭ II класса (Ас, MuDR, Farl, CACTA).

Как уже отмечалось, объем сведений о транспозоноподобных последовательностях и псевдогенах у Brassica незначителен, а имеющаяся информация достаточно противоречива. Согласно недавним филогенетическим исследованиям, у шести видов рода Brassica удалось различить кластеры Tyl/copia и LINE-подобных элементов, а третий кластер оказался подразделен на Ty3/gypsy, Attila и вирусоподобные ветви, подтверждая, что многочисленные подветви внутри этой группы могут рассматриваться как gypsy-подобные элементы растений (55). Дендрограммы не дали ветвей, коррелирующих с известными геномными взаимоотношениями видов Brassica (возможно, потому, что члены семейств изученных элементов были представлены в общем предке Brassica в отличие от других повторяющихся последовательностей). Здесь вероятна также конвергентная эволюция или горизонтальный перенос. Полученные результаты о последовательностях ретроэлементов не позволили K. Alix с соавт. (55) сделать выводы о филогении рода, хотя Саузерн-гибридизация подтвердила, что у отдельных видов некоторые подсемейства ретроэлементов могут быть амплифициро-ваны. Другие авторы (56) предприняли исследование по идентификации и характеристике основных повторов в центромерном и перицентомерном гетерохроматине у вида B. rapa. Были идентифицированы три копии цен-тромер-специфичных ретротранспозонов Brassica (CRB), вариабельные пе-рицентромер-специфичные ретротранспозоны (PCRBr), а также 24 копии центромерных повторов (CentBr) размером 176 п.н. Выявлена мозаичная структура, состоящая из девяти PCRBr и широких блоков тандемных повторов (TR238). Определено, что CRB — главный компонент всех центромер диплоидных и аллотетраплоидных видов Brassica. Однако центромерные повторы (CentBr) не были найдены в наиболее отдаленном из про- анализированных родственных видов — B. nigra. Показано, что PCRBr и TR238 — главные компоненты перицентромерных гетерохроматиновых блоков четырех хромосом B. rapa. Эти повторяющиеся элементы не идентифицированы у B. oleracea и B. nigra, что свидетельствует об их специфичности для А-генома.

Однако все перечисленные МГЭ не относятся к тем МГЭ II класса, которые мы изучили, что позволяет считать проведенные нами исследования приоритетными. Кроме того, на основании результатов, полученных в наших экспериментах, можно сделать вывод о том, что амплифицирован-ные последовательности МГЭ II класса благодаря разнообразию и распространенности в геномах у видов рода Brassica полезны при разработке молекулярных маркеров, в частности S-SAP (51), а S-SAP-маркеры могут напрямую использоваться для анализа генетического разнообразия видов рода Brassica , геномного картирования и филогенетических построений. К сожалению, из-за низкого полиморфизма не представляется возможным построение филогенетического древа, определяющего ботанико-систематические связи культурных и диких видов рода Brassica , на основе электрофоретического анализа ПЦР-ампликонов. В дальнейшем предстоит установить степень гомологии ПЦР-амплифицированных последовательностей с последовательностями известных МГЭ II класса, в том числе тех, на основе которых разрабатывались праймеры, использованные нами в работе.

Итак, в настоящей работе приведены результаты ПЦР-оценки распространения и полиморфизма маркеров на основе элементов Ас, MuDR, Farl и CACTA у образцов, представляющих виды семейства Brassicaceae L. в мировой коллекции ВИР, в связи с обсуждением их филогении, эволюции и полиплоидии. Рассмотрена генетическая нестабильность геномов у видов рода Brassica и перспективы использования первичных нуклеотидных последовательностей, схожих с мобильными генетическими элементами (МГЭ) II класса (Ас, MuDR, Farl и CACTA), при создании молекулярных маркеров для анализа генетического разнообразия культур модельного семейства Brassicaceae L. Этот подход может быть применен при изучении других семейств, что позволит глубже понять генетическую природу изменчивости, молекулярные механизмы эволюции видов и их филогенетическое родство.