Потенциометрические измерения трансмембранного потенциала клеток с использованием проникающих ионов

Косвенные методы измерения трансмембранного потенциала с использованием проникающих (липофильных) ионов стали активно использоваться при исследовании энергетического сопряжения на митохондриальных мембранах [1]. При использовании таких ионов, в частности катионов тетрафенилфосфония ТФФ⁺ (TPP⁺), несущих делокализованный положительный заряд, были получены многочисленные важные научные результаты. В самое последнее время исследована [2] специфическая функция ТФФ⁺ как ингибитора выхода ионов Ca^{2 +} из митохондрий клеток сердечной мышцы, что способствует энергоснабжению.

Эти измерения стали актуальными и для бактериальных клеток как с точки зрения исследования мембранной энергетики, так и для оценки жизнеспособности клеточных популяций. Исследования с использованием проникающих ионов способствовали также развитию детальных представлений о строении периферической области клеток и органелл. Эта область представляет собой, как правило, морфологически сложную слоистую концентрическую структуру с непрерывным электрическим потенциальным профилем, включая локальные скачки потенциала на границах отдельных слоев. Электрический потенциальный профиль в целом отражает как пассивные (абиогенные) свойства клеточной периферии, так и процессы, связанные с энергетическим метаболизмом.

Косвенные методы измерения основаны на использовании химических агентов, действие которых сводится к энергизации или деэнергизации клеток и органелл. Это прежде всего активация или ингибирование сопряженных процессов дыхания (переноса электронов) и фосфорилирования или разобщение обоих этих процессов. Такими агентами являются некоторые липофильные фенолы (например, 2,4-динитрофенол, разобщающее действие которого известно очень давно), а также некоторые антибиотики, стимулирующие или подавляющие дыхание и фосфорилирование.

В этой работе использовался шунтирующий мембрану для катионов H+, K+, Na+ и (селективно) ТФФ+ ионофорный антибиотик (порообразующий токсин) грамицидин, угнетающий энергизацию клеток (фосфорилирование), не подавляя или умеренно подавляя (при накоплении в клетке K+) при этом дыхание. Спиральный пептид грамицидин А, продуцируемый бактерией Bacillus brevis, состоит из 15 аминокислот и встраивается в мембранный бислой таким образом, что две его спирали, соприкасающиеся своими концами, образуют сквозной трансмембранный ионный канал. При этом диаметр (просвет) канала равен 4 Å, а длина, равная 2 × 30 = 60 Å, должна (для максимальной проницаемости) близко соответствовать толщине мембраны. Селективность (проницаемость) такого канала, определяемая радиусом витков спирали, для однозарядных ионов представлена рядом H+ > > NH4+ > Cs+ > Rb+ > K+ > Na+ > Li+, т. е. наиболее выражена для протонов [3]. При этом ионный радиус протона H+ (0.38 Å) примерно в 4 раза меньше ионного радиуса ближайшего к протону по проницаемости катиона аммония NH4+ (1.46 Å) и примерно в 10 раз меньше ионного радиуса катиона ТФФ+ (около 4 Å) . Таким образом, можно предполагать однорядовый механизм диффузионного продвижения катионов ТФФ+ вдоль мембранного канала, образованного грамицидином.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

Проблема измерения мембранного потенциала косвенными методами (главным образом потенциометрическим и флуоресцентным) связана с тем, что распределение связанных с клеткой зондирующих (индикаторных) ионов в направлении от поверхности клетки внутрь, как правило, неизвестно. Первоначально при использовании ТФФ+ предполагалось [4–7], что весь измеренный потенциометрически, т. е. с использованием ТФФ+-селективного электрода, связанный клетками пул катионов благодаря липофильности оказывается в цитоплазматическом матриксе. Однако предположение о том, что липофильность сама по себе может обеспечить пассивную диффузию зондирующих ионов в клетку, физически не обоснована. Оставались непонятными все физические процессы, происходящие на поверхности и в периферическом слое, граничащем с мембраной. Использование формулы Нернста позволяло сразу вычислить разность потенциалов, однако было недостаточным для того, чтобы считать ее трансмембранной. Усложнения формулы Нернста [4, 5] позволяли уточнить результат, однако это требовало многих дополнительных данных, например точного знания объема внутриклеточной воды [4].

В вычислениях мембранного потенциала светочувствительных клеток Rhodopseudomonas sphe-roides пул поглощенного ТФФ+ разделялся на свободную и связанную части с разными концентрациями [8]. В расчетное соотношение для мембранного потенциала, полученное с использованием закона действующих масс, входили такие параметры, как доля инкубационного объема, занятого клетками, а также и обе концентрации. В другой статье той же группы исследователей [9] на том же биологическом материале утверждалось, что 47 % мест связывания ТФФ+ находится на внутренней стороне цитоплазматической мембраны, а 53 % — на внешней стороне. Таким образом, предполагалось, что весь связанный материал находился на мембране, но не в цитоплазме. Отметим, что с принципиальной точки зрения уравнение Нернста отражает только постоянство электрохимического потенциала при наличии в электролите концентрационного градиента ионов определенного вида или разности потенциалов между двумя водными отсеками, разделенными проницаемой для этих ионов перегородкой, но ничего не говорит о характере связывания. Кроме того, если одна из концентраций неограниченно убывает, равновесная разность электрических потенциалов неограниченно возрастает.

Несколько позже более частым способом измерения мембранного потенциала стало применение флуоресцентных техник, например, с использованием положительно заряженных карбоцианинов (дипропилтиодикарбоцианин DiSC 3 (5) и другие) [10]. Однако и в этом случае увеличение или уменьшение уровня флуоресценции отражает только свойства микроокружения (полярность и вязкость) хромофора красителя в области связывания и соответственно квантовый выход флуоресценции, но не связаны с локализацией мест связывания красителя и механизмами связывания.

МЕТОДИКА И РЕЗУЛЬТАТЫ

В этой работе использовался достаточно стабильный потенциометрический мембранный электрод, селективный по отношению к катионам ТФФ+, разработанный на кафедре биохимии и биофизики Вильнюсского университета [11].

Электрод представляет собой структурную матрицу на основе материала стекловолокнистых фильтров марки Whatman GF/F, пропитанную раствором ионообменного комплекса тетрафенил-фосфоний—тетрафенилборат (ТФФ+-ТФБ–) в тетрагидрофуране. Эта плоская структура с обеих сторон покрывалась слоем поливинилхлорида, для чего последний также растворялся в тетрагидрофуране с небольшой добавкой диоктилфталата. Электрод выполнялся в виде стеклянной трубочки, запаянной с одного конца упомянутой выше стекловолокнистой матрицей, и заполнялся изнутри 10–2 М раствором ТФФ в воде. Для электрического контакта служил стандартный хлорсеребряный электрод сравнения, сочленяемый после его предварительной разборки с трубочкой измерительного электрода. Другим электрическим контактом служил еще один хлорсеребряный электрод сравнения, помещаемый в инкубационную среду. Измерительная цепь замыкалась через электролитический ключ. Селективность электрода по отношению к ближайшему аналогу ТФФ+ трифе-нилметилфосфонию (ТФМФ+) составляла 3·10–2.

Рис. 1. Зависимость электродного потенциала от концентрации ТФФ и ТФБ в инкубационной среде.

Концентрация во внутреннем объеме электрода 10–2 М

Клетки B.subtilis

Рис. 2. Изменение электродного потенциала при связывании (сорбции) индикаторных катионов ТФФ⁺ клетками B.subtilis и потере (десорбции) при действии грамицидина.

Концентрация ТФФ+ в инкубационной среде (физиологический раствор) — 10–5 М; концентрация клеток (по сухому весу) — 0.56 мг·мл–1; концентрация грамицидина — 5.85 мкМ

По отношению ко всем остальным компонентам включая NaCl, Трис-HCl, MgSO 4 , глюкозу, АТФ и многие другие — не более 3·10^–5 [4].

На рис. 1 представлены концентрационные характеристики электрода по отношению к ТФФ⁺ и ТФБ^-, откуда следует, что метрологические свойства катион-селективного электрода с точки зрения диапазона измерений и линейности существенно лучше, чем анион-селективного. Из рис. 1 также следует, что в диапазоне концентраций от 10^–6 М до значения 10^–3 М или несколько большего значения ТФФ⁺-селективный электрод является нернстовским с угловым коэффициентом прямой, равным 59.1 мВ на декаду. Изменения электродного потенциала в диапазоне значений pH7.0 ± 0.5 составляли не более 2 мВ.

Рис. 2 показывает характер потенциометрического эксперимента, необходимого для расчетов трансмембранного потенциала. Добавление в инкубационную среду (физиологический раствор) интактных клеток B.subtilis приводит к связыванию (сорбции) индикаторных катионов. Изменение потенциала измерительного электрода после добавления клеток составляло Афэ = 1мВ . Последующее добавление грамицидина в концентрации 4–6 мкМ соответствует десорбции связанных катионов. Оба процесса сорбции и десорбции почти обратимы с точностью до небольшого по величине потенциала Афа , обозначаемого [4] как доннанов-ский и связанного с невозможностью выхода во внешнюю среду части сорбированных катионов, иммобилизованных в углеводородном ядре мем- браны и на ее внутренней стороне. Добавление грамицидина инициирует процесс образования мембранных каналов (пор), который ведет к де-энергизации мембраны и к инактивации клеток. Порообразование порождает, во-первых, конкурентное (по отношению к катионам ТФФ+) связывание протонов в поверхностном слое и соответственно выход во внешнюю среду индикаторных катионов, а, во-вторых, относительно медленное частичное поглощение их мембраной.

Процедура расчета трансмембранного потенциала сводилась [4] к следующим действиям. Добавление интактных клеток Bacillus subtilis позволяло измерить электродный потенциал А ф_э и далее определить концентрацию C_э^out индикаторных катионов после окончания (около 100 c) процесса связывания их с клетками в среде с исходной концентрацией C_эⁱⁿ на основании формулы Нернста:

RT   Cin

А ф =   ln —— э nF   Cэout где RT/nF = kT/e = 25.7мВ (T = 298K).

Для расчета использовалась та часть изменения концентрации ТФФ+ в суспензии клеток Bacillus subtilis, которая связана с действием на клетки грамицидина. Эта часть, соответствующая изменению электродного потенциала, равного Афэ - Афd , в конкретном случае составляла 2.49 нМ в расчете на 1 мл суспензии. Первона- чально предполагалось, как уже было отмечено ранее, что действие грамицидина приводит к проникновению катионов ТФФ+ в цитоплазму клеток. Далее вычислялся общий объем цитоплазматического матрикса в расчете на 1 мл суспензии при известной концентрации клеток. Таким образом определялись величина сухого веса клеток (0.56 мг в расчете на 1 мл суспензии) и соответствующий объем внутриклеточной воды (2 мкл на 1 мл суспензии). Это давало значение эквивалентной концентрации ТФФ+ в клетке, равное в данном случае С™ = 2.49/(0.56 • 2) = 2.22мМ. Трансмембранный потенциал определялся из соотношения in

А Ф К = - К ln - к г, (1) ^м φ out

Cкл в котором kφ = kT / e = 25.7мВ ; Cкoлut = 5.85мкМ — концентрация ТФФ+ в инкубационной среде. Вычисления дают значение АфМ =-152.6мВ. Знак (минус) соответствует цитоплазматическому матриксу. Это значение находится в согласии с большой совокупностью экспериментальных данных измерений трансмембранного потенциала для сопрягающих мембран различной природы.

Существуют некоторые противоречия относительно корректности такой процедуры расчета. Поскольку детали распределения связанных катионов неизвестны, достоверным, по-видимому, можно считать только утверждение, что особенности связывания и количество связанных клетками катионов каким-то образом зависят от трансмембранной разности потенциалов и, следовательно, от уровня энергетического метаболизма. Таким образом, вычисленное значение А ф М определяет не трансмембранный потенциал, а суммарную разность потенциалов между цитоплазмой и водным окружением клетки, т. е. алгебраическую сумму всех компонентов трансмембранного потенциального профиля.

Рассмотрим далее потенциометрический ответ электрода, исходя из предположения об адсорбции ТФФ+ на клеточной поверхности. Косвенно об этом свидетельствует почти обратимый (с точностью до доннановского потенциала цитоплазмы) характер ответов при последовательном добавлении клеток и грамицидина, показанный на рис. 2. Обсуждаемый ниже подход основан на следующих положениях.

• 1.    Физиологически активная часть бактериальной клетки с дыхательным типом энергетики, т. е. плазматическая мембрана, несущая трансмембранную разность потенциалов, поляризует периферическую область клетки, граничащую с ее водным окружением. Эта поляризация определяет

• 2.    Индикаторные катионы ТФФ⁺, несущие делокализованный электрический заряд, благодаря чему ослабляется кулоновское взаимодействие катиона с полимерной решеткой периферии, образуют на поверхности плотный двойной электрический слой вместе с анионными группами клеточной периферии, но не проникают в цитоплазматический матрикс.

• 3.    Грамицидин образует в плазматической мембране каналы; присутствие сорбированных катионов ТФФ⁺ делает внешнюю поверхность плазматической мембраны липофильной, что, как известно [3], необходимо для образования трансмембранных каналов.

• 4.    Образование мембранных каналов, проницаемых для протонов, приводит к шунтированию трансмембранной разности потенциалов и частичной или полной деполяризации поверхности клетки.

• 5.    Деполяризация поверхности приводит, во-первых, к деструкции двойного электрического слоя и выходу сорбированных катионов во внешний водный объем, а, во-вторых, к однорядовому диффузионному продвижению части этих катионов в каналах (порах) к внутренней поверхности мембраны.

• 6.    Накопление в порах положительного пространственного заряда устанавливает равновесное распределение катионов по длине поры, т. е. равенство химического и электрического потенциалов этих катионов.

совместно с пассивными (абиогенными) свойствами периферии величину отрицательных поверхностного и электрокинетического потенциалов.

Пусть концентрация проникающих ионов С (r) убывает при удалении от наружной границы сферической клетки радиуса r = a внутрь. При этом удовлетворяется условие сохранения числа частиц (ионов), записываемое в форме a -8                        4           ч

J С ( r ) 4 nr ²d r = C™ 3 п ( a - 8 ) ³,       (2)

a где δ — толщина клеточной периферии; Cкinл — значение концентрации из (1). Выполнение условия сохранения в данном контексте сводится к тому, что все поглощенные ионы размещаются в объеме клеточной периферии (клеточная стенка плюс мембрана для бактериальных клеток). Пусть теперь для простоты концентрация выражается экспоненциальной формой

C ( r) = CmexP [—a ( a — r)] , где α — параметр, показывающий скорость убывания концентрации, Cm — граничная концентрация при r = a . Таким образом, вся перифериче- ская область клетки предполагается однородной средой, не имеющей внутренних границ раздела. Это предположение оказывается тем более верным, чем меньше толщина адсорбированного слоя. После интегрирования в левой части (2) при условиях a - § = а и exp(-a§)^1 получаем уравнение

C m

^ a ²   2 a 2

--+ —T + —T 2       3

^ a a a

= C a- = - Cina3, m              кл ,

α 3

или

Cm in Cкл

1 αa .

Определим далее ход электрического потен-

циала в поверхностном слое клетки, соответствующий принятой экспоненциальной концентрационной зависимости. Рассмотрим элементарный участок d r , расположенный внутри периферического слоя толщины δ . Из уравнения (1) при условии r < a элементарное приращение потенциала выражается следующим образом:

Рис. 3. Зависимость концентрации индикаторных катионов ТФФ⁺ и генерируемого ими потенциала при удалении внутрь от внешней границы клетки

d φ = k_φ ln

C ( r ) - d C C ( r )

d C

— — к ---- ^фс (r )

^- kv

d C ( r ) / d r

C (r)

d r

(здесь d C> 0).

Это же соотношение следует непосредственно из определения химического потенциала:

RT d ф=nF d Pn C (r)]=кф

5 C ( r ) / 5 r ^C ( r )

d r

(здесь d C< 0).

При экспоненциальном законе убывания концентрации интегрирование выражения (4)

Ф ( ^r )                    r

J ^d ф= ^{- к} ф J ^φ s                ^a

aC m exp [- a ( a - r ) ] ^C m exP [^{- a} ( a - r ) ]

d r

приводит к линейной зависимости вида

Ф ( r ) ⁼ Ф s ^+k ф ^a ( a - r ) ^.

Концентрационная зависимость C ( r ) и ход потенциала ф ( r ) в периферическом слое клетки, а также и линейная зависимость (5) иллюстрируются рис. 3.

Из этой зависимости, в частности, следует, что в общем случае потенциал может неограниченно

возрастать, что не соответствует физическому смыслу. Такое неограниченное возрастание потенциала имеет место в силу ограничения, содержащегося в исходном уравнении (1), т. е. неограниченного возрастания потенциала в случае, если одна из концентраций ( C_кⁱⁿ_л ) неограниченно убывает. Это обстоятельство уже отмечалось выше. Поскольку одновременно удовлетворяется уравнение Пуассона

V ² ф = — р ( r ) = - ^eC ( r ) ( e = 1.6^10 ^|9Кл), (6) ε ₀            ε ₀

которое дает при экспоненциально убывающей концентрации экспоненциально убывающий потенциал, мы будем считать, что асимптотическое поведение потенциала определяется именно уравнением (6). Интегрирование (6) в сферических координатах при условиях

V2Ф = |4 и C (r) = CmexP [-a (a - r)] dr приводит к соотношению

ф ( ^r ) = ---2 ^C m exP [^{- a} ( a ^- r ) ] ^{+ C} 1 ^{r + C} 2 •

ε 0 α

При выполнении условия a - r » l , т. е. в пределах клеточной периферии C ₁ = C ₂ = 0; другое

граничное условие, т. е. равенство φ = φ_s при r = a дает в результате уравнение

- εe φ_s =     C_m .

ε ₀ α ²

Таким образом, если известна величина поверхностного потенциала φ_s , то система уравнений

^Cm = ¹ αa ,

Cin 3    , кл

- εe

φ_s=   ₂ C_m

ε ₀ α

определяет оба параметра концентрационной зависимости α и C_m . Отметим, что именно поверхностный потенциал и поверхностный заряд определяют проводимость мембранных каналов, в том числе каналов, образованных грамицидином А [12].

Необходимые параметры концентрационной зависимости α и C_m получаются при совместном решении уравнений (7) и (3). Для этого необходимо задаться значением φ_s . Для оценочных расчетов можно воспользоваться значением электроки-нетического потенциала (ζ-потенциала) для границы раздела "жирная кислота—вода", равного ζ = - 120мВ [13]. Имеются основания считать [14], что граница раздела "вода—неполярный растворитель" может рассматриваться как модель границы раздела "вода—липидная мембрана" с диэлектрической проницаемостью в граничном слое, равной 2–3.

С другой стороны, можно использовать вычисленное выше значение трансмембранного потенциала Δ φ_м^кл = - 152.6мВ и считать его равным поверхностному потенциалу клетки φ_s . Значение относительной диэлектрической проницаемости ε оценим, исходя из величины удельной емкости бислоя 0.7 ÷ 1.0мкФ ⋅ см ^{- 2} [ 12 ] . Используя значения ε = 5, ε ₀ = 8.85 ⋅ 10 ^{- 12}Ф ⋅ м ^{- 1} , совместное решение (3) и (7) дает значения l = 1/ α ≅ 0.038 Å и C_m = 1.95 ⋅ 10² M (в молях на литр). Нетрудно подсчитать, что один адсорбированный катион занимает площадь, равную примерно 17 × 17 Å. Если принять среднюю площадь в расчете на одну молекулу липида равной 52 Ų, как это принято в модельных расчетах [15], то, следовательно, в поверхностной решетке один сорбирующийся катион располагается в окружении 5–6 полярных (карбоксильных) фрагментов липидов.

Вычисленная малая величина l представляет собой на самом деле результат усреднения по поверхности двойного электрического слоя, если считать, как это принято в адсорбционной модели Штерна, что максимальная реальная толщина слоя в месте контакта определяется размерами катионов ТФФ⁺ (4 Å). При этом эквивалентная толщина слоя, вычисленная как длина ребра кубического объема 17 × 17 × 0.038 Å, составляет 2.2 Å. Очевидно, что при столь малых значениях l весь процесс представляет собой однослойную (лэнг-мюровскую) адсорбцию с дополнениями модели Штерна. Таким образом, можно предположить, что связывание индикаторных катионов происходит в тонком (2–3 Å) поверхностном слое (слой Штерна), связанном с мембраной малоподвижной воды. Для такой воды характерен крайне низкий коэффициент самодиффузии (10 ^{- 7}см² ⋅ с ^{- 1} по сравнению со значением 10^–5 см²·с^–1 для свободной воды [15]), что и способствует стабилизации двойного слоя.

Отмеченную выше специфическую функцию ТФФ+ как блокатора кальциевого обмена

Са2+/ 2Na+ [2], препятствующего выходу кальция из митохондрий, по-видимому, можно рассматривать как дополнительное свидетельство в пользу сорбционного механизма связывания.

Величина концентрации C_m , соответствующая тому же количеству поглощенного материала, что и вычисленное исходя из значения внутриклеточной концентрации C_кⁱⁿ_л , стала несоизмеримо больше. Соответственно отношение обеих концентраций определяется теперь отношением объема цитоплазмы и объема плотного тонкого адсорбированного слоя индикаторных катионов.

Если теперь вернуться к (1) и подставить вместо C_кⁱⁿ_л = 2.22мМ значение C_m = 1.95 ⋅ 10² M , получим Δ φ_м^кл = φ_s = - 445.2мВ . Затем из (7) совместно с (3) снова находим l = 0.1104 Å, C_m = 67M, φ_s = - 417.8мВ и так далее. Конец итераций (пять шагов) соответствует с высокой точностью значениям     C_m = 71.6 M, l = 0.104 Å,

φs = -419.2мВ . При этом эквивалентная толщина адсорбированного слоя, вычисленная тем же способом, как и выше, составит 3.1 Å. Это значение достаточно близко к размеру сорбирующихся ионов. Если считать, возвращаясь к действию грамицидина (рис. 2), что часть сорбированных катионов, определяемая изменением электродного потенциала Δφd , поглощается мембраной и располагается в порах и на ее внутренней поверхности, то можно определить изменение трансмембранного потенциала, определяющего деполяризующее мембрану воздействие грамицидина.

Для наглядности представим изменение электродного потенциала в виде суммы А ф э = ( А ф э -A ф d ) + A ф_d , где первое слагаемое, измеряемое непосредственно, и второе принципиально неизмеримое слагаемое определяют доли исходной концентрации C_э^out катионов, возвращающихся благодаря десорбции в инкубационную среду и поглощенных мембраной. Обозначим эти доли соответственно, как 1 - x и x , так что С э“‘ = ( 1 — x ) C u +хС э“‘ , где первое и второе слагаемые в правой части равенства представляют собой концентрации, установившиеся после окончания переходного процесса. Для рассматриваемого конкретного случая (рис. 2) А ф э - А ф_d = = 0.88мВ = к_ф ln [ C f / C⁰₃^ut ( 1 - x ) ] = к_ф ln [ 1 / ( 1 - x ) ] , откуда следует значение x = 0.0337 . Деполяризующая мембрану разность потенциалов определяется соответственно выражением    А ф деп =

= к ф ln [ xC? / ( 1 - x ) C u ] = к ф ln [ x / ( 1 - x ) ] = = –86.24 мВ. Знак (минус) соответствует внутренней поверхности мембраны. При этом предполагается, что вдоль мембранного канала сохраняется постоянство электрохимического потенциала поглощенных катионов.

Вычислим теперь поверхностную плотность адсорбированного заряда. Для конечного значения концентрации C_m = 71.6M в адсорбированном слое индикаторных катионов ТФФ⁺ получим значение площади в расчете на один катион, равное примерно 15 × 15Å. Следовательно, поверхностная плотность адсорбированного электрического заряда равна a = 0.07 Кл • м ^{- 2}. Максимальная плотность отрицательного поверхностного заряда для бислоя на основе фосфатидилсерина (PS), определяющая число центров связывания для одновалентных ионов, оценивается [16] величиной a max = 0.23Кл • м ^{- 2}. Таким образом, в рассматриваемом расчетном примере только около одной трети центров связывания на поверхности бислоя заняты адсорбированными ионами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

Полученное расчетным путем значение поверхностного потенциала соответствует, по всей вероятности, дипольному потенциалу. Происхождение дипольного потенциала связано с ориентацией дипольных моментов полярных групп липидов и гидроксилов ассоциированных с ними моле- кул воды. Дипольный потенциал возрастает от внешней границы клетки в направлении неполярного углеводородного ядра мембраны. Экспериментально измерены [17] значения дипольного потенциала для границы "мономолекулярная пленка фосфатидилхолин—вода", равного 400 мВ, и потенциала для границы липидного бислоя в воде, равного 280 мВ. Таким образом, именно дипольный потенциал определяет высоту 400 мВ потенциального барьера, препятствующего проникновению катионов ТФФ+ в мембрану. Это значение достаточно близко соответствует оценке примерно 360 мВ, найденной Френкелем для поверхностного потенциала микронных водных капель. Для расчета этого потенциала использовалось соотношение φs = ndδpr /ε0 (nd,δ, pr — соответственно объемная концентрация диполей, толщина двойного слоя и проекция дипольного момента на радиальное направление сферической частицы) [18]. Общая оценка дипольного потенциала лежит еще выше, т. е. в пределах от 400 до 700 мВ [17].

Дипольный потенциал не может быть измерен непосредственно, но его изменения при адсорбции индикаторных катионов определяются измеримыми электрокинетическим и поверхностным потенциалами, зависящими, в свою очередь, от величины трансмембранного потенциала.

Таким образом, основные выводы статьи сводятся к следующим положениям:

• 1)    измеряемый с помощью ТФФ⁺-селективного электрода потенциал соответствует, по всей вероятности, значению периферического дипольного потенциала;

• 2)    предположение об адсорбционном характере связывания индикаторных катионов с мембраной позволяет вычислить сначала долю поглощенных катионов, определяющую изменение мембранного потенциала клеток, а затем и само изменение мембранного потенциала при действии деэнерги-зующих агентов, в частности, порообразующего токсина грамицидина А.