Поведение роста фитопатогена Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, обработанный селеновыми биокомпозитами грибного происхождения

Инфекции картофеля ( Solanum tuberosum ), одной из важнейших пищевых культур мирового значения, приводят к потерям, достигающим 65 млн. тонн (16 млрд долларов) ежегодно (Shabuer et al ., 2015). Широко распространенное заболевание кольцевая гниль картофеля вызывается грамположительной бактерией - Clavibacter michiganensis ssp . sepedonicus ( Сms ). Эффективные методы регуляции численности этого фитопатогена отсутствуют, а все имеющиеся способы являются профилактическими и сводятся к обеззараживанию тары, инвентаря и посадочного материала агрессивными агентами (раствор формальдегида, пероксид водорода, соляная кислота и др.) (Secor et al ., 1988). Представляется перспективным связать разработку эффективных и безопасных способов оздоровления картофеля от Cms с применением препаратов на основе природных соединений.

В настоящее время природные полимеры широко используются для получения новых композитных материалов разнообразного назначения, имея минимальные экологические последствия (Волкова, 2015). Базидиальные культивируемые грибы рассматриваются как перспективное экологически чистое сырье для создания разнообразных препаратов широкого спектра действия. Внимание исследователей привлекают олиго- и полисахариды грибного происхождения благодаря их доступности, биосовместимости, доказанной биологической активности, в том числе антибактериальным свойствам. Особый интерес представляют гибридные органо-неорганические биокомпозиты потенциально антимикробного элементного селена (Khiralla and El-Deeb, 2015), получаемые на основе внеклеточных метаболитов лекарственных базидиомицетов (Tsymbal et al., 2015).

В настоящей работе мы исследовали антибактериальную активность гибридных органонеорганических биокомпозитов селена в отношении кольцевой гнили картофеля.

MATERIALS AND METHODS

Использовали штамм Ac 1405 возбудителя кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus , Cms (получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов, г. Пущино, Московская обл.). Бактериальную культуру выращивали в темноте при 26°С на качалке (80 об./мин) в колбах, содержащих жидкую питательную среду YPGA, содержащую: пептон («Биотехновация», Россия) – 10 г/л, дрожжевой гидролизат («Sigma», США) – 5 г/л, СаСО 3 («Реахим», Россия) - 5 г/л, глюкозу («Реахим», Россия) – 5 г/л, рН 7.2. В настоящей работе были использованы три методики: метод диффузии в агар (анализ размеров зон ингибирования), определение плотности бактериальной суспензии и высевы для определения КОЕ. Выбор методик обоснован возможностью выявления с их помощью бактериостатического и бактерицидного эффекта исследуемых агентов.

Для исследования эффекта биокомпозитов на бактерии по методу диффузии в агар (Sagdic et al .,

2006) в агаризованной среде YPGA стерильным пробойником (диаметр 6 мм) были сделаны лунки, в которые вносили 150 мкл биокомпозита, затем на среду наносилась бактериальная суспензия Cms . Спустя 4 суток инкубации влияние биокомпозитов определяли по наличию и величине зоны ингибирования вокруг лунки.

Исследование влияния биокомпозитов на плотность бактериальной суспензии проводили путем измерения оптического поглощения бактериальной суспензии после добавления нанокомпозитов. Оптическую плотность (OD) бактериальной суспензии измеряли через 0, 2, 6, 24, 32 и 50 ч с момента посева Cms и внесения биокомпозитов (в количестве 1 мл на 20 мл среды). Оптическую плотность фиксировали при 595 нM на планшетном спектрофотометре фирмы BIO-RAD model 680 (США).

Наличие бактерицидного эффекта у исследуемых агентов выявляли с помощью высевов бактериальной суспензии, инкубируемой сутки с биокомпозитом, на агаризованную среду. Подсчет колоний производили спустя 4 суток инкубации.

Полученные результаты были статистически обработаны с использованием пакета программ Excel.

RESULTS AND DISCUSSION

В связи с сохраняющейся необходимостью поиска новых антимикробных препаратов синтетические селеноорганические соединения (Chan et al., 2007; Pietka-Ottlik et al., 2008; Rusetskaya and Borodulin, 2013) и биологически активный красный селен являются перспективными объектами исследования. Скрининг биопродуцентов более активных и менее токсичных антибактериальных субстанций продолжается, в том числе среди ксилотрофных базидиомицетов, которые являются одними из наиболее биотехнологически ценных высших грибов съедобных и/или лекарственных видов, источников антимикробных соединений (De S. Pereira et al., 2013). Актуальны разработки методологий извлечения и характеризации таких субстанций грибного происхождения.

Нами установлено, что образцы мицелиальной суспензии на основе Ganoderma applanatum с элементным красным селеном, полученным биовосстановлением из нетоксичной селенорганической формы с помощью метаболитов гриба, проявляли бактерицидный эффект в отношении Staphylococcus aureus (Tsivileva et al ., 2015). Указанная активность в тех же экспериментальных условиях у мицелиальных образцов, выращенных без добавок соединения-источника селена, как и у самих добавок, отсутствовала. В настоящей работе нами изучена антибактериальная активность Se-содержащих биокомпозитов, полученных на основе культур грибов родов Ganoderma , Grifola , Laetiporus , Lentinula , Pleurotus , в отношении возбудителя кольцевой гнили картофеля.

При добавлении Se-биополимерных композиций в питательные среды Cms наблюдали ухудшение роста бактерий (рис. 1).

Установлено определяющее влияние селенового компонента биополимерных композитов на изучаемую биологическую активность. Условия образования полимерных компонентов Se-содержащих и Se-несодержащих грибных субстанций унифицированы по физикохимическим параметрам культивирования; предшествующего процедуре выделения композитов. Использовали посевной глубинный мицелий одной исходной культуры каждого штамма. При этом Se-композиты, в сравнении с биополимерными субстанциями, полученными из того же гриба, обладали несравненно более выраженным антибактериальным эффектом (рис. 1).

Обнаружена зависимость антимикробного действия селенсодержащих опытных образцов от биологического вида гриба, глубинную культуру которого использовали для получения этих образцов. Максимальной активностью обладали биокомпозиты на основе внеклеточных метаболитов Lentinula edodes, Ganoderma lucidum. Следует отметить очень умеренную способность угнетения роста тест-микроорганизма, выявленную при использовании биокомпозита на основе Laetiporus sulphureus (НК5). Трутовик серножелтый - гриб бурой гнили, в отличие от остальных макробазидиомицетов - грибов белой гнили, вовлеченных в наш эксперимент. Вполне возможно, что принадлежность к данной экологической подгруппе ксилотрофов и связанные с этим биохимические особенности L. sulphureus проявляются в аспекте противомикробного действия в отношении Cms.

Для сравнительной оценки антимикробной активности полимерных композиций грибного происхождения нами был использован метод диффузии в агар (способ цилиндрических лунок, «колодцев») по отношению к Cms как тест-культуре. Оценку результатов проводили по радиусу зон задержки роста Cms вокруг лунки, не учитывая диаметр самого цилиндра. Ширину зон ингибирования измеряли с помощью миллиметровой бумаги. В некоторых опытах зоны угнетения имели овальную форму, - в таких случаях измеряли наибольший и наименьший радиусы зоны и вычисляли среднюю величину, которая и принималась за показатель.

Результаты исследования методом диффузии в агар представлены на рис. 2.

Определение чувствительности фитопатогена к биокомпозитам также проводили, используя метод измерения оптического поглощения бактериальных суспензий. Полученные данные отражены на рис. 3.

Из представленных данных видно, что композиты на основе биополимеров грибов различаются по степени выраженности бактерицидного действия в отношении кольцевой гнили картофеля, прежде всего в зависимости от уровня селена в составе композита. Ясно, что само по себе увеличение массовой доли Se не приводит у усилению эффекта. Биокомпозит на основе Grifola umbellata (НК2) характеризуется максимальным уровнем Se, но не максимальной в эксперименте способностью подавлять Cms Несколько меньшее по сравнению с НК2 относительное содержание Se имеет место в композитах на основе Pleurotus ostreatus (НК3),

(НК5). Однако при равных величинах массовой доли Se в композитах НК3, НК4 и НК5 антимикробная активность выше в НК4, что связано, по-видимому, с особенностями внеклеточных метаболитов гриба шиитаке ( L.

Lentinula edodes (НК4), Laetiporus sulphureus edodes) (рис. 2).

Figure 1. Рост Cms на агаризованных средах в присутствии нанокомпозитов селена

Figure 2. Влияние нанокомпозитов селена на Cms (метод диффузии в агар).

По оси абсцисс - условные обозначения композитов, по оси ординат - ширина зоны ингибирования, мм

Figure 3. Влияние нанокомпозитов селена на Cms (метод плотности суспензии).

По оси абсцисс - время инкубации, ч; по оси ординат - оптическое поглощение, λ 595

Получение биополимерных тестируемых субстанций К1, К2 при исключении прекурсора селена из питательных сред базидиомицетов приводит к резко сниженной способности подавлять Cms (рис. 2, 3). При этом особенности культуры Ganoderma lucidum , использованной при изготовлении и К2, и НК1, по-видимому, благоприятствуют обсуждаемой биологической активности грибных изолятов в отношении Cms таким образом, что даже при минимальном в условиях нашего эксперимента относительном уровне селена в своем составе композит НК1 занимает промежуточное положение в аспекте проявления антибактериального действия (рис. 2). CONCLUSIONS

Представленные результаты можно рассматривать как первую информацию о биологической активности нанобиокомпозитов элементного селена на основе полимерных матриц внеклеточных метаболитов глубинных культур высших грибов. Выявлена бактериостатическая и бактерицидная активность исследованных субстанций в отношении фитопатогена Cms. Показаны видоспецифические особенности проявления антибактериального эффекта селеновых биокомпозитов, полученных на основе культур разных родов и видов грибов. Изученные виды макробазидиомицетов могут служить перспективным источником антибактериальных агентов в отношении кольцевой гнили картофеля, в связи с чем мы продолжаем исследования с целью оптимизации условий культивирования продуцентов, процедур изготовления биокомпозитов, приемов их применения.

ACKNOWLEDGMENT

Исследование выполнено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 15-34-51309_мол-нр).