Повторяющиеся измерения физиологического рН имплантируемыми оптическими датчиками в мышцах взрослого Danio rerio: предварительные результаты

Измерение физиологических параметров живого организма с помощью имплантируемых оптических сенсоров является перспективным направлением развития современной медицинской и экологической физиологии. Одной из многообещающих технологий для измерения химических и физических параметров водных сред являются разнообразные молекулярные сенсоры, чей спектр флуоресценции чувствителен к определённым параметрам среды (Johnson & Spence, 2010). Сами по себе данные сенсоры удобны для измерения физико-химических условий внутри живых клеток, однако малоприменимы на сравнительно крупных многоклеточных организмах из-за растворения во всём объёме внутренних сред. Кроме того, флуоресцентные сенсоры и комбинации различных сенсоров могут быть токсичны для организма. По этой причине, перспективным способом их применения является инкапсуляция в полупроницаемые оболочки (Gurkov et al. , 2016). Флуоресцентные сенсоры, заключённые в полупроницаемые микрокапсулы, остаются чувствительны к физиологическим параметрам организма, но в то же время локализованы в определённой области и не оказывают прямого токсического эффекта на живой организм.

Рыбы являются не только важным компонентом большинства водных экосистем, но и объектами аквакультуры и промысла. Разработка методики определения физиологического статуса представителей различных видов рыб с помощью имплантируемых оптических сенсоров представляет интерес как для фундаментальной экофизиологии, так и для таких прикладных областей как экологический мониторинг водоёмов и разведение рыб в аквакультуре. Целью данной работы было изучение возможности динамического мониторинга pH in vivo с использованием инкпсулированных флуоресцентных сенсоров в мышцах рыб Danio rerio — широко используемого лабораторного модельного объекта.

MATERIALS AND METHODS

Подготовка инкапсулированных pH-сенсоров

Чувствительные к pH инкапсулированные сенсоры на основе флуоресцентного красителя SNARF-1 подготавливали методом наслоения противоположно заряженных полимеров (Gurkov et al. , 2016; Kreft et al. , 2007). Вначале получали пористые ядра карбоната кальция, смешивая 1 М раствор Na 2 CO 3 и 1 М раствор CaCl 2 с раствором 2,5 мг/мл SNARF-1, ковалентно сшитого с декстраном (SNARF-1-D; D-3304, Invitrogen), в соотношении 1 : 1 : 3. Через 7 с перемешивания полученные ядра карбоната кальция, содержащие SNARF-1-D, троекратно отмывали в деионизированной воде.

Затем на ядра наносили слои положительно заряженного полимера полиаллиламин гидрохлорида (ПАГ; Aldrich, 2832315) и отрицательно заряженного полистиролсульфоната натрия (ПСН; Aldrich, 243051). Для этого ядра помещали в раствор соответствующего полимера с концентрацией 4 мг/мл (содержащий также 1 М NaCl) на 7 мин с ультразвуковыми импульсами в течение 1 мин для снижения агрегации ядер. Ядра трижды отмывали от раствора оставшегося полимера, после чего наслаивали второй полимер, и повторяли процедуру несколько раз. Для повышения биосовместимости сенсоров покрывали их дополнительным слоем cополимера поли-L-лизина и полиэтиленгликоля (ПЛЛ-ПЭГ; SZ34-67, SuSoS), экспонируя в растворе данного полимера с концентрацией 2 мг/мл в течение 10 часов (Sadovoy et al. , 2012). Наконец, ядра растворяли в 0,1 М растворе ЭДТА c pH 7.1, после чего получали полые микрокапсулы, соответствующие формуле SNARF-1-D/(ПАГ/ПСН) 5 / (ПЛЛ-ПЭГ). Поскольку SNARF-1 ковалентно связан с декстраном, он не может покинуть полость микрокапсулы.

Размер и концентрацию инкапсулированных сенсоров определяли под флуоресцентными микроскопом в камере Горяева. Средний размер полученных микрокапсул составлял 8,2±1,6 мкм.

Содержание рыб и инъекции инкапсулированных сенсоров

В качестве объекта данного исследования были выбраны взрослые особи Danio rerio, масса тела рыб составляла 0,32±0,08 г. Рыб содержали в 4-литровых пластиковых ёмкостях с водопроводной водой, предварительной очищенной коммерческим фильтром «Аквафор Топаз». Плотность посадки рыб составляла 1,25 шт/л, температура воды 20 °С, концентрация кислорода 7,5-8,2 мг/мл. Подмену 25 % воды осуществляли 1 раз в 2 дня. Кормление коммерческим кормом TetraWater Mini Mix (Tetra, Германия) проводили 1 раз в день.

Для обеззараживания наружных покровов, перед инъекцией рыб помещали в раствор метиленового синего (0,18 г/л) на 1 минуту. Затем рыб на 1 минуту переносили в эмульсию гвоздичного масла в воде (0,1 мкл/мл) для анестезии. Для инъекций инкапсулированных сенсоров использовали микроинъектор IM-9B (Narishige, Япония) с иглой диаметром 0,3 мм. Раствор микрокапсул объемом 0,8 мкл вводили внутримышечно на глубину около 0,5-1 мм в хвостовую часть спины. Концентрация вводимых сенсоров составляла порядка 104 микрокапсул на рыбу. Сразу после инъекции снимали спектральный сигнал от введённых флуоресцентных сенсоров. После измерения рыб возвращали в аквариум с постоянной аэрацией для восстановления. Для повторной регистрации флуоресцентного сигнала от инкапсулированных сенсров из мышц, рыб подвергали повторной анестезии по описанной схеме.

Калибровка инкапсулированных сенсоров и измерение pH in vivo

Икапсулированные сенсоры как в растворах, так и in vivo визуализировали в красном канале с помощью флуоресцентного микроскопа Микмед-2 (ЛОМО, Россия), спектральный сигнал получали с использованием спектрометра QE Pro (OceanOptics, USA), сопряжённого с микроскопом.

Для калибровки инкапсулированных pH-сенсоров их растворяли в наборе буферов в диапазоне pH 6,37,9 и помещали под микроскоп. Спектр флуоресценции инкапсулированного SNARF-1 регистрировали непосредственно после включения освещения для минимизации фоторазложения красителя. Для каждого спектра рассчитывали соотношение интенсивности флуоресценции между длинами волн 605 и 640 нм, после чего полученную зависимость между pH и I605/I640 аппроксимировали линейной регрессией (Рис. 1).

Измерение pH in vivo проводили аналогично, используя полученную калибровочную линию (Рис. 1) для определения pH по соотношению I 605 /I 640 . pH был измерен в шести биологических повторах непосредственно после инъекции сенсоров, а также через 3 и 20 ч. после инъекций. Статистическую значимость отличий между значениями pH в разные временные точки определяли с помощью критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони в пакете R (R Core Team, 2015).

RESULTS AND DISCUSSION

Непосредственно после инъекции инкапсулированных флуоресцентных сенсоров в мышцы D. rerio pH в месте инъекции находился в диапазоне 7,24-7,52 с медианой 7,38 (Рис. 2). Через три часа после инъекции сенсоров наблюдали статистически значимое (p = 0,024) повышение pH до 7,80-7,87. К концу наблюдения (через 20 ч.) в мышцах произошло статистически значимое (p = 0,048) закисление тканевой жидкости по сравнению со вторым измерением: зафиксированный pH оказался в диапазоне 7,40-7,67 с медианой 7,65. Несмотря на то, что статистически значимых отличий между показаниями сенсоров сразу после инъекции и через 20 ч. после инъекции не обнаружено (p = 0,191), медианный pH через 20 ч. оказался выше, чем непосредственно после инъекции (7,65 и 7,38 соответственно).

одновременно с временным нарушением кровообращения (Woo et al., 2004). Повышение pH тканевой жидкости через 3 ч. после инъекции может быть связано с процессами заживления, важным высокой активности различных протеаз, оптимально функционирующих при высоких значениях рН (Schneider et al., 2007). К 20 ч. наблюдения основная часть процессов заживления, вероятно, завершается, и pH возвращается к физиологической элементом

которых является деградация

норме.

разрушенных клеточных компонентов за счёт

1.0

pH =-2.791*(1б05/1б40) + 8.637

0.8 -

R2 = 0.996

о

ID

-- 0.6

m о

<0

0.4

0.2

pH

• Figure 1.    Калибровочная линия использованных pH-чувствительных инкапсулированных сенсоров (представлены средние ± стандартные отклонения).

8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2

0 ч. после инъекции

3 ч. после инъекции

20 ч. после инъекции

• Figure 2.    Мониторинг pH in vivo с помощью инкапсулированных сенсоров в мышцах D. rerio сразу после инъекции, через 3 ч. и 20 ч. после инъекции. Отсутствуют статистически значимые отличия между выборками, имеющими в подписи одну букву при p < 0,05.

Полученные данные формируют основу для разработки комплексной методики долговременного мониторинга физиологических показателей в мышечной ткани взрослых рыб, которая может быть использована не только на D. rerio , но и на других видах.

ACKNOWLEDGEMENTS

Работа проведена при финансовой поддержке гранта РНФ (№ 15-14-10008).