ПОВЫШЕНИЕ ДОСТОВЕРНОСТИ МЕТОДА ПЛАВЛЕНИЯ ДНК ПУТЕМ ПРОВЕДЕНИЯ ПОВТОРНЫХ АНАЛИЗОВ

Современный метод плавления ДНК выполняется после полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) на детектирующих амплификаторах, при этом для генерации флуоресцентного сигнала используются интеркали-рующие красители, молекулы которых присоединяются к двойной цепи ДНК. При повышении температуры двойная цепь ДНК постепенно распадается на две одноцепочечные молекулы, вызывая отсоединение молекул красителя и спад интенсивности флуоресценции [1].

Графики плавления ДНК (ГП) представляют собой зависимости флуоресцентного отклика пробы от температуры и отличаются друг от друга формой и значением температуры плавления T m , что позволяет определять различия во фрагментах ДНК по их составу, длине и статусу метилирования и применять метод во множестве прикладных задач, таких как геномное сканирование, генотипирование, сопоставление последовательностей и эпигенетические исследования [2].

Значение Tm соответствует температуре, при которой 50% нуклеотидов в молекулах ДНК теряют водородные связи [3], и традиционно определяется как координата точки перегиба ГП, что соответствует значению максимума отрицательной производной ГП по температуре [4]. В ряде задач требуется высокая точность определения температуры Tm, например, для достоверного генотипиро- вания штаммов M. tuberculosis необходимо выявлять различия в значениях Tm менее 0.1 град. [5].

С целью уменьшения погрешности измерения температуры T m применяются известные методики, основанные на фильтрации и/или аппроксимации ГП различными непрерывными функциями, например полиномом третьей степени в ограниченном диапазоне изменения температуры, как в программе ANK_Melting [6], или усовершенствованной сигмоидальной функцией (СФ) [7]. В статьях [8–10] рекомендуется после предварительной нормализации выполнять численное дифференцирование графиков плавления с помощью полиномов Савицкого – Голея второй степени в каждой точке [11].

Метод плавления ДНК является неразрушающим, поэтому одним из дополнительных способов повышения достоверности результатов анализа может быть повторение экспериментов для накопления статистики. В настоящей статье рассматривается возможность применения такого подхода.

ПОЛУЧЕНИЕ И ОБРАБОТКА ИСХОДНЫХ ДАННЫХ

Для получения исходных данных выполнен трехкратный анализ методом плавления ДНК трех известных образцов ампликонов цитокератина (CK-19) на анализаторе нуклеиновых кислот АНК-32, который серийно выпускается в Институте аналитического приборостроения РАН (Россия). Ампликоны были получены в результате 50 циклов ПЦР-РВ с интеркалирующим красителем SYBR Green I ("ПЦР-Микс" М-427, ООО "Синтол", Россия) и специально разработанными праймерами (ООО "ДНК-Синтез", Россия). Образцы 1, 2 и 3 в четырех пробирках каждый анализирова- лись в диапазоне температур 70–95 °C с шагом 0.5 град. и длительностью выдержки на каждом шаге 30 с. Образцы 1, 2 и 3 имеют соответственно содержание нуклеотидов гуанина и цитозина во фрагменте ДНК [G + C], равное 53, 59 и 58% при длине фрагментов Lp, равной 103, 209 и 309 пар нуклеотидов (п. н.). Начальная концентрация ионов натрия во всех пробах равна 0.125 моль/л.

Табл. 1. Значения температур плавления анализируемых образцов (°C)

№ эксперимента	№ образца
	1	2	3
1	84.37 ± 0.04	90.55 ± 0.10	90.72 ± 0.08
2	84.53 ± 0.05	90.68 ± 0.09	90.85 ± 0.06
3	84.65 ± 0.09	90.83 ± 0.12	90.98 ± 0.06

Примечание . Уровень значимости 0.05, объем выборки 4

Рис. Графики плавления образца 1 по результатам первого (I), второго (II) и третьего (III) анализов

Значения температур плавления образцов были определены путем применения методики на основе СФ [7]. В табл. 1 приведены средние значения температур плавления трех образцов в трех последовательных анализах.

На рисунке изображены графики плавления от одной пробирки с образцом 1, полученные в результате трех последовательных анализов после нормализации модельной функцией СФ. Графики позволяют наглядно сравнить различия значений T m , соответствующих температуре, при которой интенсивность флуоресценции равна 0.5. Видно, что при каждом следующем анализе значение T_m увеличивается.

На основе вычисленных значений парного t-критерия Стьюдента выявлено статически значимое различие между результатами последовательных экспериментов с уровнем значимости р < 0.05. Эти различия не позволяют использовать повторные анализы методом плавления ДНК для увеличения их достоверности. Актуальным является определение причин изменения значений T m образцов при повторных анализах.

ПРИЧИНЫ ИЗМЕНЕНИЯ ТЕМПЕРАТУР ПЛАВЛЕНИЯ ОБРАЗЦОВ ПРИ ПОВТОРНЫХ АНАЛИЗАХ

В соответствии с работой [12], значение T m определяется по формуле:

T m = 81.5 + 16.6 • lg[Na ⁺ ] +

+ 0.41 • [ G + C ] - 675 / L p ,     (1)

где [Na+] — концентрация ионов натрия, моль/л.

Слагаемое 16.6∙lg [Na+] включено и в другие известные модели [13, 14].

Изменение значений T m может быть обусловлено испарением воды из анализируемой пробы. Так как значения [ G + C ] и L p из формулы (1) остаются постоянными, изменение значений T_m сопровождается увеличением концентрации ионов натрия [Na⁺].

Сравнение существующих моделей для вычисления температуры плавления ДНК показало значительное расхождение результатов применения моделей с экспериментальными данными [15]. В статьях [16, 17] предложено применять модели, учитывающие зависимость температуры Tm только от факторов, величина которых изменяется в серии экспериментов. Авторы представили формулу (1) в виде упрощенной модели:

T m = T - "Л + 0.41 • [ G + C ]. (2) L_p

Здесь значение параметра Т 1 равно сумме 81.5 + 16.6∙lg([Na⁺]) .

В табл. 2 приведены вычисленные параметры T 1 и различия параметров T 1 , определенных при повторных анализах. В столбце d103 находятся: значение 0.08 — это разность параметров T 1 при втором и первом анализах образца 1, значение 0.11 этой разницы при третьем и втором анализах и значение 0.19 — при третьем и первом анализах. Аналогично определены изменения параметров T 1 в столбцах d209 и d309 для образцов 2 и 3 (d209 и d309 соответственно).

Изменения параметров T 1 для образцов 1, 2 и 3 после проведения трех анализов направлены в сторону увеличения Т 1 : 0.19; 0.27 и 0.26 град. соответственно. Среднее изменение температуры T m между последовательными анализами составило 0.12 град.

Начальная концентрация натрия во всех пробах равна 0.125 моль/л, что соответствует: 16.6∙lg[0.125] = T 1 – 81.5. Увеличение концентрации натрия на 2% вызывает увеличение параметра T m на 0.14 град. Следовательно, испарение воды в пробирке и увеличение концентрации натрия составляют примерно 2%.

Для проверки этого предположения проанализировано изменение массы заполненных дистиллированной водой тонкостенных пробирок на 0.2 мл (SSI, США) до и после нагрева. 32 пробирки (4 стрипа по 8 шт.) заполняли дистиллированной водой по 25 мкл, закрывали крышки и выдерживали в эксикаторе для удаления мелких капель воды с внешней поверхности пробирок. Нагрев проводили в АНК-32 по программе плавления от 70 °С до 95 °С с шагом 0.5 град. и продолжительностью 30 с на каждой температуре. Взвешивание до и после нагрева, а также до и после заполнения водой

Табл. 2. Различия параметров T ₁ при проведении повторных анализов (°С)

№ анализа	103	d103	209	d209	309	d309
1	69.09	0.08	69.83	0.12	69.15	0.13
2	69.20	0.11	69.95	0.16	69.28	0.13
3	69.28	0.19	70.11	0.27	69.41	0.26

(для определения суммарной массы воды) проводили на аналитических весах высшего I специального класса точности (ЗАО "САРТОГОСМ", Россия), дискретность измерений которых составляет d = 0.1 мг, предельно допустимая погрешность e = = 1 мг.

Эксперимент проводили на трех сериях образцов. Итоговое изменение массы 32 пробирок после нагрева составило 6.0 ± 0.5 мг (n = 3), что соответствовало 0.8 ± 0.1% от общей массы воды в пробирках.

Чтобы удостоверится, что полученный результат действительно связан с испарением воды через закрытую крышку пробирки, дополнительную серию из 32 пробирок заполнили водой с минеральным маслом (25 мкл воды и 15 мкл масла). Изменение массы таких пробирок после нагрева было сопоставимо с погрешностью весов и составило 0.5 мкл (0.06% от расчетной массы воды).

ОЦЕНКА ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ НАТРИЯ

В соответствии с формулой (1) при неизменных параметрах [ G + C ] и L p изменение температуры плавления образца определяется следующим образом:

A T m = 16.6 - lg( A [Na ⁺ ]),             (3)

где A [Na⁺ ] — изменение концентрации ионов натрия в пробе.

Отсюда:

A T m

A [Na ⁺ ] = (10 16.6 - 1) - 100%.         (4)

Долю испарившейся воды A VH2O оценить по следующей формуле:

V

A V _H2o = (1-- H^ ) - 100%.

2 m

10 16.6

можно

С помощью формул (4) и (5) можно более точно оценить значения A [Na ⁺ ] и A V _HO , соответствующие среднему изменению температуры T m на 0.12 град. в проведенной серии экспериментов: A [Na ⁺ ] = 1.68%, A V H_zO = 1.65%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование повторных анализов методом плавления ДНК для увеличения их достоверности, а именно уменьшения погрешности температуры плавления ДНК Tm, затруднено вследствие изме- нения значений Tm с каждым повтором. Для успешного использования описанного подхода необходимо предотвратить процесс испарения воды из пробы, однако полностью исключить испарение является сложной задачей [18].

В проведенной серии экспериментов выявлено среднее увеличение значений T m на 0.12 град., что объясняется увеличением концентрации ионов натрия на 1.68% и уменьшением объема воды на 1.65%. Изменение массы 32 пробирок с водой в результате теплового режима, аналогичного анализу методом плавления, составило 0.8 ± 0.1% от общей массы воды в пробирках, что частично подтверждает предположение.

Выявление различий температур плавления образцов может использоваться для оценки количества испарившейся воды в емкостях, где оценка другими способами, как путем измерения массы пробы, затруднена или невозможна. Примером таких емкостей являются микрофлюидные чипы.

Работа выполнена в ИАП РАН в рамках государственного задания № 075-00761-22-00 Министерства науки и высшего образования РФ.