Повышение производительности цикла проектирование-создание-тестирование-обучение систем (DBTL) в синтетической биологии растений (обзор)

Селекция сельскохозяйственных видов создала множество высокоурожайных культур с улучшенными характеристиками — устойчивостью к болезням, засухоустойчивостью и более высокой пищевой ценностью. Повышение уровня продовольственной безопасности и расширение мировых запасов продовольствия напрямую связаны с успехами селекции. В настоя-шее время селекционеры сталкиваются с новыми сложными задачами из-за усугубления глобальных проблем, к которм относятся изменения климата, распространение вредителей и болезней и снижение плодородия почв. Экстремальные погодные явления (засухи и наводнения) происходят чаще из-за изменения климата, что может снизить урожайность и продовольственную безопасность (1). Плодородие почвы снижается из-за неправильного ее использования и других факторов, а вредители и болезни становятся все более устойчивыми к используемым методам их контроля. Создание культур, которые могут переносить последствия климатических изменений, не повреждаться вредителями, быть устойчивыми к болезням и сохранять высокую продуктивность на истощенных почвах, должно стать основной целью селекционных программ. Для эффективного формирования новых генетических характеристик и ускорения селекционного процесса потребуются новые технологии, в частности геномика, геномное редактирование и прецизионная селекция (2-4). Это возможно благодаря междисциплинарным подходам, таким как синтетическая неология, интегрирующая современные достижения в разных областях в качественно новую систему исслеований. Она широко используется в ряде направлений, включая науку об окружающей среде, энергетику, сельское хозяйство и медицину.

Синтетическая биология — междисциплинарная научная область, которая объединяет идеи из биологии, инженерии и компьютерных наук для создания новых биологических систем с различными свойствами и изменения уже существующих (5, 6). Она подразумевает разработку искусственных биологических систем и их элементов, включая гены, ферменты и пути, которые могут использоваться для выполнения определенных биологических функций. Одна из основных целей синтетической биологии — проектирование и создание биологических систем с желаемыми характеристиками и возможностями, например производящих биотопливо, синтезирующих новые лекарства и материалы или увеличивающих производство сельскохозяйственной продукции (7). Для этого требуется изменение уже существующих биологических систем (примеры — микроорганизмы, продуцирующие инсулин, или растения, устойчивые к вредителям и болезням). Кроме того, системная биологии помогает лучше понимать функционирование биологических систем и лежащие в их основе процессы.

Возможности синтетической биологии растений широки. Модифицируя и конструируя геномы растений, ученые создают новые сорта и гибриды с желаемыми характеристиками (устойчивость к болезням и засухе, улучшенное усвоение питательных веществ) (8, 9). Эти методы также использовались для получения растений с повышенной эффективностью процессов фотосинтеза, что также может значительно увеличить урожайность и помочь справиться с вызовами, связанными с проблемами продовольственной безопасности. Создание из растительного сырья новых материалов, таких как биоразлагаемые полимеры, помогает бороться с загрязнением окружающей среды, та же задача решается при использовании растений, которые эффективно удаляют токсины из почвы или воды (10). Производство биоматериалов и возобновляемого биотоплива из растительного сырья уменьшает зависимость от ископаемого топлива и помогает смягчить последствия изменения климата. Для выполнения таких разработок прежде всего требуется получение необходимого объема знаний о структуре и функциональной активности геномов растений, накопление такой информации в базах данных и ее анализ с помощью вычислительных инструментов для углубленного понимания процессов, происходящих в растениях. Решение таких залач возможно благодаря подходу на основе DBTL (Design–Build–Test– Learn). DBTL — это циклический процесс, используемый при разработке новых, генетичеки измененных биологических систем для тестирования и изучения механизмов, действующих в живых организмах, с помощью компьютерного моделирования и симулятора (11-14). DBTL включает три этапа. На первом этапе (проектирование) синтетические биологи применяют компьютерное моделирование и инструменты для дизайна новой биологической системы, например синтетического гена или метаболического пути. Это включает определение необходимых компонентов (генов, промоторов и других регуляторных элементов) и проектирование их взаимодействий и поведения (15). Далее следует второй этап — сборки, когда спроектированные компоненты физически собираются и интегрируются в живой организм, например в клетки бактерий или дрожжей. Для осуществления этого этапа выполняется синтез генов, редактирование генома и введение спроектированного генетического материала в организм-хозяин с помощью методов трансформации (16). На третьем этапе (тестирование) созданная биологическая система оценивается на предмет ее производительности и функциональности. Это может включать измерение выходных данных системы, таких как продукция определенного белка или метаболита, и сравнение фактических показателей с прогнозируемыми на этапе проектирования

• (17) . На основе результатов тестирования конструкция может быть изменена, а цикл повторен для оптимизации производительности системы. Цикл DBTL в синтетической биологии позволяет исследователям быстро тестировать новые биологические системы и повторять их модификацию до тех пор, пока не будет достигнута желаемая функциональность.

DBTL помогает ускорить разработку новых биологических инструментов и систем для применений в различных областях — от биопроизводства до здравоохранения и экологии, тем не менее применение этого подхода связано с определенными ограничениями. Сложность биологических систем представляет собой одну из главных проблем. Синтетическая биология подразумевает проектирование, создание и тестирование систем, работающих в живых клетках и организмах, котрые невероятно сложны и динамичны. Это может привести к неожиданным результатам при тестировании. Разработка и тестирование биологических систем требуют точных и надежных технологий, что является еще одной трудностью. Синтез генов, редактирование генома и высокопроизводительный скрининг — это всего лишь несколько методов синтетической биологии, которые требуют как сложных инструментов, так и узкоспециализированных знаний, и то, и другое может быть дорогим и труднодоступным. Из-за большого объема «проб и ошибок» в цикле DBTL, итеративном по своей природе, его применение тоже может оказаться трудоемким и дорогим. Может потребоваться запустить цикл более одного раза, чтобы максимизировать производительность системы. Возможны сложности в управлении и координации. Наконец, создание и использование новых биологических систем может быть затруднено этическими ограничениями и вопросами безопасности, связанными с использованием генетически модифицированных организмов (ГМО) и синтетической биологии. Применение синтетической биологии может лимитироваться из-за нормативных ограничений и общественного недоверия.

Чтобы устранить препятствия, замедляющие цикл разработки, важно стандартизировать его элементы и протоколы, улучшить инструменты моделирования, имитации, автоматизации, поощрять сотрудничество и открытые принципы исследований, а также отдавать приоритет безопасности и этике. Улучшенные инструменты моделирования и имитации помогают точнее прогнозировать поведение биологических систем, сокращая время, необходимое для тестирования и обучения на каждой итерации. Повышение автоматизации сократит время, необходимое для создания и тестирования систем, а сотрудничество и открытые методы консолидируют силы исследователей для получения результата. Наконец, решение вопросов безопасности и этики предотвратит нанесение вреда исследователям или окружающей среде и гарантирует, что биологические системы производятся ответственно.

Цикл DBTL: последовательность действий. Цикл DBTL включает четыре итеративных шага: проектирование, сборка, тестирование и обучение. На этапе проектирования исследователи описывают спецификации биологической системы, определяют ее компоненты и решают, как они будут взаимодействовать для достижения желаемой цели. На этапе сборки выполняется физическое построение биологической системы. На этапе тестирования производительность системы проверяется для определения ее эффективности в выполнении желаемой функции. Наконец, на этапе обучения данные, полученные во время тестирования, изучаются для использования при корректировках в следующих итерациях цикла DBTL.

Проектирование: идентификация молекулы или пути. Это фундаментальный компонент цикла DBTL в биологической инженерии. Проектиро- вание включает в себя процесс создания биологических систем с учетом конкретной цели, например создание определенной молекулы или оптимизация метаболического пути. Это критический шаг, который обеспечивает целевой подход, повышает эффективность и предсказуемость и облегчает масштабируемость (18). Создавая биологическую систему с учетом конкретной цели, исследователи могут сократить число итераций, необходимых для получения предполагаемого результата, избежать ошибок и предсказать поведение системы на основе ее конструкции (15). В результате может снизиться вероятность непредвиденных событий, повысится общая производительность цикла DBTL. Интеграция этапа конструирования в цикл DBTL критически важна для повышения эффективности и успешности попыток проектирования биологических систем (19).

Сборка: этап разработки прототипа. На этом этапе происходит физическое построение биологической системы на основе дизайна ее конструкции. В цикле DBTL этот этап позволяет проверять и оптимизировать конструкцию для итерации цикла DBTL и масштабировать биологическую систему (20, 21). Физически создавая биологическую систему, исследователи должны убедиться, что она может соответствовать требованиям запланированного применения, протестировать и усовершенствовать систему для улучшения ее производительности и предложить физический прототип, который можно использовать для разработки крупномасштабных производственных процессов.

Тестирование: этап оценки и анализа . Третий шаг в цикле DBTL — это тестирование генно-инженерной биологической системы. Оценка производительности прототипа системы и анализ данных, собранных во время тестирования, дают информацию о будущих изменениях (22). Актуальность цикла DBTL заключается в возможности направлять процессинг биоинженерных систем в методическом аспекте, что позволяет постоянно улучшать производительность системы с течением времени. Применяя каждый из элементов цикла DBTL в своих исследованиях, синтетические биологи, создающие биологические системы для решения ряда социально значимых проблем, включая здравоохранение, энергетику и экологическую устойчивость, могут сделать свои изыскания более успешными.

Обучение: этап обратной связи и уточнения. На этом этапе исследователи изучают данные тестирования, чтобы получить информаацию о поведении биологической системы, что служит основой для корректировок в будущих итерациях (23). Ценность фазы обучения в цикле DBTL заключается в ее потенциале предоставления обратной связи для уточнения структуры и функций биологической системы. Изучая полученные данные, исследователи могут находить области для улучшения, оптимизировать эффективность системы и предлагать новые гипотезы для дальнейшего исследования. Информация, полученная на этапе обучения, может быть использована на этапах проектирования и сборки в цикле DBTL, что позволит создавать более эффективные и действенные биологические системы.

Расширение инструментария для повышения точности в цикле DBTL. Чтобы сократить время процедур в цикле DBTL, необходимо располагать соответствующими наборами данных и предиктивной информацией. Технологии предиктивного моделирования и имитации применимы на этапе проектирования. С помощью этих инструментов синтетические биологи могут лучше предсказывать поведение проектируемых биологических систем, что делает возможным создание более эффективных и действенных генетических конструкций. На этапе тестирования требуются высокопроизводительные методы скрининга, что позволяет синтетическим биологам анализировать огромное количество генетических конструкций за короткий период. Разработки в области автоматизации упростили создание и тестирование генетических конструкций, сократив время и работу, необходимые для завершения каждого цикла.

В общем виде представление о классическом наборе средств, применяемых при реализации цикла DBTL, и его современных усовершенствованных модификациях дает рисунок 1.

Classic method Advanced method

Рис. 1. Методы и средства, расширяющие возможности классического цикла DBTL (Design– Build–Test–Learn, проектирование–создание–тестирование–обучение). Компьютерное проектирование (Computer-Aided Design, CAD), проектирование и анализ последовательностей ДНК, РНК и аминокислот с помощью программного обеспечения Benching, проектирование биосинтетических путей с применением вычислительного инструмента RetroPath, использование CRISP технологий и синтетических генов при создании прототипов, масс-спектрометрии и микрофлюидики — на этапе тестирования, машинное обучение с привлечением различных баз данных.

Инструментарий . Изотопные трассеры широко применяются в цикле DBTL для измерения переноса атомов и молекул в биологических системах. Изотопные трассеры представляют собой атомы элемента с разной атомной массой (24, 25). С помощью изотопных трассеров исследователи могут отслеживать транспорт атомов и молекул по метаболическим путям и обнаруживать, какие пути активны и как они используются. Трассеры могут применяться для оптимизации производительности биологических систем посредством определения ключевых метаболических путей и ферментов как мишеней для оптимизации (17). Исследователи могут обнаруживать узкие места метаболизма и оптимизировать метаболический поток в циклах инжениринга, используя изотопные трассеры. Этот метод был применен для функциональной модификации микробиома (26) и ускорения биопроизводства (27).

Интеграция мультиомики с циклом DBTL объединяет данные из нескольких типов биологических образцов с итеративными инженерными циклами для оптимизации биологических систем (28-30). Интеграция с циклом DBTL позволяет выявить критические биологические пути и взаимодействия, которые можно модифицировать для улучшения производительности биологических систем. Объединяя данные нескольких типов, например геномики, транскриптомики, протеомики и метаболомики, исследователи могут находить возможные цели для проектирования и разрабатывать способы улучшения биологических систем (31). Вычислительные методы применялись при проектировании штаммов (32), для повышения продукции 3-гидроксипропионовой кислоты в Aspergillus pseudoterreus (33).

Машинное обучение помогает оптимизировать проектирование, автоматизировать тестирование, предсказать потребности в обслуживании и постоянно улучшать продукт благодаря автоматизации некоторых задач и анализа данных (15). Алгоритмы машинного обучения также могут оптимизировать проектирование продукта на основе критериев стоимости, эффективности и производительности. На основе информации от датчиков и других источников машинное обучение позволяет автоматизировать процесс тестирования. Более того, машинное обучение может анализировать данные этапов проектирования, разработки и тестирования, чтобы точно определить области, которые можно улучшить, гарантируя, что продукт будет постоянно развиваться и улучшаться в ответ на ввод пользователем уточняющих данных.

Жидкостная хроматография (ЖХ)—масс-спектроскопия в сочетании с циклом DBTL позволяют улучшить биологические системы (34). В ЖХ разделение и идентификация компонентов смеси на основе их химических и физических свойств осуществляется с использованием свойств жидкой подвижной фазы. Метод может применяться для выделения и идентификации метаболитов, их количественной оценки, определения изменений белков и анализа малых молекул с целью обнаружения потенциальных мишеней для оптимизации. Также сообщается об использовании этого метода при извлечении специализированных растительных метаболитов (35) и при метаболическом инжениринге у Streptomycetes (36).

Методы биоортогональной химии используют реакции, которые способны протекать внутри живых систем, не мешая естественным биохимическим процессам, так как участвующие в таких реакциях функциональные группы в живой клетке быстро и селективно реагируют друг с другом, но инертны по отношению к другим соединениям (37). В цикле DBTL этот подход эффективен при внесении изменений в биомолекулы и анализе их функции в биологических системах. С применением такого подхода при биологическом инжиниринге была повышена продукция липазы и эстеразы (38).

Микрофлюидика — это изучение и манипулирование жидкостями в микромасштабе, часто в каналах с размерами от десятков микрометров до нескольких миллиметров. Микрофлюидные устройства стали полезными инструментами для цикла DBTL, поскольку они предлагают различные преимущества по сравнению с традиционными методами (39). Также сообщалось об их автоматизации в синтетической биологии (40) и высокой пропускной способности (41).

Технология CRISPR обладает большим потенциалом для применения в DBTL. С помощью CRISPR можно проводить целевое редактирование генома, чтобы вводить определенные генетические модификации в организмы, что позволяет разрабатывать точные генетические схемы (20, 42). Более того, скрининг на основе CRISPR может использоваться для обнаружения и выделения благоприятных генетических вариаций, тем самым ускоряя процесс оптимизации в цикле DBTL. Технологии CRISPR также могут применяться для изучения функции генов и их сетей, способствуя общему пониманию биологических систем (25, 43).

Интеграция перечисленных методов существенно повысит эффективность циклов DBTL, позволяя точнее манипулировать биологическими системами, изучать их функционирование и повышать производительность, что в конечном итоге приведет к улучшению биологических систем.

Программное обеспечение. RetroPath и Selenzyme — два вычислительных инструмента, используемых в синтетической биологии и метаболической инженерии для проектирования и оптимизации метаболических путей в микробных клетках. RetroPath — вычислительный инструмент, который можно использовать для проектирования биосинтетических путей для 836

производства желаемого соединения. Он определяет потенциальные метаболические пути, которые могут производить целевое соединение, — от набора известных иходных компонентов до конечного продукта. RetroPath использует ретробиосинтетический подход, при котором целевое соединение разбивается на более мелкие молекулы, и определяются потенциальные биосинтетические пути, которые могут такие молекулы производить. Этот подход позволяет быстро и эффективно проектировать метаболические пути для производства широкого спектра соединений, включая натуральные продукты, фармацевтические препараты и биотопливо (44). Selenzyme роедтав-ляет собой вычислительный инструмент, который может быть использован при проектировании и оптимизации ферментных систем для производства сложных органических молекул. Принцип его работы основан на концепции направленной эволюции, когда мутации вводятся в последовательность гена белка для оптимизации его функции. Selenzyme использует комбинацию биоинформатики, молекулярного моделирования и методов машинного обучения для поиска мутаций, которые могут улучшить производительность ферментов в определенном метаболическом пути. Инструмент также может быть использован для выявления потенциальных новых ферментных систем для производства новых соединений (45).

PartsGenie был вычислительным программным инструментом при проектировании и оптимизации последовательностей ДНК для приложений синтетической биологии. Инструмент разработан, чтобы помочь исследователям эффективно создавать большие конструкции ДНК с помощью автоматизации многих трудоемких этапов, вовлеченных в процесс (46).

В недавно предложенном программном обеспечении SyncBio представлены современные платформы, включая Professional Synthesis Platform and High-throughput Synthesis Platform, что позволяет в случае сложных биосинтетических путей секвенировать гены, используя DBTL. SyncBio предлагает ряд инструментов и услуг для поддержки исследований в синтетической биологии, включая синтез ДНК, редактирование генов и экспрессию белков. Программное обеспечение также предоставляет доступ к базе данных генетических компонентов и биологических систем для проектирования и создания новых биологических систем (47).

Еще одно программное обеспечение — LOICA: Logical Operators for Integrated Cell Algorithms–Flapjack предназначено для запроса, построения и анализа генетической последовательности, что полезно для конструирования генетических схем и их контроллера (21, 48).

Цикл DBTL был полностью автоматизирован для проектирования биосистем с использованием интегрированной роботизированной системы и алгоритмов машинного обучения с роботизированной платформой BioAutomata (22). Это полностью автоматизированная роботизированная платформа, предназначенная для ускорения разработки биологических систем посредством автоматизации процесса DBTL. Платформа сочетает передовые технологии робототехники, синтетической биологии и машинного обучения, что позволяет проводить высокопроизводительные эксперименты и анализ данных. Она может применяться для автономного создания генетических конструкций, синтеза и сборки фрагментов ДНК, интегриции конструкции в организм хозяина и тестирования полученных биологических систем. Платформа использует методы машинного обучения для оптимизации проектирования генетических компонентов на основе данных предыдущих раундов. Автоматизируя процесс DBTL, можно значительно сократить время и усилия, необходимые для построения сложных биологических систем, что позволяет сосредоточиться на более новых и сложных элементах синтетической биологии.

Улучшенные конструкции. E. Orsi соавт. (49) протестировали DBTL для отбора синтетических модулей по ростовым парамерам с целью ускорения разработки клеточных биофабрик. Этот подход может успешно применяться, когда производство желаемого продукта или соединения напрямую связано с ростом и выживанием выбранного штамма микроорганизма. Результат достигается с помощью стратегии отбора модулей, благоприятствующих росту штаммов-продуцентов, но подавляющих рост не производящих целевой продукт штаммов. Если соответствующий метаболический путь удается сконструировать, то синтез целевого продукта становится необходимым для выживания штамма в определенной среде. Это создает селективные условия для роста штаммов, которые производят желаемый продукт, в то время как не производящие его штаммы элиминируются. Сочетание биопроизводительности и отбора по ростовым показателям имеет несколько преимуществ. Оно позволяет микробным штаммам, которые производят желаемый продукт, быстро и эффективно эволюционировать при этом минимизируя производство ненужных побочных продуктов. С помощью нового программного инструмента и автоматизированных лабораторных процедур для построения и тестирования метаболического пути был быстро создан прототип in vivo Escherichia coli для производства флавоноида (2S)-пиноцембрина (16).

Анализ методом Microflow targeted liquid chromatography-selected reaction monitoring (LC-SRM) эффективно идентифицировал целевые пептиды с соответствующими путями биосинтеза, ответственными за производство биотоплива в продуценте Pseudomonas putida . Метод помогает сократить время цикла DBTL (50). Мультиомный подход, используемый в цикле DBTL, объединяет несколько уровней омиксных данных (геномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика и т.д.) для ускорения создания, улучшения и оценки биологических систем (51). Этот метод применяется в синтетической биологии и метаболической инженерии для повышения выхода желаемых веществ и метаболитов при лучшем понимании поведения биологических систем. Автоматизация сборки и тестирования применялась для ускорения разработки штаммов в исследованиях по биотопливу (52). Метод позволяет совершенствовать процесс DBTL, предоставляя доступ к передовым технологиям и знаниям. Благодаря этому инструменту ускоряется итеративное тестирование генетических конструкций, что позволяет в короткие сроки проверить множество гипотез. Также могут быть стандартизированы и оптимизированы экспериментальные методы, что повысит воспроизводимость результатов при испытаниях. Технологии машинного обучения и анализа данных применимы для обработки и оценки больших объемов экспериментальных данных, помогая выявлять тенденции и более эффективно улучшать генетические конструкции.

Автоматизацию некоторых действий и предоставление информации на основе анализа данных в сочетании с машинным обучением можно использовать для ускорения процесса. Проведены исследования по включению машинного обучения в DBTL для повышения производительности (15).

Метод автоматизированных рекомендаций (Automated Recommendation Tool) с машинным обучением разработан для получения прогнозов о штамме, рекомендуемом для следующего цикла, и уровне его производительности (53). Программа использует алгоритмы машинного обучения для оценки больших массивов экспериментальных данных и генерации автоматических рекомендаций для генетических конструкций, которые должны 838

быть протестированы. Эти рекомендации основаны на применении DBTL, где производительность каждой генетической конструкции в системе последовательно проверяется. Инструмент может рекомендовать изменения в текущих генетических конструкциях или предлагать совершенно новые конструкции, позволяя синтетическим биологам более эффективно исследовать новое пространство дизайна. Интеграция инструмента автоматических рекомендаций с DBTL может ускорить создание сложных биологических систем за счет минимизации времени и усилий, необходимых для этапов проектирования и тестирования процесса.

С помощью DBTL разработаны экологически чистые фармацевтические продукты (54). Ключевой фермент, отвечающий за сбалансированное производство тетрагидропапаверолина, был идентифицирован с помощью предиктивного программного обеспечения M-path. Метод M-path основан на линейном программировании для поиска возможных комбинаций векторов характеристик реакций, которые в сумме дают желаемый вектор характеристик пути, необходимого для получения целевого продукта из исходного соединения. То есть на основании известных исходных соединений и метаболических путей их превращений и химических характеристик на каждом этапе собирается подмножество химических реакций, позволяющее получить заданное соединение в одном метаболическом цикле (55).

Детектирование ферментов имеет решающее значение во многих областях — в медицине, биотехнологии, при мониторинге состояния окружающей среды. Метод M-path объединяет приемы анализа изображений с алгоритмами машинного обучения и осуществляет поиск доменов, определяющих функциональную активность ферментов в биологических образцах. Более того, можно одновременно обнаруживать множество ферментов, несущих определенные функциональные домены, правильно и быстро оценивая большие массивы данных. Этим обусловлено практическое приенение такого подхода в высокопроизводительных скрининговых приложениях, где необходимо быстро исследовать большое число образцов.

Последние разработки в области редактирования генома микроорганизмов. Исследование штамма Corynebacterium glutamicum методом DBTL с целью получения продуцента шикимовой кислоты было успешно проведено с использованием комбинации вычислительных, генетических и биохимических манипуляций (56). Примененная технология включала поиск данных литературы, в которых упоминаются определенные гены или генетические модификации, а затем анализ совместной встречаемости этих генов в литературе с другими генами или генетическими модификациями. Это помогает выявить связи и закономерности, которые могут быть не сразу очевидны при простом изучении отдельных исследований. ИИ-анализ литературы имеет множество применений в различных областях, включая биомедицину, генетику и биоинформатику. Его можно использовать для обнаружения новых связей между генами и заболеваниями, определения потенциальных мишеней для лекарственных препаратов и нашего лучшего понимания биологических процессов.

Escherichia coli , генетически модифицированная для продукции de novo (2s) флаванонов, была получена с применением DBTL (57). Разработана и оптимизирована в DBTL генетическая схема для производства пиноцембрина в E. coli . Процедура включала проектирование схемы, ее построение с использованием последовательностей ДНК, оценку ее производительности и использование полученной информации для улучшения схемы. Выход пиноцембрина был увеличен в повторных циклах

DBTL. DBTL использовали для получения новых метаболитов у генетически модифицированных стрептомицетов (36). Процесс включал идентификацию биосинтетического пути, проектирование генетической схемы, ее построение с помощью клонирования последовательностей ДНК, тестирование функции схемы и изучение результатов для оптимизации схемы. Аналогичным образом промышленные клетки бактерий (так называемые «шасси» — более или менее улучшенный хозяин для генетических конструкций) для производства биохимикатов получали с использованием DBTL (23).

Сообщалось о DBTL в сочетании с машинным обучением (ML) для успешного производства додеканола генетически модифицированной E. coli (18). Додеканол — это жирный спирт, который можно использовать в производстве моющих средств, средств личной гигиены и биотоплива. ML использовался для определения оптимальных комбинаций генов, прогнозирования поведения организма и автоматизации процесса проектирования и тестирования. Благодаря сочетанию DBTL с ML ускорилась разработка системы с более высоким выходом додеканола в E. coli .

Полученный с помощью синтетической инженерии штамм дрожжей, который производит артемизининовую кислоту, имеет потенциал для реорганизации производства артемизинина и расширения доступа к этому спасительному лекарству (58-61). Важнейший предшественник в создании противомалярийного лекарства артемизинин — это артемизиновая кислота. Однако растение Artemisia annua производит лишь относительно небольшое количество артемизинина, что делает его промышленное производство дорогим и сложным. Продукция артемизиновой кислоты штаммом дрожжей, созданным с использованием синтетической биологии, дает многообещающее решение этой проблемы. Синтетическая биология может помочь в решении проблемы малярии, обеспечив производство артемизиновой кислоты в больших масштабах устойчивым и экономически эффективным способом. Этап проектирования включал выявление ферментов и регуляторных элементов, необходимых для преобразования глюкозы в артемизиновую кислоту, и оптимизацию пути биосинтеза для максимальной эффективности. На этапе сборки спроектированный путь физически собирается и интегрируется в геном дрожжей. Это может включать использование таких методов, как редактирование генома и синтез генов, для введения необходимых генов и регуляторных элементов в геном дрожжей. Цель состоит в том, чтобы создать стабильный и функциональный синтетический геном, который может производить желаемый продукт. На этапе тестирования сконструированный штамм дрожжей оценивается на предмет его способности производить желаемый продукт. Это может включать измерение выхода и чистоты продукта, производимого дрожжами, и оценку производительности дрожжей в различных условиях роста. Этот этап может быть итеративным, а этапы проектирования и сборки будут совершенствоваться на основе результатов тестирования.

В таблице представлены стратегии и методы современной генной инженерии микроорганизмов.

Передовые стратегии и инструменты, используемые в цикле DBTL (Design– Build–Test–Learn, проектирование–создание–тестирование–обучение) в генной инженерии микроорганизмов

Этап цикла ]   Стратегия           Цель         I Дополнительные инструменты ] Ссылка

Дизайн      Построение базы Высокая продукция гента- Библиотека мутантов с машинным (62)

данных        мицина                 обучением

Продолжение таблицы
	Мультиомика	Идентификация генов, от-  Создание библиотеки мутантов   (63) ветственных за фотосинтез у эукариот Синтез природных продук- Омиксные технологии с машин-  (64)
	Автоматизация	тов                     ным обучением Полная автоматизация     Искусственный интеллект с ма-   (22)
Дизайн–созда	-Основана на по-	цикла DBTL            шинным обучением Проектирование in silico           (65) Объединение биомодуля с  Система компьютерного проекти- (66)
ние	лучаемых данных	компьютерным проектиро- рования (Computer-Aided Design,
	Множественное	ванием                 CAD) Разработка фиолетового    Высокоэффективное наложение  (67)
	наложение генов	риса                     трансгенов с помощью векторов
	CRISPRa/i	Улучшение синтеза белков CRISPRi-KRAB c ASGARD      (68)
	Рибосвитч	и липидов Повышение производитель- CRISPR/Cas9                   (69) ности за счет замены промо тора Синтез большего количества Омиксные технологии, программа (70)
Дизайн–созда-Мультиомика		биотоплива               BioFoundry Производство n-капроата   Подход «сверху вниз»            (12)
ние–тестиро-вание	Автоматизация	Синтез автоматизированных Машинное обучение             (17)
	CRISPR/dCpf1	бактериальных фабрик Увеличение производства   Транскриптомика               (71)
	Симуляция	индигоидина Производство 3-гидрокси-  Протеомика и метаболомика     (33) пропионовой кислоты Автоматизация проектирова-Logical Operators for Integrated Cell (72)
Тестирова-	Клеточный ана-	ния с использованием дан- Algorithms (LOICA) ных Инженерия изопропиноид- Рамановская спектроскопия      (73)
ние–обучение	лиз	ного пути
	Метаболическая	Разработка сайта связыва-  Регрессия гауссовского процесса с (74) ния рибосом            машинным обучением Производство вакцин      Метаболическая инженерия      (75)
	модель Омиксные техно-	Модифицирование для про- Флаксомика                   (76)
	логия	изводства натурального про-
	MARL (Multi-	дукта Оптимизация дизайна      ИИ-обучение с подкреплением   (77)
	Agent Reinforcement Learning)

Современные возможности DBTL при манипуляциях с растительными клетками иллюстрирует рисунок 2.

Рис. 2. Изменение метаболических путей в растительных клетках в цикле DBTL (Design–Build–

Test–Learn, проектирование–создание–тестирование–обучение). На этапе проектирования с помощью омиксных технологий, анализа баз данных, машинного обучения разрабатываются метаболические пути, которые сравниваются при 3D моделировании. Осуществляется требуемое геномное редактирование (CRISP/Cas), сиквенс наборов синтетических генов и контроль продукции желаемого метаболита. Итоговое тестирование системы включает селекцию по эффективности клеточного роста и выявление целевого продукта с помощью изотопной метки.

Таким образом, обсуждая перспективы DBTL (Design–Build–Test– Learn, цикл проектирование–создание–тестирование–обучение), следует признать, что этот подход является сильной парадигмой для создания биологических систем в синтетической биологии и уже привел к нескольким заметным достижениям. Будущие перспективы применения DBTL обнадеживают. Существует значительный потенциал для дополнительных прорывов в проектировании, разработке и тестировании биологических систем с помощью цикла DBTL, особенно с учетом растущей доступности высокопроизводительных технологий, машинного обучения и аналитики больших данных. Подход на основе DBTL может трансформировать здравоохранение, возобновляемую энергетику, способствовать экологической устойчивости, позволяя проектировать и разрабатывать эффективные биологические системы. Продолжающееся развитие и совершенствование DBTL, безусловно, приведет к новым открытиям и достижениям в синтетической биологии.