Предиктивные маркеры ответа на блокаторы контрольных точек иммунного ответа

Внедрение ингибиторов контрольных точек иммунного ответа (CTLA4 и PD1/PD-L1) стало крупным достижением в терапии меланомы, рака легкого и некоторых других разновидностей опухолей. На данный момент к этой группе лекарственных средств относится семь препаратов, одобренных FDA (Food and Drug Administration, . Механизм действия данных препаратов основывается на реактивации собственного противоопухолевого иммунного ответа пациента за счет блокировки иммуносупрессорных молекул CTLA4, PD1 или PD-L1. Так как ингибиторы контрольных точек иммунного ответа демонстрируют высокую эффективность лишь у ограниченной доли пациентов, обладают широким спектром тяжелых побочных эффектов и отличаются высокой стоимостью, крайне актуальной становится разработка предиктивных маркеров ответа на иммунотерапию. В настоящее время в рутинной клинической практике используются два подобных биомаркера: уровень белковой экспрессии PD-L1 и статус микросателлитной нестабильности/нару-шения функции системы репарации неспаренных оснований ДНК (MSI-H/dMMR).

Экспрессия белков-мишеней

Иммуногистохимический анализ экспрессии PD-L1 был впервые применен для оценки статуса потенциального предиктивного биомаркера в одном из ранних клинических испытаний пем-бролизумаба [1]. Стратификация пациентов по уровню экспрессии PD-L1 позволила выделить группу PD-L1-негативных опухолей (<5 % опухолевых клеток, демонстрирующих мембранное окрашивание), в которой не наблюдалось ответа на лечение, и PD-L1-позитивных новообразований (≥5 % опухолевых клеток, демонстрирующих мембранное окрашивание), в которой частота объективных ответов составила 36 %. Следует отметить, что уровень PD-L1 может варьировать в широком диапазоне и при более высоких значениях экспрессии возрастает частота ответа на лечение. Так, в ходе клинического испытания пембролизу-маба у больных немелкоклеточным раком легкого, KEYNOTE-001, все случаи были разделены на группы по уровню экспрессии PD-L1. Больные с отсутствием экспрессии PD-L1 (<1 %) продемонстрировали 8 % объективных ответов, а при наличии экспрессии и делении опухолей на квартили по уровню PD-L1 ответ на лечение наблюдался у 13,

• 19, 30 и 45 % больных соответственно [2]. Таким образом, даже самый высокий уровень PD-L1 не гарантирует ответа на PD1/PD-L1 ингибиторы, а отсутствие экспрессии в некоторых случаях может сопровождаться выраженным клиническим эффектом.

Дополнительный уровень сложности в определении этого биомаркера возникает в связи с высокой пространственно-временной изменчивостью экспрессии PD-L1 в пределах одного и того же опухолевого очага, между биопсиями и послеоперационным материалом, между первичным очагом и метастазами, до и после терапевтических вмешательств [3, 4]. Наконец, на данный момент существует множество антител, с помощью которых оценивается уровень экспрессии PD-L1. Известно, что три из наиболее широко применяемых разновидностей антител (22C3, 28-8 и SP263) относительно схожи по своим техническим характеристикам, а SP142 систематически демонстрирует более низкую чувствительность в отношении экспрессии PD-L1 на опухолевых клетках. В некоторых опухолях основная доля экспрессии PD-L1 приходится на опухолевые клетки, в то время как в других новообразованиях PD-L1 в значительных количествах представлен на иммунных клетках и клетках стромы. В связи с этим для опухолей различных локализаций используются разные системы оценки экспрессии. Следует отметить, что оценка окрашивания иммунных клеток технически затруднительна и демонстрирует значительную вариабельность у различных специалистов. Применение разных антител и разных подходов к оценке уровня экспрессии имеет существенное влияние на определение статуса опухолей, демонстрирующих пограничные значения PD-L1 [4].

Благодаря применению in situ РНК-гибридизации и секвенированию транскриптома удалось показать, что экспрессии PD-L1 на уровне мРНК и белка хорошо коррелируют между собой [5], однако до настоящего времени попытки перейти к анализу экспрессии мРНК PD-L1 с помощью количественной ПЦР или иных методов генетического анализа были предприняты лишь немногочисленными исследовательскими группами. В целом оценки уровня PD-L1, определяемого при помощи ОТ-ПЦР и ИГХ-анализа, согласуются между собой и демонстрируют сходные клиникоморфологические ассоциации [6].

Так как экспрессия PD-L1 неспособна надежно предсказать результат применения ингибиторов PD1/PD-L1, ведется поиск иных предиктивных маркеров, специфичных для данной группы иммунопрепаратов. Прежде всего, к ним относится уровень экспрессии других молекул, имеющих непосредственное отношение к функционированию PD-L1: PD-L2 и PD1. В недавнем крупном ретроспективном исследовании было показано, что уровень экспрессии мРНК PD1 лучше коррелирует с ответом на PD1-ингибиторы, чем мРНК и белковая экспрессия PD-L1 [7]. Высокая экспрессия PD-L2 независимо от PD-L1 ассоциирована с ответом на лечение PD1/PD-L1 ингибиторами [8]. Если взаимодействие PD-L1 и PD1 происходит в пределах микроокружения опухоли, то связывание CTLA4 с B7, препятствующее «праймингу» наивных лимфоцитов, происходит в лимфоидных органах. Кроме того, патофизиологически значимая экспрессия CTLA4 на антиген-презентирующих клетках низка и непостоянна, а экспрессия B7, напротив, практически убиквитарна. Это крайне затрудняет изучение CTLA4 и B7 в качестве специфических маркеров ответа на ипилимумаб [9].

Показатели иммуногенности опухоли: мутационная нагрузка и количество неоантигенов

Несинонимичные соматические мутации служат потенциальным источником мутантных белков – неоантигенов, которые могут распознаваться T-клетками как чужеродные и активировать иммунный противоопухолевый ответ. Именно с этим фактом связана высокая чувствительность к терапии ингибиторами контрольных точек иммунного ответа меланомы, рака легкого, MSI-позитивного рака толстой кишки, а также карцином с наследственными и соматическими дефектами в генах POLE/POLD1 – разновидностей опухолей с максимальным количеством соматических мутаций [10, 11]. Предиктивная значимость мутационной нагрузки была впервые продемонстрирована для анти-CTLA4 терапии при меланоме в работах A. Snyder et al. и E.M. Van Allen et al. и для анти-PD1 антител при раке легкого в исследовании N.A. Rizvi et al. [12–14]. В первом исследовании в когорте из 64 больных, чьи опухоли были подвергнуты полноэкзомному секвенированию, мутационная нагрузка свыше 100 несинонимичных мутаций ассоциировалась с продолжительным (более 6 мес) ответом на лечение ингибиторами CTLA4 с увеличенной общей продолжительностью жизни. В похожей работе E.M. Van Allen et al. также была выявлена зависимость между количеством соматических мутаций и предсказанных неоантигенов (более 100) и ответом на ипилимумаб в группе из 110 случаев меланомы. Количество антигенных неоэпитопов, повторяющихся у хотя бы двух больных, ответивших на лечение, и при этом не присутствующих у больных без эффекта от терапии, составило всего 0,04 % от всех обнаруженных неоантигенов. На примере анализа данных полноэкзомного секвенирования у больных раком лёгкого и меланомой была показана значимость ещё одного параметра – степени внутриопухолевой гетерогенности неоантигенов – для формирования ответа на ингибиторы контрольных точек иммунного ответа [15]. Оказалось, что в случаях хорошего ответа на терапию преобладают клональные

(т.е. присутствующие во всех клетках опухоли) неоантигены, а доля «гетерогенных» антигенов не превышает 1–5 %.

В настоящее время оценка мутационной нагрузки опухоли совершенствуется в двух основных направлениях. Очевидно, что проведение полноэкзомного секвенирования каждой опухоли в ближайшее время останется недостижимым по экономическим причинам. Поэтому ведутся активные работы над созданием панелей для таргетного секвенирования, захватывающих сравнительно небольшие, но репрезентативные в отношении мутационной нагрузки участки генома (обычно порядка 1,5–3 млн п.н.) [16].

Очень важное направление исследований, пусть и остающихся пока еще с трудом транслируемыми в рутинную клиническую практику, – попытки более точно предсказать значимость потенциальных неоантигенов на основе способности мутантных белков связываться с молекулами ГКГС I типа [17]. Помимо получения информации об имеющихся в опухолевом экзоме повреждениях, необходимым условием для такого анализа является предварительное установление генотипа HLA I пациента. Любопытно, что гомозиготность по локусам HLA уменьшает потенциальное число неоэпитопов, которые могла бы презентировать иммунной системе опухолевая клетка. Действительно, пациенты с гомозиготными генотипами HLA I в целом хуже отвечают на ингибиторы контрольных точек иммунного ответа. Кроме того, некоторые гаплотипы HLA ассоциированы с благоприятным или плохим ответом на иммунотерапию [18].

Моногенные предикторы ответа

Помимо общей мутационной нагрузки, маркерами чувствительности или резистентности к иммунотерапии могут служить соматические мутации в определённых генах. Например, в работе N. Riaz et al. удалось установить связь между соматическими мутациями в генах SERPINB3 и SERPINB4 и высокой вероятностью длительного ответа меланомы на ипилимумаб [19]. Еще один недавно обнаруженный маркер благоприятного ответа на иммунотерапию – мутации в демети-лазе TET1 [20]. Напротив, соматические мутации в генах STK11, PTEN и генах каскада гамма-интерферона ассоциированы с плохим ответом на лечение [21–23]. Фактическая значимость всех этих находок остаётся пока неясной, так как они нуждаются в независимом подтверждении. Очень интересно исследование S.J. Patel et al. (2017), в котором была сделана попытка идентифицировать новые гены, соматические дефекты которых нарушают противоопухолевый иммунный ответ вне связи с какими-либо предварительными гипотезами за счет применения систематической инактивации белок-кодирующих генов на основе технологии CRISPR-CAS [24]. Таким образом, удалось подтвердить значимость уже известных генов, связанных с презентацией антигенов, подтвердить несколько более «сомнительных» маркеров, ассоциированных с сигнальным каскадом гамма-интерферона, и обнаружить несколько совершенно неожиданных «кандидатов».

В ряде работ удалось показать, что соматическая инактивация компонентов системы процессирования и презентации антигенов ассоциирована с отсутствием эффекта от ингибиторов контрольных точек иммунного ответа. Хотя эти мутации редко становятся причиной первичной устойчивости меланом к иммунотерапии, они часто ассоциированы с возникновением вторичной резистентности [13, 24]. Напротив, в случае немелкоклеточного рака легкого потери гетерозиготности аллелей HLA – частое явление, затрагивающее преимущественно новообразования с высокой мутационной нагрузкой, выраженной экспрессией PD-L1 и инфильтрацией цитотоксическими Т-клетками [25]. Возможно, этот феномен лежит в основе первичной резистентности подобных опухолей к ингибиторам PD1/PD-L1, но техническая сложность оценки статуса локусов ГКГС до сих пор препятствует проверке данной гипотезы.

Системный иммунный статус

Для оценки системного иммунного статуса предпринимались попытки проанализировать параметры стандартного клинического анализа крови (абсолютное количество нейтрофилов, лимфоцитов и их соотношение, количество эозинофилов и др.), иммунологические маркеры крови (преобладание определённых субпопуляций лимфоцитов, наличие антител к NY-ESO1 и др.), а также генетические особенности индивида (генотипы HLA и других вовлечённых в иммунный ответ генов).

Во многих работах были выявлены ассоциации между повышенной общей продолжительностью жизни, удлинением времени до прогрессирования на фоне лечения ингибиторами контрольных точек иммунного ответа и такими характеристиками клинического анализа крови, как низкое абсолютное количество нейтрофилов, отношение количества нейтрофилов к лимфоцитам менее 3, низкое количество моноцитов, высокая доля лимфоцитов, высокая концентрация эозинофилов и т. д. [26, 27]. Зачастую подобные показатели объединяют в комплексные индексы, обладающие предиктив-ным/прогностическим значением [27]. Изменение некоторых из этих параметров в ходе лечения ингибиторами контрольных точек иммунного ответа также коррелировало с эффектом терапии [28].

К иммунологическим параметрам периферической крови, связанным с эффективностью ингибиторов контрольных точек иммунного ответа, относятся количество CD8+ и CD4+ T-лимфоцитов [26, 29]; количество миелоидных супрессорных клеток и регуляторных FOXP3+ Т-клеток [30]; уро- вень CD45RO+CD8+ T-клеток памяти [31]; уровень CTLA4 в сыворотке крови [32]; уровень IL-2 рецептора альфа (IL-2Rα, sCD25) [33] и другие факторы. Для многих из этих показателей предиктивное значение имеет не столько их базовый уровень, сколько динамика в ходе терапии [26, 29].

Внутриопухолевый иммунный статус

В последние годы предпринимается множество попыток комплексной и всесторонней классификации внутриопухолевого иммунного ландшафта. В наиболее масштабной из подобных работ, проведенной в рамках The Cancer Genome Atlas, все новообразования удалось подразделить на 6 различных иммунофенотипов [34]. Безусловно, подобные исследования имеют глубокое фундаментальное значение, однако пока наиболее простым для оценки и вместе с тем наиболее значимым параметром внутриопухолевого иммунного статуса является инфильтрация опухоли CD8+ позитивными Т-лимфоцитами.

Большую популярность приобрела упрощенная практическая классификация, согласно которой опухоли делятся на 4 группы по наличию T-лимфоцитарной инфильтрации (tumor infiltrating lymphocytes, TILs) и экспрессии PD-L1 [35]. TILs+/ PD-L1+ опухоли – высокоиммуногенны и с высокой вероятностью ответят на иммунотерапию; TILs-/PD-L1+ опухоли окажутся резистентными к иммунотерапии, если иммунное микроокружение не будет трансформировано каким-то иным терапевтическим вмешательством; TILs+/PD-L1-опухоли могут служить кандидатами для лечения ингибиторами контрольных точек иммунного ответа, не затрагивающими систему PD1/PD-L1. Наконец, TILs-/PD-L- опухоли представляют собой «иммунологическую пустыню», неспособную ответить на какую-либо иммунотерапию.

Действительно, T-лимфоцитарная инфильтрация, отражающая, как предполагается, распознавание опухолевых клеток иммунной системой, является признаком хорошего прогноза при раке лёгкого, толстой кишки и меланоме [36]. Количество T-лимфоцитов в меланомах до лечения не коррелировало с клинической активностью ипили-мумаба, однако более чем у половины пациентов, ответивших на терапию, наблюдалось увеличение плотности лимфоцитов в биопсиях, сделанных спустя три недели после начала лечения [37]. Эффект ингибитора PD1 пембролизумаба в исследовании P.C. Tumeh et al. (2014) был ассоциирован как с инфильтрацией меланомы CD8+ клетками до начала лечения, так и с приростом их количества в результате терапии [38]. В недавнем исследовании показано, что хороший ответ немелкоклеточных опухолей легкого на блокаду контрольных точек иммунного ответа ассоциирован с большим количеством неактивных Т-клеток в опухоли (с низкой экспрессией гранзима B и Ki67) [39]. Безусловно, уточнение состава лимфоцитарного инфильтрата, а также изучение свойств иммунных клеток позволяет улучшить предиктивную значимость оценки внутриопухолевого иммунитета. Например, недавно было продемонстрировано наличие двух фенотипов CD8+ T-киллеров, инфильтрирующих меланомы и различающихся по наличию экспрессии фактора транскрипции TCF7. В противоопухолевом иммунном ответе могла участвовать лишь TCF7+ категория данных клеток [40].

Хотя традиционно состав иммунного инфильтрата опухоли изучается при помощи иммуногистохимии, было предпринято множество попыток заменить морфологический анализ исследованием транскрипции. Изучение экспрессии РНК обладает рядом преимуществ перед ИГХ: оно допускает большую стандартизацию, объективность и оценку статуса большего разнообразия молекул. Действительно, для ряда значимых для иммунофенотипи-рования белков пока не существует достаточно надежных антител [40]. В нескольких исследованиях было продемонстрировано влияние экспрессии различных транскриптов, характеризующих иммунный статус опухолевого микроокружения, на эффективность терапии ингибиторами CTLA4 [13, 37]. Большое значение имеет недавняя работа, в которой удалось установить экспрессионный профиль из 18 генов, функционально связанных с активацией гамма-интерферона, ассоциированный с хорошим ответом на иммунотерапию [41]. В другом исследовании, основанном на секвенировании транскриптома отдельных клеток меланомы, был установлен экспрессионный паттерн, связанный с устойчивостью к анти-PD-1 терапии [42]. Вполне закономерной представляется недавно выявленная взаимосвязь ответа на ингибиторы контрольных точек иммунного ответа с повышенной экспрессией компонентов иммунопротеасомы (PSMB8, PSMB9) [43].

Еще одним ожидаемым маркером эффективности иммунотерапии оказалось повышенное разнообразие репертуара Т-клеточных рецепторов лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль [44].

Новые направления

Неожиданным открытием последних лет явилось установление модулирующего влияния микрофлоры ЖКТ на эффективность блокаторов контрольных точек иммунного ответа. Так, в недавней работе выяснилось, что присутствие микроорганизмов S. parasanguinis и B. massiliensis ассоциировано с ответом на ингибиторы контрольных точек, а наличие представителей семейства Peptostreptococcaceae, напротив, является предиктором резистентности [45]. Хотя подобные сведения явно носят предварительный характер, косвенное подтверждение значимости микрофлоры дают эпидемиологические исследования, согласно которым применение антибиотиков в период получения иммунотерапии или незадолго до/после лечения ассоциировано со снижением противоопухолевого эффекта [46]. Крайне интересно недавнее наблюдение, согласно которому онкологические пациенты, проходящие иммунотерапию и получившие прививки против гриппа, а также перенесшие эпизод заболевания гриппом или гриппоподобным синдромом, продемонстрировали увеличение общей выживаемости [47]. Возможно, что противовирусные вакцины (вакцины против гриппа) способны радикально менять внутриопухолевый иммунный статус опухоли, конвертируя «иммунологические пустыни» в высокоиммуногенное микроокружение: в эксперименте наиболее эффективным оказалось внутриопухоле-вое введение вакцины [48].

Заключение

Таким образом, ни один из известных предиктивных маркеров не позволяет с абсолютной