Предварительное описание нового вида галофильной метилобактерии рода Methylophaga из фильтрата полигона захоронения твёрдых бытовых отходов

Основную часть твердых бытовых отходов (ТБО) городов подвергают захоронению на специально оборудованных полигонах (ПТБО). В России на ПТБО ежегодно производится захоронение око ло 40 млн т ТБО [Вайсман. Вайсман, Максимов, 2003]. Деградация органических субстратов анаэробными микроорганизмами сопровождается высвобождением простых органических соединений, таких как ацетат, бутират. лактат, пируват, пропионат. пропанол, этанол, метанол и формальдегид. Органические компоненты залежи ТБО разла-

(С Шаравин Д. Ю Саралов А. PL 2015

гаются микроорганизмами с образованием биогаза. состоящего на 50-70% из СН4 и на 30-50% - из СО3- ПТБО являются важным источником атмосферного метана, их вклад в глобальную эмиссию этого парникового газа оценивается в 6-12% [Кожевникова, Каллистова, Кевбрина. 2006]. Кроме эмиссии метана,. ПТБО оказывают негативное влияние на окружающую среду даже после их закрытия. в частности, из-за продолжающегося стока загрязненных фильтрационных вод [Вайсман, Вайсман, Максимов, 2003].

Разнообразные представители филума Proieo-bucteria широко распространены в природе и могут быть изолированы из различных ИСТОЧНИКОВ разных климатических зон Землш они часто доминируют в пресноводных и морских экосистемах [Amann, Ludwig. Schleifer 1995: Snaidr el aL 1997]. а также в сточных водах и активных илах городских и промышленных биологических ОЧИСТНЫХ сооружений [Manz el al.. 1992; Jurelscliko el al.. 2002]."

Аэробные метилотрофные бактерии, использующие метан (метанотрофы) и его окисленные и замещенные производные (метилобактерии) в качестве источников углерода и энергии, повсеместно распространены в природе. Метилотрофы часто ассоциированы с метанотрофами. особенно в почве. хотя часто и с высокой плотностью колонизируют листовую поверхность, присутствуют б семенах и ризосфере многих растений и играют значительную роль в превращениях одноу глеродных соединений на ПТБО [Иванова и др.. 2000; Knief el al., 2008].

Цель настоящего исследования - изучение и предварительное описание новых таксонов мети-лотрофных денитрификаторов, изолированных из фильтрационных вод ПТБО.

Материалы и методы исследования

В период С мая 2010 по октябрь 2013 г. изучали микробиоценоз водных масс обводного канала (средняя глубина 1.5 м) ПТБО «Софроны» г. Перми, используемого для утилизации основной массы городского мусора с 1978 г. Полигон расположен в 12 км от города и занимает 52 га, представляя из себя холм от 20 до 30 м в высоту. Температура внутри полигона варьирует от 30 до 60°С (вследствие разогрева его процессами анаэробного разложения органических веществ).

В 2010-2013 гг. исследовали старую «холодноводную секцию» ирригационного канала в южной части полигона. На протяжении зимы вода '?десь промерзала от поверхности до дна. В середине марта 2013 г. в северной части полигона исследовали молодую «тепловодную секцию». На этом специфичном участке из «тела» полигона истекал горячий тёмно-коричневый раствор (водный гу- мус), поэтому на момент отбора проб температура в придонном слое канала составляла +23°С, в то время как температура на открытом воздухе не превышала минус 13°C.

Пробы отбирали в стерильные бутыли объёмом 1.5 л, использовали их для гидрохимических и микробиологических анализов. Гидрохимические анализы выполняли согласно практическому руководству по изучению состава промышленных сточных вод. Содержание растворенного метана в пробах оценивали по результатам анализа газовых смесей на хроматографе Chrom-5 (Чехословакия), металлы - в гексановых и хлороформных экстрактах на атомно-абсорционном спектрометре Shimadzu АА-6300 (Япония). Состав органических веществ фильтрационных вод и жирнокислотный состав (ЖК) определяли на хромато-масс-спектрометрической системе Agilent 6890/5973N (США). Идентификацию метиловых эфиров ЖК осуществляли с использованием автоматизированной системы обработки массспектральных данных AMD IS с поиском целевых компонентов по библиотеке NISTEPA. MSL (США) с фактором сходства не менее 80%.

Способность к денитрификации микрофлоры сточных бод и культур протеобакгерий оценивали по накоплению N₃O в газовой фазе с N₃ и ацетиленом. Анализ газовых смесей производили на хроматографе Chrom-5 (Чехословакия) с применением катарометра, колонки длиной 2.4 м и диаметром 6 мм с абсорбентом Porapak N (США).

Фрагменты тотальной ДНК из нативных образцов, кодирующие бактериальные гены 16S рРНК, были амплифицированы с использованием ПЦР с эу бактериальным и праймерами: 27Ги 1492г [Lane, 1991]. Ген метанолдегидрогеназы (mxaF) ампли-фицировали в полимеразной цепной реакции. используя пару праймеров; F1003 и R1561 [McDonald. Murrell, 1997; Lau el al. 2013].

Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК. проводили по методу Сэнгера с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosyslems. Inc..USA) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc.USA) согласно инструкциям производителя. Первичный анализ полученных последовательностей проводили с помощью программного пакета BLAST. Филогенетический анализ проводили по методу Maximum-Likelihood и алгоритмов, реализованных в пакете программ TREECONnMEGA 4.

Результаты и их обсуждение

Слабощелочные (pH 80-8.3) фильтрационные воды бикарбонатного типа «тепловодной секции» характеризовались высоким уровнем загрязнения по аммонию, нитратам, нитритам, фосфору. желе- зу, хрому; никелю и метану7 (табл. 1). В «холодноводной секции» по сравнению с «тепловодной секцией» наблюдалось резкое снижение цветности раствора (в 40-60 раз), концентрации метана (32-260 раз), общего фосфора (35-56 раз), хрома (19-56). железа (7-20 раз) и натрия (6-14 раз).

Таблица 1

Гидрохимическая характеристика фильтрационных вод обводного канала ПТБО «Софроны» в течение 2010-2013 гп в «старой холодноводной секции» и в марте 2013 г, в «молодой тепл овод нои секции» (значения приведены в скобках)

Параметр	Поверхностная вода	Придонная вода
Температура. °C	15±14 (3)	15±14 (23)
pH	8.310.3(8.2)	8.010.3 (8.3)
Содержание метана, мл/л	0.23Ю.18(13.0)	1.5110.66(15.1)
Минеральные вещества, мг/л: Общий фосфор	0.3510.08(15.2)	2.510.6(16.4)
Аммоний	39,2±18.3 (272.1)	48.7117.7 (265,3)
Нитраты	47.6114.6(537.2)	45.1115 3 (829.9)
Нитриты	1.94=0,5 (53.6)	2,2И,1 (76,6)
Гидрокарбонаты	8031120(8540)	8421105 (9760)
Натрий	5821224 (5054)	6451266(5954)
Железо	0 4110.20 (4.28)	3.2311.45(3.71)
Никель	0.1210.02 (0.50)	0.1410.03(0.47)
Хром	0.02Ю.01 (0.56)	0.0210,01 (0,67)

Из фильтрационных вод ПТБО был выделен умеренно галофильный метилотрофный денитри-фикатор RS-MM3. По совокупности гено- и хемо- таксономических признаков изолят был отнесен к представителям рода Xlelhylophaga (табл. 2; рисунок).

Таблица 2

Сравнительная таблица фенотипического сходства культуры RS-MM3 и некоторых членов рода Methylophaga. Штаммы: RS-MM3;M nitratireducenticrescens JAM1^T [Villeneuve et aL, 2013]; M.

frappieri JAM7^T [Villeneuve et aL, 2013]; M. alcalica M39^T [Doronina, Darmaeva, Trotsenko, 2003]; M. aminisuyidivorans MP^T [Kim et aL, 2007]; M* lonarensis MPL^T [Antony et aL, 2012]

11араметр	Methylophaga sp* RS-MM3	,1АМ1Т	JAM7T	М39т	МРТ	MPLT
1>Фрукгоза	+	—	—	—	+	—
D-Глюкоза	+	ND	ND	ND	ND	ND
Метанол 1%	+	+	1	1	+	+
Метиламин	+	-	-	+	+	—
Диан, темп., °C	10—40	15-37	15-37	4-35	20-37	20-37
Опгим, темп,,°C	30	30	34	25-29	30	28-30
pH диапазон	6.0-9.5	6.0-11.0	6.0-11.0	7.0-11.0	6.0-8.0	7.0-10.0
Оптимум. pH	7,5-8,2	8,0	8,0	9.O-9.5	6,8-7,0	9.0-10,0
NaCl диап., %	0.2-10	0.5-8.0	0 5-8.0	0.05-10.0	1.5-9.0	0.05-10.0
Опгим. NaCl, %	3.0	3.0	3.0	ND	3.0	0.5-2.0
Нитрат редукция	+	+		+	+	+
Морфология клеток	Палочки	Палочки	Палочки	Палочки	Палочки	Палочки
Размер клеток, мкм	0.3-0.5 *1.0-2,0	0.6^1.5	07*1,5	0.6-0.8 И,4-2.8	0.2-0.4 *0.8-1,2	1.2-2.0 *0,2
11одвижность	+	+	+	+		1
G+C (mol %)	43.9	44.7	47.8	48.3	44.9	50.0
Доминирующие ЖК	Ci» i,C|6q, Cis ।	С|6о, С1б:Ь С|£]	Смог См л C1KI	Смог См л C1KI	Смог См ]	Ci6o. Ci» 1, С]Ц:1

Филогенетическое дерево, показывающее положение штамма RS-MM3 относительно видов рода Methyiophaga, представлено на рисунке. Филогенетическое сходство с различными вицами рода достигало лишь межвидового уровня (95.3-96.7%). Изолят RS-MM3 сильнее связан с Methylophaga lonarensis MPLT, но значительно слабее - с груп пой метилобактерий, включающей XL frappieri JAM7T, XL nitrafireducenticrescens JAM1T, XL ni-iratireducenticrescens MIK и XL thiooxydans DMS 010.

Колонии на среде с агаром и метанолом бледно-розовые. круглые, выпуклые до 1-2 мм в диаметре. Клетки грамотрицательные аспорогенные подвижные палочки (0.3-0.5 х 1.0-2.0 мкм), умеренно галофильные, нейтрофильные и мезофильные. Растет в среде с 0.02-5% СН^ОН (оптимум 0.6-0.8%) и 0.2-10% NaCl (оптимум 3-5%), при 10-40°€ (оптимум 28-33°С) и pH 6.0-9.5 (оптимум pH 7.5-8.2). Аэроб, или факультативный анаэроб, оксидазо- и каталазо-положителен. Активную денитрификацию осуществляет в среде с пируватом, но значительно слабее с метанолом, лактатом, малатом и ацетатом. Факультативный метилотроф; метанол, метиламин, фруктозу и сахарозу использует в качестве источников углерода и энергии.

Содержит mxaF ген, кодирующий метанолдегидрогеназу. Метан, глюкозу, дрожжевой экстракт не утилизирует. Продуцирует кислоты из метанола, но не из фруктозы и сахарозы. Гидролизует крахмал, но не казеин или желатин. В качестве источников азота использует аммоний, нитрат, триптон и метиламин. Добавка витамина Bi₂, дрожжевого экстракта (0.005%) и микроэлементов ускоряет рост. Чувствителен к эритромицину (15 мкг /диск) и стрептомицину (10 мкг /диск), но устойчив к ампициллин}⁷ (10 мкг /диск) и новобиоцину (30 мкг /диск).

0 02

Afetfiy/даада /cnarensts MPLT (JF3307 73)

— Methytophaga sp. RS-MM3(KF371S56)

M aminssuifidtvorans MP¹ (NRO43871)

ff^/ass/ca ATOC 33145r (X87339)

M manna DSM 5989' (X95459)

M suifidavorans RB-1¹ (X95461)

M. tfnooxydans DMS010¹ (DQ660915)

M framer/J AM 7' (NR121698) — M aicaiica M39¹ (AF364373) M ^atirec^erteesc JAM1 (NR074321)

M. nrtratireducenticrascans M1K (KM 192265)

M murahs КгЗ^г (AY694421)

^^^^^^^^^^^^^^" ГЛют/сго^о/га arct/ca SVAL-E^T (AJ4Q4/31) Cycfoc&stio/s pugetii PS-1 (L34955)

Филогенетические отношения между⁷ изолятом денитрифицирующего метилотрофа RS-MM3 из фильтрационных вод ПТБО и представителями у-протеобактерий рода Methylophaga. Дерево построено на основе выравнивания последовательностей гена 16S рРНК длиной 1420 нк при использовании алгоритма Maximum-Likelihood. Число над ветвью обозначает Bootstrap значения выше 50%. Последовательности гена 16S рРНК Thiomicrospira ага lea SVAL-E^T и Cydodasiicus pugeHi PS-1^т взяты как внегрупповые виды. Масштаб соответствует 2% дивергенции

При оптимальных условиях роста (30°С, pH 7.8) в среде с метанолом (5 мл/л. 30 г/л NaCl, 20 мкг/л витамин Bi₂) преобладают следующие жирные кислоты (% от общего количества ЖК): С|б:1о>7с (40.5). С]б:0 (35.2) И С13:Кй?с (1^.7). СОДСр-жание Г+Ц в ДНК составляет 43.9 мол. %. Основываясь на секвенировании гена 16S рРНК (Gen-Bank No KF371656) организм филогенетически близок к ограниченно-галоалкалофильным мети-лотрофам рода Methylophaga (95.3-96.7% сходства).

Заключение

В фильтрационных водах ПТБО С высоким уровнем загрязнения по нитратам и метану выявлено широкое распространение метилотрофных денитрифицирующих Proteohacteria. Выделена и описана умеренно галофильная метилотрофная денитрифицирующая GatHmaproteohactena рода Methylophaga (изолят RS-MM3) с низким содержанием Г+Ц в ДНК 43,9 мол.%. Основываясь на секвенировании гена 16S рРНК. у изолята установили филогенетическую близость к ограниченно галоал- калофильным метилотрофам рода Methylophaga (межвидовой уровень сходства составил 95.3-96.7%). По совокупности гено- и фенотипических признаков новый штамм идентифицирован как Methylophaga RS-ММ3 sp. nov.

Работа выполнена в рамках Комплексной программы УрО РАН (проект № 15-4-4-2).