Применение чашки Петри с миллиметровой линейкой

Вве^ение. Наиболее ва^ными задачами специалистов ветеринарной медицины являются не только своевременная и правильная диагностика заболеваний ^ивотных, но и выбор необходимых для успешного лечения больных ^ивотных терапевтических средств, определение антибиотикочувствительности микроорганизмов, и в целом профилактика антибиотикорезистентности патогенной микрофлоры [5, 6, 7]. Наша разработка относится к ветеринарной микробиологии, а именно, к лабораторному оборудованию для культивирования колоний микроорганизмов. Наиболее эффективно применение чашки Петри с миллиметровой линейкой для установления степени задер^ки роста микроорганизмов при определении их чувствительности к антибиотикам.

В лабораторной практике применяются контактные чашки Петри, которые используются для подсчета колоний микроорганизмов. Изготовлены они из оптического полистирола. Эти чашки Петри вентилируемые и имеют счетную сетку по всей площади крышки чашки Петри. По горизонтали столбцы ячеек данной крупноячеистой сетки пронумерованы арабскими цифрами от 1 до 6. По вертикали ряды ячеек сетки обозначены заглавными буквами латинского алфавита – A, B, C, D, E, F [9]. Кроме того, выпускают наклейки для чашек Петри PetriStickers, у которых сетка содер^ит 50 квадратов. Квадраты этой крупноячеистой сетки нанесены по всей площади наклейки, которая соответствует площади дна чашки Петри [8]. Однако, эти крупноячеистые счетные сетки предназначены только для подсчета количества колоний микроорганизмов внутри их ячеек, а не для получения размеров зоны задер^ки роста микроорганизмов при определении их чувствительности к антибиотикам, выра^енной в миллиметрах. При работе с такими счетными сетками, не предназначенными для установления размеров зоны задер^ки роста микроорганизмов при определении их чувствительности к антибиотикам, нельзя получить достоверных результатов. Это недопустимо при анализе чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, проводимом с целью назначения ^ивотным своевременной и эффективной антибиотикотерапии.

Целью иссле^овани^ является модификация чашки Петри для выполнения точных лабораторных исследований по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в различные временные отрезки (часы, сутки) еще на стадии их культивирования.

Услови^, материалы и мето^ы. Объектом для исследования послу^или телята в возрасте от ро^дения до 10 суток, которые содер^ались в хозяйстве ИП Кор^авых Д.Е. Орловского района Орловской области.

Наличие патогенных микроорганизмов в мазке из прямой кишки у телят выявляли согласно общепринятой методике [2]. Подтверждение видового состава выделенных культур проводили с использованием определителя бактерий Берги [1].

Определение чувствительности и устойчивости микроорганизмов к антибиотикам проводили согласно методике Костенко Т.C., Cкаршевской Е.И., C.C. Гительсон (1989), где емкость стерильной стеклянной чашки Петри заполняют мясопептонным агаром (или специализированной средой для определенной группы микроорганизмов) по 20 мл. На поверхность уплотнившейся среды наливают 1 мл одномиллиардной взвеси (в 0,9 %-ном растворе NaCl) агаровой культуры микроорганизмов, в частности, полученных путем мазка из прямой кишки теленка. Легким покачиванием чашки Петри культуру равномерно распределяют по питательной среде, излишек ^идкости отсасывают стерильной пастеровской пипеткой. Чашку Петри подсушивают в термостате в течение 15 минут при температуре 37 °C. Затем на поверхность засеянной среды стерильным пинцетом накладывают стандартные бума^ные диски с разными антибиотиками (спектиномицин, норфлоксацин, тилозин, канамицин, олеандомицин, тиамулин, цефотаксим, хлортетрациклин) на расстоянии 2 см от ее края и друг от друга, и еще один диск в центре емкости чашки Петри. После нало^ения ка^дого диска пинцет об^игают на пламени горелки. Cначала чашку Петри выдер^ивают при комнатной температуре (2 часа), затем, перевернув ее вверх дном, помещают в термостат на 16 часов (37 °C). Оценку результатов проводят с учетом наличия или отсутствия зоны задер^ки роста, размера зоны вокруг диска с антибиотиком. Отсутствие зоны задер^ки роста бактерий свидетельствует о нечувствительности их к данному противомикробному препарату. Зона задер^ки до 15 мм является показателем малой чувствительности, зона в 15-25 мм указывает на достаточную чувствительность к антибиотикам испытуемой бактериальной культуры. Чем больше зона задер^ки роста бактерий, тем выше их чувствительность к данному антибактериальному препарату [2].

Модифицированная чашка Петри с миллиметровой линейкой [4] была успешно применена при проведении лабораторно-практических занятий на кафедре эпизоотологии и терапии ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный университет имени Н.В. Парахина». Определение чувствительности и устойчивости микроорганизмов к антибиотикам проводили с использованием различных лабораторных устройств (бактериологическая петля) [3].

Результаты и обсуждение. Модифицированная Чашка Петри содержит емкость с дном и крышку с миллиметровой линейкой в виде параллельных черточек-делений, расположенных друг от друга через 1,0 мм на наружной стороне крышки и по всей длине ее диаметра. Размещение миллиметровой линейки на дне емкости чашки Петри не предусматривалось, поскольку для культивирования микроорганизмов часто применяют непрозрачные питательные среды (Эндо, обогащенные питательные среды, кровяной агар, ^елчный агар и др.), что затруднило бы визуализацию зоны задержки роста микроорганизмов и сопоставление с ней миллиметровой линейки. Кроме того, чашка Петри оснащена двумя маркировочными матовыми вертикальными ограничительными полосами: одна из них располо^ена на нару^ной стороне боковой поверхности емкости с дном на всю ее высоту, а вторая - на наружной стороне боковой поверхности крышки также на всю ее высоту (рис. 1).

Чашка Петри с миллиметровой линейкой позволяет измерить зону задер^ки роста микроорганизмов в любой точке поля ее емкости в том числе и в ее центре благодаря миллиметровой линейке в виде параллельных черточек-делений, располо^енных друг от друга через 1,0 мм, на крышке. Она предназначена для проведения раннего и поэтапного исследования задер^ки роста микроорганизмов при определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам еще на стадии их культивирования. Возмо^на наглядная документация результатов исследований путем фотографирования. При этом миллиметровая линейка в виде параллельных черточек-делений не затрудняет визуализацию зоны задер^ки роста микроорганизмов, поскольку она не занимает всю площадь поверхности крышки чашки Петри, что наблюдается у контактных чашек Петри и чашек Петри с наклейками PetriStickers.

Рисунок 1 - Чашка Петри с миллиметровой линейкой (в раскрытом виде): 1 - емкость с дном, 2 – крышка, 3 - миллиметровая линейка, 4 - маркировочные матовые вертикальные ограничительные полосы.

Использование чашки Петри с миллиметровой линейкой приводим на примере исследований чувствительности к антибиотикам микрофлоры, взятой посредством мазка из прямой кишки у телят. Так, у теленка, черно-пестрой породы в возрасте 10 дней, ^ивой массой 28 кг (бычок) было отмечено угнетение, вялый аппетит, понос, каловые массы ^идкие со зловонным запахом. Для постановки диагноза тремя стерильными ватными тампонами, смоченными стерильным 0,9%-й раствором NaCl, поочередно взяли мазки из прямой кишки теленка. Тампоны, ка^дый в отдельности, поместили в стерильную воду (20 мл) и доставили для бактериологического исследования в специализированную аудиторию микробиологии кафедры эпизоотологии и терапии, где пробы перед посевом развели до необходимой плотности микроорганизмов в 10-кратных последовательностях, так чтобы на чашку Петри со средой (например, мясопептонным агаром) пришлось 50-200 микробных тел, формирующих колонии.

Далее ставили тесты для подтвер^дения видового состава выделенных культур. В результате были выделены патогенные штаммы Escherichia coli . Диагноз – колибактериоз. Затем определяли чувствительность патогенного штамма E. coli к антибиотикам.

Для этого емкость стерильной стеклянной чашки Петри с миллиметровой линейкой заполнили дифференциально-диагностической питательной средой Эндо (используемой для выделения энтеробактерий) по 20 мл. На поверхность уплотнившейся среды Эндо налили 1 мл одномиллиардной взвеси (в 0,9 %-ном растворе NaCl) агаровой культуры E. coli , выделенной из каловых масс теленка. Легким покачиванием чашки Петри культуру равномерно распределили по питательной среде Эндо, затем подсушили в термостате в течение 15 минут (37°C). Далее на поверхность засеянной среды Эндо стерильным пинцетом выло^или стандартные бума^ные диски с различными антибиотиками на расстоянии 2 см от края и друг от друга, и еще один диск в центре емкости чашки Петри. После нало^ения ка^дого диска пинцет об^игали на пламени горелки. Затем чашку Петри накрыли крышкой, оснащенной миллиметровой линейкой таким образом, чтобы маркировочные матовые вертикальные ограничительные полосы на емкости с дном и крышке совпали (нало^ились друг на друга). То есть соблюдалась обычная позиция составных частей чашки Петри с миллиметровой линейкой в сборе. При этом маркировочной матовой вертикальной ограничительной полосой на нару^ной стороне боковой поверхности емкости для питательных сред и на нару^ной стороне боковой поверхности крышки обозначено место начала и завершения осмотра задер^ки роста колоний микроорганизмов.

Cначала чашку Петри выдер^али при комнатной температуре (2 часа), затем, перевернув ее вверх дном, поместили в термостат на 16 часов (37 °C). Оценку результатов провели с учетом наличия зоны задер^ки роста и размера зоны вокруг диска с антибиотиком. Когда проявилась зона задер^ки роста, ее измерили по диаметру (включая диаметр диска) с помощью миллиметровой линейки, которую вращением крышки (в каком-либо из направлений по часовой стрелке или против нее) приблизили к диску с антибиотиком, давшим наибольшую задер^ку роста E. coli на поверхности питательной среды Эндо в чашке Петри. Визуализация места начала и завершения осмотра задер^ки роста колоний микроорганизмов дает возмо^ность выполнять работу в необходимом ре^име. Пройдя по кругу емкости чашки Петри на уровне совмещения маркировочных матовых вертикальных ограничительных полос завершили работу. Это исключает повторные исследования. Выполнение миллиметровой линейки на крышке чашки Петри не усло^нило работу с ней и не повысило затраты времени на общепринятые манипуляции.

Зона задер^ки роста E. coli равная 27 мм указала на наибольшую его чувствительность к антибиотику тилозину. Результаты исследований задокументировали фотографированием зоны задер^ки роста E. coli (рис. 2).

Рисунок 2 - Определение антибиотикочувствительности E. coli .

Теленку в качестве специфической терапии был назначен антибактериальный препарат группы макролидов тилозин внутримышечно в дозе 5 мг/кг массы ^ивотного 1 раз в сутки. Через 5 суток после применения тилозина в сочетании с симптоматической терапией теленок выздоровел.

Выво^ы. Применение модифицированной чашки Петри с миллиметровой линейкой позволяет: проводить раннее и поэтапное исследование задер^ки роста микроорганизмов при определении их антибиотикочувствительности еще на стадии их культивирования; визуализировать место начала и завершения осмотра задер^ки роста колоний микроорганизмов в чашке Петри с миллиметровой линейкой; исключить необходимость проведения повторных исследований; повысить точность результатов исследований; назначить своевременную и эффективную антибиотикотерапию больным ^ивотным. Таким образом, использование модифицированной чашки Петри с миллиметровой линейкой является более эффективным по сравнению с известными и позволяет избе^ать повторных исследований вследствие исключения получения недостоверных результатов исследований. При этом мо^но производить исследования в различные временные отрезки (часы, сутки) еще на стадии культивирования, что ва^но для начала как мо^но более раннего лечения.