Применение феноксиуксусной кислоты в культуре пыльников риса in vitro

Введение. Получение андроклинных гаплоидов риса в культуре in vitro стало рутинной процедурой во всем мире [1–3] и в нашей стране [4–6]. Традиционно гаплоиды получают двуступенчато путем культивирования пыльников риса: сначала индуцируют каллусообразование, затем вызывают морфогенетический ответ каллуса [3, 7, 8].

Chen et al. [Цит. по: 7] и Zhuo et al. [9] отмечают возможность одноступенчатого получения регенерантов риса при использовании феноксиуксусной кислоты (ФУК). При этом процедура упрощается, каллусооб-разование и регенерация происходят на одной среде без пересадок каллуса, уменьшается альбинизм. Определена оптимальная концентрация ФУК для риса Oryza sativa L. подвидов indica и japonica .

Отмечено положительное действие ФУК и его аналогов при двуступенчатой регенерации риса. Каллус сохраняет свою регенерационную способность до 15 месяцев и 9 пассажей, что значительно дольше, чем при использовании других ауксинов [10], и это дает возможность увеличить общий выход зеленых побегов [9].

В настоящей работе была поставлена задача изучить особенности регенерации дальневосточных гибридов риса в культуре пыльников in vitro на питательных средах, содержащих ФУК.

Материалы и методы. В качестве исходного материала использовано потомство четырех гибридов второго поколения риса посевного O. sativa подвида japonica , полученное в лаборатории селекции риса Приморского НИИСХ. Родительскими формами являлись сорта дальневосточной и инорайонной селекции.

Рис выращивали в 2013 году в разных условиях:

• -    в контролируемых условиях культуральной комнаты в течение всего вегетационного периода: t=20⁰С, освещенность 4 тыс. лк, фотопериод 16/8 часов (КТ);

• -    на вегетационной площадке лаборатории селекции риса, далее в конце фазы кущения растения риса помещали в контролируемые условия культуральной комнаты: t=20⁰С, освещенность 4 тыс. лк, фотопериод 16/8 часов (ВП-КТ);

• -    на вегетационной площадке лаборатории селекции риса до периода сбора метелок (ВП).

В каждом варианте выращено 4–7 растений от каждого гибридного потомства.

Метелки срезали с соломиной, когда расстояние между флаговым и вторым листом составляло 5–7 см, согласно работе Ю.К. Гончаровой [6]. Стадию микроспор (наибольшая встречаемость в конце одноядерной стадии) определяли по методике ВИР [11]. Далее метелки помещали в цилиндрах с водой в холодильник при t=5ºС или t=10ºС на 7 суток.

Испытывалось два способа получения растений-регенерантов: одноступенчатая и двуступенчатая регенерация в культуре пыльников.

Двуступенчатая регенерации проводилась в два этапа. На первом этапе в культуре пыльников индуцировали пролиферацию каллуса на 2 вариантах сред: N 6 [2] и М8 (среда по прописи, приведенной в работе [6]), содержащих по 10,0 мг/л ФУК и 2,0 мг/л НУК. В качестве источника углеводов использовали сахарозу (3%), желирующего вещества – агар (0,8%), рН=5,8. Затем каллус пересаживали на регенерационную среду N 6 [2] с содержанием 6-БАП (1,0 мг/л), кинетина (1,0 мг/л), сахарозы (9%), агара (0,8%), pH=5,8.

Для одноступенчатой регенерации использованы питательные среды те же, что и для двуступенчатой регенерации.

Метелки вынимали из влагалища листа в асептических условиях пинцетом без применения стерилизующих агентов. Далее извлекали пыльники из цветков риса под бинокулярной лупой и высаживали в пробирки диаметром 14 мм на поверхность инициальных сред, по два в каждую пробирку. Инокулированные пыльники культивировали в темноте при t=25ºС до каллусообразования. Каллусные агрегаты, размер которых достигал 2–5 мм, пересаживали на регенерационную среду в пробирки диаметром 21 мм и помещали в культуральную комнату при освещенности 4 тыс. лк, температуре 24–250С, фотопериоде 16/8 часов.

При одноступенчатой регенерации в половине случаев пробирки с каллусом 2–5 мм сразу переносили в ту же культуральную комнату. В другом случае каллус снимали для двуступенчатой регенерации, затем дожидались повторного образования каллуса, который переносили в культуральную на свет.

Особенности регенерации оценивали по следующим показателям: частота каллусообразования (процент пыльников, образовавших каллус), частота образования альбиносов (процент от всех регенерантов). Полученные данные обрабатывали статистически, рассчитывали среднее значение признака, t критерий Стьюдента между вариантами для чистоты инокуляции и каллусообразования, X критерий Ван-дер-Вандена для регенерации [12].

Результаты и их обсуждение

Влияние условий выращивания исходных растений риса на асептическую чистоту инокулированных пыльников

В культуру in vitro было введено 1994 асептически чистых пыльников риса. Чистота инокуляции пыльников зависела от способа выращивания исходных растений (табл. 1). Растения, выращенные в культуральной комнате и перенесенные в культуральную с вегетационной площадки, были асептически чистыми (инфицирование менее одного процента). У растений, растущих на вегетационной площадке весь период до срезания метелок, 15 % пыльников оказалось загрязненными инфекцией и отбраковано.

Таблица 1

Условия выращивания риса	Количество посаженных пыльников, шт.	Количество чистых пыльников, шт.	Загрязненность инфекцией, %
Культуральная комната	608	608	0,0
Вегетационная площадка–культуральная	652	646	0,9
Вегетационная площадка	874	740	15,3*

* – превышение над другими вариантами при p<0,05.

Асептическая чистота введения пыльников риса в культуру in vitro в зависимости от условий выращивания растений-доноров

Таким образом, с точки зрения асептической чистоты растения, растущие в контролируемых условиях хотя бы за две недели до введения в культуру in vitro пыльников, имеют преимущество. Но для их выращивания требуются дополнительные затраты на создание температурного режима и режима освещения. С другой стороны, на 15,3 % инфицированных пыльников с вегетационной площадки затрачиваются средства на приготовление питательных сред, привлекаются дополнительные трудозатраты. А в случае работы с ценными, ограниченными в количестве образцами возможна безвозвратная потеря инокулированных пыльников на самых ранних этапах культивирования.

Частота каллусообразования у гибридов риса

Незрелые пыльники риса F 2 поколения высаживали на два варианта индукционных сред. Каллусооб-разование наблюдалось на обоих вариантах (табл. 2). В среднем частота каллусообразования составила на среде N 6 – 4,2 %, на среде M 8 – 4,8 %. Статистически различия недостоверны, т.е. для каллусообразования оба варианта сред равнозначны.

Частота каллусообразования в культуре пыльников гибридов F 2 риса

Таблица 2

Гибрид	Среда N6				Среда M8
	t=5°C		t=10°C		t=5°C		t=10°C
	S     1- 5.x 3 Н s ГО ГО ГО X о Я го о. q	го 8 а? 5 S. ” 8	со о го СО 3 о о т 1Ш	6 со Го По' t Ю -9 о ск о 8 ? го 9 го rq со го	X    1- 5.x з Н s го ГО ГО X о q О ^	го 8 а? ” 8	X     1- 5.x з ГО ГО го х о Я х q О ^	го 8 а? ” 8
Культуральная комната
1-2	–	–	20	0	24	0	40	0
2-1	80	0	40	22,5	80	2,5	40	5,0
7-1	40	0	32	0	40	0	40	0
13-3	40	0	40	2,5	40	0	-	-
х = 2,3
Вегетационная площадка - культу					ральная комната
1-2	40	2,5	40	0	40	0	40	2,5
2-1	38	0	–	–	40	5,0	‒	‒
7-1	68	10,3	40	5,0	64	17,2	40	0
13-3	48	0	50	0	48	0	50	4,0
х = 3,3
Вегетационная площ					адка
1-2	38	2,6	40	5,0	34	2,9	24	0
2-1	58	1,7	64	9,4	58	6,9	40	15,0
7-1	56	7,1	40	12,5	42	16,7	38	15,8
13-3	52	7,7	50	4,0	56	8,9	50	4,0
х = 7,5*

Примечание: х - средняя частота каллусообразования, %; * - превышение над двумя другими вариантами при p<0,05.

Проводилась низкотемпературная предобработка пыльников перед высадкой на питательные среды. При обработке 5°С в течение недели 4,0 % пыльников индуцировали каллус, при 10°С – 5,1 %, различия статистически незначимы.

Условия выращивания исходных растений риса оказали значительное влияние на интенсивность кал-лусообразования (табл. 2). Среднее значение для растений-доноров из культуральной комнаты 2,3 %, для растений, выращенных на вегетационной площадке с переносом в культуральную, – 3,3 %. Лучшим вариантом получения растений-доноров является выращивание их в течение всего периода на вегетационной площадке. Интенсивность каллусообразования увеличивается более чем в два раза и составляет 7,5 %, что статистически значимо (p<0,05). Следует заметить, что максимальные значения были получены при выращивании растений-доноров в культуральной (22,5% для гибрида 2-1) и при выращивании на вегетационной площадке с переносом в культуральную комнату (17,2% для гибрида 7-1).

Растения, выращенные в культуральной комнате в течение всего периода или только во втором периоде роста до сбора метелок, образовали мелкие пыльники. Микроспоры в них были обычного размера. В.Ю. Горбунова [13], изучая андрогенез яровой мягкой пшеницы in vitro , пришла к выводу, что размер пыльников и микроспор не обязательно связан между собой. Увеличение количества мелких микроспор в пыльнике уменьшает интенсивность эмбриоидогенеза. В нашем эксперименте снижение количества микроспор в пыльниках, участвующих в процессе образования каллуса, могло стать одной из причин пониженного каллу-собразования у большинства гибридов. С другой стороны, период сбора метелок увеличивается, нужная фаза микроспор длится дольше. Это является преимуществом [14], позволяя посадить больше пыльников, что особенно важно при работе с ценными образцами.

Из результатов, изложенных выше, следует, что унифицировать условия выращивания исходных растений для получения максимального количества каллусов затруднительно. Для разных гибридов необходимо подбирать в каждом случае свои условия выращивания растений-доноров.

Генотипическая составляющая считается одним из важнейших факторов, ограничивающих получение гаплоидов в культуре in vitro [3, 7, 8, 15–17]. В нашем эксперименте все четыре гибрида оказались результативными. Минимальная частота каллусообразования у гибрида 1–2 (1,4 %). В два раза больше у гибрида 13-1 (2,8 %), различия статистически незначимы. У гибридов 2-1 и 7-1 этот показатель 6,8 и 7,0 % соответственно, превышение над гибридом 1-2 подтверждено статистически при p<0,05.

При рассмотрении частоты каллусообразования у растений, выращенных на вегетационной площадке, картина несколько изменяется. Достоверные различия обнаруживаются между парами гибридов 1-2 и 7-1, а также 13-1 и 7-1 (p<0,05).

Побегообразование у гибридов риса при двуступенчатой регенерации

Каллусные агрегаты пересаживали на регенерационную среду для формирования побегов. Каллусы всех гибридов были способны к морфогенетическим ответам. Их общее число представлено в таблице 3. Отдельные каллусы образовали до 22 зеленых регенерантов и до 15 альбиносов. Всего было получено 386 регенеранта, из них 39 % – зеленые; 61 % – альбиносы. У гибридов, полученных на индукционных средах без содержания ФУК, зеленых было больше – 58 %, остальные – альбиносы (неопубликованные данные).

Индукционная среда для каллусообразования у пыльников риса оказывала последействие. После среды N 6 44,9 % побегов были альбиносами, после среды M 8 доля их увеличилась в два раза, различия достоверны на 1%-м уровне значимости. Общее количество побегов после индукционных сред N 6 и M 8 215 и 171 шт. соответственно.

Побегообразование у гибридов F 2 риса при двуступенчатой регенерации

Таблица 3

Гибрид	После с		реды N 6		После с		реды M 8
	t=5°C		t=10°C		t=5°C		t=10°C
	Всего, шт.	Доля альбиносов, %	Всего, шт.	Доля альбиносов, %	Всего, шт.	Доля альбиносов, %	Всего, шт.	Доля альбиносов, %
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Культуральная комната
1-2	–	–	0	0	0	0	0	0
2-1	0	0	74	37,8	8	100	15	100
7-1	0	0	0	0	0	0	0	0

Окончание табл. 3

1	2	3	4	5	6	7	8	9
13-3	0	0	0	0	0	0	–	–
Вегетационная площадка - культуральная комната
1-2	4	0	0	0	0	0	14	100
2-1	0	0	–	–	0	0	–	–
7-1	52	42,3	0	0	21	81,0	0	0
13-3	0	0	0	0	0	0	11	63,6
Вегетационная площадка
1-2	0	0	0	0	11	100	0	0
2-1	11	100	24	83,3	5	100	40	97,5
7-1	0	0	24	33,3	12	75,0	20	25
13-3	24	12,5	2	50,0	13	100	1	100
	х = 44,9*				х = 86,8*

Примечание: х - средняя доля альбиносов, %; * - разница между средними показателями статистически достоверна (p<0,01).

Наши результаты хорошо согласуются с данными других авторов. Питательная среда M 8 лучше подходит для культуры пыльников риса подвида indica [9]. Высокое содержание ионов железа в среде (в 2 раза выше, чем в среде N 6 ) является избыточным для гибридов подвида japonica , приводя к удвоению доли альбиносов. Недостаток или избыток F²⁺ считается фактором увеличения альбинизма у риса [6].

Достоверных различий по признаку «доля альбиносов» между генотипами, температурами предобработки пыльников и условиями выращивания растений-доноров не было обнаружено.

Побегообразование у гибридов риса при одноступенчатой регенерации

Непосредственной регенерации риса на питательных средах с содержанием ФУК не было получено. На каллусах наблюдался ризогенез, но отсутствовал геммогенез. Три каллусных агрегата сформировали по одному слабому регенеранту-альбиносу.

Регенерационная способность генотипов индивидуальна и зависит от взаимовлияния эндогенных (в экспланте) и экзогенных (в питательной среде) гормонов [13]. Для одноступенчатой регенерации риса в сочетании с ФУК рекомендовано содержание НУК (0,5–2,0 мг/л) и цитокинина 6-бензиламинопурин 0,5–1,0 мг/л [6, 9]. В некоторых случаях эмбриоидогенез у сортов пшеницы происходит и на безгормональной питательной среде [13]. Дальневосточным гибридам риса требуется подбор комбинации гормонов для одноэтапного получения регенерантов.