Применение фитопрепаратов родиолы розовой в качестве возможных гепатопротекторов

Использование лекарственных растений, содержащих биологически активные соединения (БАС), обладающие антиоксидантной активностью, позволяет расширить арсенал лекарственных препаратов для лечения и профилактики поражений печени. Изучение механизмов действия гепатопротекторных соединений растительного происхождения дает возможность влиять на различные звенья антиоксидантной защиты печени в комплексной терапии гепатитов. Препараты родиолы розовой являются признанными фитоа-даптогенами [2]. Биологическая активность корневищ родиолы розовой в основном обусловливается гликозидами коричного спирта, среди которых доминирующим компонентом является розавин [1]. В медицинской практике успешно используются тонизирующие, адаптогенные, иммуномодулирующие свойства препаратов родиолы розовой [3, 4]. Однако практически не изучено влияние фитопрепаратов, созданных на ее основе, на ферментативные звенья антиоксидантной защиты печени. Так же недостаточно изучена активность препаратов родиолы розовой в сравнительном аспекте [2].

Цель настоящей работы: определение антиоксидантной активности фитопрепаратов на основе родиолы розовой, а также исследование их влияния на ферментативные звенья антиоксидантной защиты печени.

В качестве объектов исследования служили фармакопейные препараты настойка корневищ родиолы розовой (Rhodiola rosea L.), сухой и жидкий экстракты родиолы розовой, а также индивидуальное соединение – розавин.

Исследование антиоксидантной активности фитопрепаратов, осуществляли на белых лабораторных крысах обоего пола массой 200-260 граммов, которые были разделены на группы по 10 штук в каждой. Крысы находились на обычном рационе вивария, были размещены в стандартных пластиковых клетках в помещении с температурой воздуха 18-25°С. Животные были вовлечены в эксперимент одновременно, что исключает влияние внешних температурных, климатических и иных факторов на разницу активности ферментов у опытных и контрольных групп животных. Во время эксперимента доступ крыс к воде и корму был свободным. Все эксперименты выполнялись в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Для воспроизведения токсического повреждения печени нами был выбран четыреххлористый углерод, который наиболее часто применяется в эксперименте с целью моделирования токсического гепатита [5]. В результате токсического повреждения печени в крови увеличивается уровень перекисного окисления липидов. В этой связи нами было применено многократное введение четыреххлористого углерода крысам в дозе 2,0 г/кг веса животного. Крысы забивались в соответствии с этическими нормами под эфирным наркозом методом декапитации. Печень крыс извлекалась, промывалась физиологическим раствором и сразу замораживалась в сосуде с твердой углекислотой («сухим льдом») при температуре -70-80°С. Затем из ткани печени готовился гомогенат для проведения анализа на содержание малонового альдегида (МДА), а также определения активности супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП) и каталазы. Гомогенат готовился механическим измельчением ткани печени массой 1 грамм с 5 мл фосфатного буфера (рН 7,4) со скоростью 5000 об/мин в сосуде с двойными стенками постоянно охлаждаемого проточной водой. Определение конечного продукта перекисного окисления липидов – МДА осуществляли на основе принципа, в соответствии с которым при высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), образуя окрашенный тримети-новый комплекс с максимумом поглощения при длине волны 532 нм, который и регистрируется фотометрически. К 0,5 мл гомогената добавляют 1 мл 15%-го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК), перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. К 1 мл надосадочной жидкости (центрифугат должен быть прозрачен) добавляют 2 мл 0,8%-го раствора ТБК. Пробирки помещают в кипящую водяную баню на 15 минут. После охлаждения в течение 30 минут пробы колориметрируют при 532 нм на фоне контроля (1 мл ТХУК и 2 мл ТБК). Количество МДА в пробах рассчитывают, используя молярный коэффициент экстинкции 1,56-105 М-1см-1.

Определение активности каталазы основано на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. Реакцию запускают добавлением 0,1 мл гомогената к 2 мл 0,03%-ного раствора перекиси водорода. В холостую пробу добавляют дистиллированную воду вместо исследуемой жидкости. Реакцию останавливают через 10 минут добавлением, 1 мл 4%-ного молибдата аммония. Интенсивность окраски измеряют на ФЭКе на длине волны 410 нм на фоне контроля (2 мл воды, 0,1 мл гомогената, 1 мл молибдата аммония). Активность каталазы рассчитывают по формуле: Е=(А хол.пр . – А оп.пр .) V К, t С белка печени, где V – объем гомогената (0,1 мл); К=22,2-103 мМ^-1см^-1; t – время (600 сек).

В гомогенате печени определяли также активность СОД-фермента, инактивирующего супероксидные радикалы и уменьшающего интенсивность перекисного окисления липидов. Су-пероксиддисмутаза относится к числу ферментов, входящих в состав антиоксидантной защитной системы организма. Активность СОД определялась по методу, описанному В.С.Гуревичем и др. [1]. В соответствии с данной методикой, гомогенат печени центрифугируют с охлаждением при 6000 об/мин в течение 10 мин. К 1 мл гомогената приливют 3 мл фосфатного буфера (рН 7,4), гомогенизируют и центрифугируют 15 мин при 5000 об/мин. К 0,5 мл верхней фазы добавляют 1 мл раствора хлороформа с метанолом (2:1) для осаждения гемоглобина. Смесь охлаждают и тщательно перемешивают в течение 10 мин. Затем содержимое пробирок центрифугируют для удаления гемоглобина и хлороформа.

Верхний слой отсасывают, добавляют несколько капель насыщенного раствора КН2РО4 и разводят фосфатным буфером в 20 раз. 0,2 мл раствора вносят в инкубационную смесь содержащую 57 мкМ нитросинего тетразолия (НСТ), 98,5 мкМ НАД∙Н, 16 мкМ феназинметасульфата (ФМС). Реакция протекает 10 мин в 0,5 М фосфатном буфере с ЭДТА (рН 8,3) при температуре 25°С в аэробных условиях. В контрольную пробу фермент не вносят. Затем измеряют оптическую плотность реакционной смеси при длине волны 540 нм.

Активность СОД рассчитывают по формуле: А=Т%/(100% – Т%), где А – активность фермента (в усл. ед.), рассчитанная на 1 мг белка (в г); Т% – процент торможения реакции восстановления НСТ или окисления адреналина в пробе за 1 мин (50% ингибирования этой реакции соответствует 1 усл. ед).

Определение активности глутатионпероксидазы (ГП) осуществляют в соответствии со следующей методикой [4]: 100 мкл гомогената преинкубируют с 830 мкл 0,1 М трис-НСl буфера (рН 8,5), содержащего 6 мМ ЭДТА и 12 мМ азида натрия, в течение 10 мин при 37°С, добавляют 70 мкл 20 мМ раствора гидроперекиси третичного бутила (готовят перед анализом разведением исходного реактива в 500 раз) и инкубируют точно 5 мин. Реакцию останавливают добавлением 200 мкл холодной ТХУК, осажденные белки удаляют центрифугированием. 100 мкл супернатанта вносят в 10 мл трис-НСl буфера и добавляют 100 мкл реактива Эллмана (0,01 М раствор дитионитробензойной кислоты в метаноле). Через 5 мин пробы фотометрируют при 412 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Контрольная проба отличается тем, что гомогенат вносят непосредственно перед осаждением белков. С учетом разведения биологического материала в данном методе и коэффициента молярной экстинкции ТНФА при 412 нм – 11400, рассчитывают активность ГП в микромолях, израсходованного в реакции субстрата по формуле: (Е контроля – Е опыта ) • 2147= мкМ/мин на 1 мг белка печени.

Для анализа данных выборок нами был применен t-критерий поправкой Бонферони. Полученные данные являлись выборками из генеральных совокупностей с нормальным распределением. Для статистической обработки данных нами был применен однофакторный дисперсионный анализ. Для статистического анализа средних выборок был использован t-критерий с поправкой Бонферони.

Результаты и их обсуждение. Результаты показаны в таблице.

Таблица. Влияние фитопрепаратов на активность ферментов и уровень ПОЛ

Из четырех исследованных препаратов только у родиолы экстракта жидкого, вводимого в дозе 150 мкл/кг, не выявлено воздействие на уровень малонового диальдегида и активность ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы. Родиолы экстракт сухой в дозе 150 мкл/кг, родиолы розовой настойка в дозе 150 мкл/кг и розавин в дозе 25 мг/кг достоверно снижают уровень малонового диальдегида. Наряду со снижением уровня малонового диальдегида розавин статистически достоверно повышает уровень каталазы и супероксиддисму-тазы и по своей активности превосходит остальные препараты, приготовленные на основе родиолы розовой. Это свидетельствует о хорошей перспективе использования в медицинской практике именно эссенциального фенилпропаноида, который и обусловливает достоверную эффективность остальных препаратов этой группы. Есть все основания считать, что повышение активности супероксиддисмутазы при введении родиолы розовой настойки крысам, отравленным четыреххлористым углеродом, в сочетании с понижением уровня малонового диальдегида, свидетельствует о наличии у данных препаратов выраженных гепатопротекторных свойств.