Применение GLAD-ПЦР-анализа для изучения метилирования ДНК в регуляторных областях генов-онкосупрессоров при раке молочной железы

В 2020 г. рак молочной железы (РМЖ) стал наиболее распространенным злокачественным новообразованием во всем мире: ~2,3 млн выявленных случаев составили 11,7 % от всех впервые зарегистрированных случаев рака. По числу летальных исходов (более 685 тыс.) РМЖ вышел на пятое место в структуре общей смертности от онкологических заболеваний [1]. Основная причина высокой смертности заключается в том, что в 40–70 % случаев диагностируется РМЖ III–IV стадий, что определяет неблагоприятный прогноз [2]. При раннем выявлении (стадии IA–IIB) РМЖ пятилетняя выживаемость достигает 99 % [3].

Наиболее перспективным направлением ранней диагностики РМЖ считается эпигенетический анализ: определение в ДНК опухолевых клеток метильных групп, присоединенных к цитозиновым основаниям в регуляторных участках генов- онкосупрессоров, уровень экспрессии которых при этом значительно снижается. Данная модификация геномной ДНК обнаруживается уже на начальных стадиях канцерогенеза, что имеет решающее значение для раннего выявления онкологических заболеваний, включая РМЖ [4].

GLAD-ПЦР-анализ включает три стадии: 1) гидролиз ДНК ферментом GlaI (G); 2) присоединение к концам гидролизованной ДНК с помощью ДНК-лигазы (L) специфического адаптера (AD); 3) ПЦР в режиме реального времени (степень метилирования сайта R(5mC)GY определяет значение порогового цикла (Cq)) (рис. 1). На последнем этапе используются геномный праймер и флуоресцентный зонд, комплементарные участку ДНК вблизи определяемого сайта GlaI, и второй (гибридный) праймер с нуклеотидной последовательностью 5’-CCTGCTCTTTCATCGGYNN-3’, где пятнадцать 5’-концевых нуклеотидов соответствуют адаптеру, а четыре 3’-концевых нуклеотида комплементарны геномной последовательности в точке гидролиза ДНК ферментом GlaI [6].

Благодаря субстратной специфичности ДНК-эндонуклеазы GlaI метод GLAD-ПЦР позволяет определять сайт R(5mC)GY в заданном положении генома даже в условиях избытка молекул ДНК, где этот сайт неметилирован. GLAD-ПЦР-анализ характеризуется более высокой чувствительностью и воспроизводимостью результатов в сравнении с методиками, основанными на бисульфитной конверсии ДНК (часто сопровождаемой деградацией и значительными потерями исследуемого материала) либо использующими метил-чувствительные эндонуклеазы рестрикции (не способные распознавать частично метилированную ДНК – наиболее характерный паттерн метилирования CpG-островков на самых ранних стадиях канцерогенеза). К важным преимуществам GLAD-ПЦР относятся также значительно меньшая трудоемкость и дороговизна исследования, отличающие применение специфичных метил-связывающих белков [6,11].

Целью исследования явилось применение GLAD-ПЦР-анализа для определения аберрантно метилированных сайтов R(5mC)GY в регуляторных областях генов-онкосупрессоров в препаратах ДНК из тканей РМЖ.

Материал и методы

Материалом для исследования служили образцы ДНК, выделенные из тканей опухолей молочной железы, полученных в ходе оперативного вмешательства у 30 женщин в возрасте от 52 до 78 лет (средний возраст – 63,1 ± 1,3 года, s=6,7). Операционный материал собран в мае – августе 2017 г. в КГБУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер» (г. Барнаул) и КГБУЗ «Областной клинический онкологический диспансер» (г. Кемерово). У большинства пациенток диагностирован инвазивный протоковый рак (n=22) различной степени дифференцировки. В остальных случаях был выявлен инвазивный дольковый (n=7) или смешанный (n=1) рак. У 9 больных установлена I клиническая стадия РМЖ (T1N0M0), у 16 – II стадия (T0–1N1M0, T2–3N0–1M0), у 5 – III стадия (T0–2N2M0, T3N1–2M0, T4N0–2M0, T0–4N3M0).

В зависимости от иммуногистохимических характеристик 3 опухолевых образца были отнесены к люминальному подтипу А, включающему гормонозависимые опухоли, положительные по рецепторам эстрогенов (РЭ) и прогестерона (РП), не имеющие рецепторов эпидермального фактора роста HER2, с низким индексом пролифератив-

Рис. 1. Схема метода GLAD-ПЦР

Fig. 1. Scheme of the GLAD-PCR method

ной активности (Ki67<20 %). Для 17 образцов определен люминальный подтип B, включающий HER2-негативные опухоли с высоким индексом пролиферативной активности (Ki67≥20 %), РЭ-положительные с низкими или отрицательными значениями РП, либо HER2-позитивные опухоли, РЭ-положительные с любыми значениями Ki67 и РП. Две опухоли были отнесены к HER2-позитивному подтипу (гормононезависимые (РЭ-, РП-) с избытком рецепторов HER2), 8 – к тройному негативному подтипу (РЭ-, РП-, HER2-). В качестве сравнительного контроля были использованы образцы ДНК, выделенные из фрагментов морфологически неизмененных тканей молочной железы, взятых у 22 больных на значительном удалении от опухолевого очага, на линии резекции.

Неоадъювантную химиотерапию больные не получали вследствие малой степени распространенности опухолевого процесса либо наличия сопутствующих заболеваний, расцененных на момент планирования лечения как фактор, способный привести к утяжелению общего состояния. У всех пациенток получено информированное согласие на участие в исследовании.

Каждый тканевой образец помещали в пробирку с раствором RNA-later и хранили в течение суток в холодильнике при температуре +4 °С, затем переносили в морозильную камеру и хранили при температуре -20 °С. Выделение и очистку ДНК проводили методом фенольно-хлороформной экстракции [7].

По результатам анализа опубликованных литературных данных нами был проведен предварительный отбор генов-онкосупрессоров, регуляторные области которых потенциально содержат метилированные сайты RCGY – эпигенетические маркеры РМЖ. При отборе учитывались следующие критерии: присутствие в регуляторной области гена минимум одного сайта RCGY; при наличии нескольких таких сайтов – расстояние между ними не менее 50 п.н., достаточное для одновременной гибридизации на данном участке ДНК геномного праймера и флуоресцентного зонда; возможность подбора для исследуемого участка ДНК праймера и зонда, теоретически не подверженных образованию вторичных структур, ауто- и кросс-димеров, а также гибридизации с последовательностью адаптера; GC-состав исследуемого участка ДНК, не превышающий 76 %; уникальность нуклеотидной последовательности исследуемого участка ДНК (невхождение его в состав повторяющихся элементов генома).

На основании приведенных критериев мы сформировали исходную панель из 24 генов, содержащих потенциально метилированные сайты RCGY: ALX4 [12], BMP2 [13], CCND2 [14], CDH13 [15], CDX1 [16], FOXA1 [17], GALR1 [18], GATA5 [19], GREM1 [14, 20], HIC1 [21], HMX2 [22], HS3ST2 [23], HOXC10 [24], ICAM5 [14], LAMA1

[25], RARB [26], RASSF1A [27], RUNX3 [28], RXRG [29], RYR2 [29], SFRP2 [14, 30], SOX17 [14], TERT [31], ZNF613 [32].

Для исследования потенциальных эпигенетических маркеров РМЖ в составе регуляторных участков генов-онкосупрессоров подбирали специфичные системы праймеров и флуоресцентных зондов (табл. 1). Для этого использовали нуклеотидные последовательности из базы данных GenBank по версии генома человека GRCh38.p13, семейство программ «Vector NTI 11.5» (Invitrogen, США) и онлайн-ресурс «BLAST» .

В ходе предварительных экспериментов в регуляторной области каждого гена выявляли максимально метилированный сайт R(5mC)GY. Для всех сайтов RCGY, расположенных в пределах 200 п.н. от участка гибридизации геномного праймера и флуоресцентного зонда, определяли гибридные праймеры, комплементарные концевым тетрануклеотидам, получаемым после гидролиза последовательности NNR(5mC) ↓ GYNN. Наименьшее значение Cq в ПЦР в режиме реального времени указывало на максимальную степень метилирования сайта R(5mC)GY [6,7].

Для постановки всех этапов GLAD-ПЦР применяли реагенты производства ООО «Сибэнзайм». Ферментативный гидролиз ДНК проводили в течение 30 мин при 30 °С. Реакционная смесь (объемом 21,5 мкл) включала 9,0 нг ДНК исследуемого образца, 1× SE-буфер TMN (10 мМ Трис-HCl (pH 7,9), 5 мМ MgCl ₂ , 25 мМ NaCl), 2,0 % диметилсульфоксида (ДМСО), 2,0 мкг бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 1,5 ед. акт. эндонуклеазы GlaI. Для лигирования продуктов гидролиза с адаптером (в объеме 30,0 мкл) к каждой пробе добавляли АТР до конечной концентрации 0,5 мМ, универсальный двухцепочечный адаптер (5’-CCTGCTCTTTCATCG-3’/3’-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5’, где p – фосфатная группа) до конечной концентрации 0,5 мкМ и 240 ед. акт. высокоактивной T4-ДНК-лигазы. Реакцию проводили в течение 15 мин при 25 °С. На заключительной стадии в реакционную смесь вносили компоненты ПЦР до следующих концентраций в конечном объеме 60,0 мкл: 1×SE-буфер GLAD (50 мМ Трис-SO ₄ (pH 9,0), 30 мМ KCl, 10 мМ [NH ₄ ] ₂ SO ₄ ), 3 мМ MgCl ₂ , смесь dNTP до 0.2 мМ каждого, 0,1 мкг/мкл БСА, соответствующую смесь двух праймеров и зонда до 0,4 мкМ каждого, 0,04 ед. акт./мкл SP Taq-ДНК-полимеразы. Для повышения эффективности амплификации GC-богатых участков генов GATA5 , GREM1 , HIC1 , ICAM5 и RUNX3 в ПЦР-смесь дополнительно добавляли ДМСО до концентрации 4 %. Затем по 20,0 мкл полученной смеси переносили в три отдельные микропробирки и проводили ПЦР в режиме реального времени в детектирующем амплификаторе «CXF-96» (Bio-Rad Lab., США) по программе:

Таблица 1/table 1

Геномные праймеры и флуоресцентные зонды, применявшиеся для исследования генов, потенциально содержащих онкомаркеры РМЖ

genomic primers and fluorescent probes used to study genes potentially containing breast cancer tumor markers

Генa/ Genea	Наименование белкового продуктаa/ Protein product namea	Хромосомная локализация генаa/ Chromosomal gene localizationaa	Структура геномных праймеров/ флуоресцентных зондовb/ Structure of genomic primers/fluorescent probesb
ALX4	ALX homeobox 4	11p11.2	CGTCAACAACCTCTCATCC FAM-TCCATTTCTTATTTCAGTTTGCCACCA-BHQ1
BMP2	bone morphogenetic protein 2	20p12.3	CGAGTTGCGGCTGCTCAGC FAM-CCTGAAACAGAGACCCACCCCCAGC-BHQ1
CCND2	cyclin D2	12p13.32	GAAAGGCAACCCCCCCCAA FAM-CGTCTTGGCCTCAGGTCCCCGC-BHQ1
CDH13	cadherin 13	16q23.3	GCTGGCTGGCGAGGCAGA FAM-CCTCTCCTCAAAGCCTGGCTCCCAC-BHQ1
CDX1	caudal type homeobox 1	5q32	CAGCTTCGCTGGCATTCGG FAM-CCCCCTCCAGACTTTAGCCCGGTGC-BHQ1
FOXA1	forkhead box protein A1	14q21.1	FAM-TCTCCTTCCATCTTGGCCTCGGCTC-BHQ1 AGAGGCTGGGAGCTGGACGA
GALR1	galanin receptor 1	18q23	FAM-TGCAGCAGAGAAGCCCCTGGCACC-BHQ1 GGCGAGAGCTCTTTTGGGAGGC
GATA5	GATA binding protein 5	20q13.33	FAM-CCGAGCCCGCAGCCCCCC-BHQ1 CCCCTCGATGCTGTCCTACCTGT
GREM1	gremlin 1, DAN family BMP antagonist	15q11-13	FAM-CTCCGCCCACTCACATCCCTGCC-BHQ1 GAGCGGGTCCTGGGTTGGTT
HIC1	hypermethylated in cancer 1	17p13.3	FAM-CTTGTAGTCGTCGCCGTCGCCGC-BHQ1 GGCTGGGGTCCTCGCTGCTA
HMX2	H6 family homeobox 2	10q26.13	CCAAGGGGTCCAAGGAGTCGG FAM-CCGCAGCCGCCAGGAACCCG-BHQ1
HS3ST2	heparan sulfate-glucosamine 3-O-sulfotransferase 2	16p12.2	GCCTCCCGGAGGAGTACTATGCC FAM-CACCTTCGTTTCACCGCCCCAAAGC-BHQ1
HOXC10	homeobox protein C10	12q13.13	GAGGGGGGCAGGGGAGAG FAM-CCCAGGAGGCCCCAGACCATTTC-BHQ1
ICAM5	intercellular adhesion molecule 5	19p13.2	FAM-CTCCCTCCCAGGCCCCGCCC-BHQ1 AGGGGGAAGAGTCCGCAGCTC
LAMA1	laminin, alpha 1	18p11.31	FAM-CTGACCGCGGCCGCCTCCC-BHQ1 CCACCTTCTCTGCCCACCTCCTA
RARB	retinoic acid receptor, beta	3p24	TTCAGAGGCAGGAGGGTCTATTC FAM-TCCCAGTCCTCAAACAGCTCGCATGG-BHQ1
RASSF1A	Ras association domain family member 1	3p21.31	ATGTCGGGGGAGCCTGAG FAM-TGCCAGCTCCCGCAGCTCAAT-BHQ1
RUNX3	runt related transcription factor 3	1p36.11	CCGGGGAGGGAGGTGTGAA FAM-CCGTAGACCCAAGCACCAGCCGC-BHQ1
RXRG	retinoid X receptor, gamma	1q22-q23	GCCGCCGTCACCGCTACT FAM-CCACCGCCGTCGCTGCTGC-BHQ1
RYR2	ryanodine receptor 2 (cardiac)	1q43	FAM-TTTCCCCCAAGTCAAGGTGCTGCGAAA-BHQ1 GGGGACCACGGAGGCGACT
SFRP2	secreted frizzled related protein 2	4q31.3	CCAGCCCTCCTCGGATTACCC FAM-CTCCCTTGCTCCCCCCACCCTCC-BHQ1
SOX17	SRY (sex determining region Y)-box 17	8q11.23	CGCCCTCCGACCCTCCAA FAM-TCCCGGATTCCCCAGGTGGCC-BHQ1
TERT	telomerase reverse transcriptase	5p15.33	FAM-CTCCCTGCAACACTTCCCCGCGA-BHQ1 AAAGAGAAATGACGGGCCTGTGTC
ZNF613	zinc finger protein 613	19q31.41	GTGTTGCGGGGAGCTCTCG FAM-CCTCGCTCGGAGTTCGTTTCGCAG-BHQ1

Примечание: a – обозначение, хромосомная локализация полное и наименование белковых продуктов генов приводятся согласно указаниям Международного комитета по номенклатуре генов – HUGO Gene Nomenclature Committee [33]; b – структура прямого или обратного геномного праймера приводится соответственно перед или после структуры зонда. В последовательности флуоресцентных зондов FAM – 6-карбоксифлуоресцеин, BHQ1 – Black Hole Quencher 1.

Note: a – designation, chromosomal localization, and the full name of protein products of genes are given according to the instructions of the International Committee on Gene Nomenclature – HUGO Gene Nomenclature Committee [33]; b – the structure of the forward or reverse genomic primer is listed, respectively, before or after the structure of the probe. In the sequence of fluorescent probes FAM – 6-carboxyfluorescein, BHQ1 – Black Hole Quencher 1.

Таблица 2/table 2

Сайты RcgY, отобранные для glad-ПЦР-анализа, их локализация в геноме и структура соответствующих им гибридных праймеров

RcgY sites selected for glad-pcR analysis, their localization in the genome and the structure of the corresponding hybrid primers

Ген/Gene	Сайт/Site	Координаты сайтаa/ Site coordinatesa	Структура гибридного праймераb/ Hybrid primer structureb
ALX4	ACGT	chr11:44304756-44304759	CCTGCTCTTTCATCGGTСC
BMP2	ACGC	chr20:6770341-6770344	CCTGCTCTTTCATCGGTCC
CCND2	GCGC	chr12:4274691-4274693	CCTGCTCTTTCATCGGCGG
GALR1	GCGC	chr18: 77249828-77249831	CCTGCTCTTTCATCGGCGG
HMX2	ACGC	chr10:123147940-123147943	CCTGCTCTTTCATCGGTCT
HS3ST2	GCGT	chr16:22814023-22814026	CCTGCTCTTTCATCGGCGG
RARB	ACGC	chr3: 25428374–25428377	CCTGCTCTTTCATCGGTTC
SOX17	GCGC	chr8: 54458724-54458727	CCTGCTCTTTCATCGGCCG
ZNF613	GCGC	chr19: 51887759-51887762	CCTGCTCTTTCATCGGCGT

Примечание: a – координаты сайта даны в соответствии с последней сборкой генома человека GRCh38.p13; b – подчеркнут 3’-концевой тетрануклеотид гибридного праймера, комплементарный последовательности ДНК в точке гидролиза GlaI.

Note: a – Site coordinates are given according to the latest assembly of the human genome GRCh38.p13; b – The 3’-tetranucleotide of the hybrid primer complementary to the DNA sequence at the GlaI hydrolysis point is underlined.

3 мин при 95 ^о С и 45 циклов – 10 c при 95 °С, 15 с при 61 °С, 20 с при 72 °С. Для устранения влияния возможных начальных флуктуаций на форму кривой амплификации флуоресценцию на первых пяти циклах ПЦР не детектировали.

Скрининг наиболее часто метилированных сайтов R(5mC)GY в составе регуляторных областей генов-онкосупрессоров проводили на ограниченных выборках из 10 препаратов ДНК, исследуя все образцы в трех повторах. Критерием отбора сайта для последующего анализа всей коллекции образцов ДНК опухолевых (n=30) и морфологически неизмененных тканей (n=20) больных РМЖ служило среднее значение Cq ≤ 30, полученное по меньшей мере для одного из 10 образцов. Поскольку степень метилирования сайтов RCGY в регуляторных областях части исследуемых генов не удовлетворяла указанному критерию, из дальнейшей работы были исключены сайты в составе генов CDH13 , CDX1 , FOXA1 , GATA5 , GREM1 , HIC1 , HOXC10 , ICAM5 , LAMA1 , RASSF1A , RUNX3 , RXRG , RYR2 , SFRP2 и TERT . Сайты R(5mC)GY, отобранные для исследования полной коллекции клинических образцов ДНК из тканей больных РМЖ, и соответствующие им гибридные праймеры приведены в табл. 2.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программного обеспечения «MedCalc 15.11» (MedCalc Software, Бельгия). Исходя из значений Cq в ПЦР в режиме реального времени, для анализируемых маркеров вычисляли точки отсечения – пороговые величины Cq, дифференцирующие положительные и отрицательные случаи. Результаты работы алгоритма визуализировали с помощью характеристических кривых (ROC-кривые; англ. Receiver Operating

Characteristic Curves) – графиков зависимости процента верно диагностированных положительных случаев (чувствительность) от процента ложноположительных случаев (100-специфичность) для различных возможных значений диагностического теста. Площадь под ROC-кривой (ППК) является интегральным показателем диагностической эффективности маркера (для «идеального» теста ППК=1) [34].

Для отбора оптимальной комбинации маркеров с максимальным суммарным значением ППК, которая дает возможность наиболее результативно дифференцировать образцы ДНК из опухолевых и морфологически неизмененных тканей, применяли метод логистической регрессии. Данный алгоритм позволяет анализировать связи между несколькими независимыми переменными (значения Cq, пропорциональные степени метилирования исследованных сайтов R(5mC)GY) и зависимой переменной (принадлежность образца к опухолевым или морфологически неизмененным тканям).

Результаты и обсуждение

На рис. 2 отображены результаты GLAD-ПЦР-анализа метилированных сайтов RCGY в препаратах ДНК из клинических образцов, на рис. 3 – ROC-кривые, полученные при статистической обработке данных GLAD-ПЦР девяти сайтов R(5mC) GY. В табл. 3 приведены числовые значения параметров, рассчитанных для каждого из исследованных маркеров: показателей чувствительности и специфичности, величины ППК, выраженной в виде доли от всей площади квадрата с указанием стандартной ошибки измерения, и 95 % доверительного интервала.

Характерным эпигенетическим нарушением при канцерогенезе является локальное гиперметилирование так называемых CpG-островков в регуляторных областях генов-онкосупрессоров, которые в норме не содержат метильных групп. В настоящее время показано, что подобное аберрантное метилирование характерно для начальных стадий большинства ненаследственных (спорадических) форм рака, составляющих в среднем более 90 % всех случаев злокачественных новообразований [4]. Описано большое количество генов с разнообразными биологическими функциями, регуляторные области которых характеризуются различиями уровня метилирования ДНК в клетках РМЖ и морфологически неизмененных тканей [14, 32].

GLAD-ПЦР-анализ сайтов R(5mC)GY в генах ALX4 , BMP2 , CCND2 , GALR1 , HMX2 , HS3ST2 , RARB , SOX17 и ZNF613 показывает, что значения Cq для маркеров BMP2 , CCND2 , GALR1 , HMX2 , HS3ST2 и ZNF613 , связанные отрицательной корреляционной зависимостью со степенью метилирования сайта [6], в большинстве образцов ДНК РМЖ в среднем на шесть и более циклов ниже значений Cq в образцах ДНК из морфологически неизмененных тканей. В то же время для маркера ALX4 это различие минимально (менее 1,5 циклов), что обусловливает перекрывание диапазонов стандартных отклонений и делает невозможным использование данного маркера для выявления опухолевых тканей. Для сайтов R(5mC)GY в составе генов SOX17 и RARB разность средних величин Cq для двух групп ДНК-образцов составляет около трех циклов, но в последнем случае отмечается большой разброс индивидуальных значений (рис. 2).

Статистический анализ результатов GLAD-ПЦР (рис. 3 и табл. 3) демонстрирует, что сайты R(5mC)GY в составе генов CCND2 , BMP2 , GALR1 , SOX17 , HMX2 и HS3ST2 характеризуются наиболее сбалансированным соотношением чувствительности и специфичности теста. Полученные значения ППК более 0,8 свидетельствуют, согласно общепринятым критериям оценки данных ROC, о высоком диагностическом потенциале указанных маркеров [34].

Комплексный анализ данных ROC с применением метода логистической регрессии показывает, что комбинация маркеров CCND2 , BMP2 , GALR1 , SOX17 , HMX2 и HS3ST2 , охватывая всю коллекцию исследованных образцов, дает максимальную величину ППК=0,988 и позволяет дифференцировать образцы ДНК из опухолевых и морфологически неизмененных тканей с наибольшей эффективностью. Как видно из табл. 3, суммарные показатели чувствительности и специфичности для панели эпигенетических маркеров РМЖ составляют соответственно 90,0 и 100 %.

Полученные результаты хорошо коррелируют с опубликованными ранее данными по метилированию генов в тканях РМЖ, полученными с применением метода бисульфитной конверсии с последующим проведением метил-специфичной ПЦР [13, 23] либо секвенированием на NGS-платформе [14, 18, 22, 32]. При этом обращает внимание, что для 4 подтипов РМЖ, дифференцируемых по рецепторному статусу опухолей (люминальный А, люминальный В, HER2-позитивный, тройной негативный), обнаружены различия в профиле метилирования генов-онкосупрессоров, включая представленные в табл. 3 гены CCND2, GALR1, SOX17, HMX2, HS3ST2 и ZNF613 [14, 18, 22, 23, 26, 32].

Z. Li et al. показали, что аберрантное метилирование регуляторных участков генов CCND2 и SOX17 ассоциировано с развитием люминальных подтипов А и В [14]. Согласно данным S.K. Kas-sim et al., для люминального подтипа В характерно также гиперметилирование промотора гена HS3ST2 [23]. В клетках РМЖ HER2-позитивного подтипа детектируется аберрантное метилирование генов GALR1 , SOX17 и ZNF613 [14, 18, 32]. По данным C. Stirzaker et al., гиперметилирование промотора, обусловливающее инактивацию гена HMX2 , является отличительным признаком тройного негативного подтипа РМЖ [22].

По результатам ROC-анализа данных GLAD-ПЦР, полученных нами при исследовании сайтов R(5mC)GY в вышеназванных генах, большинство исследованных образцов РМЖ по каждому из маркеров определяются как положительные (табл. 3). Это относится и к генам GALR1 , ZNF613 и HMX2 , аберрантное метилирование которых ассоци-ировано с подтипами РМЖ, представленными в исследованной нами выборке незначительным числом образцов. Отмеченное несоответствие может быть связано с тем, что в предшествующих работах оценивали статус метилирования всего пула CpG-динуклеотидов в составе изучаемых генов, в то время как метод GLAD-ПЦР выявляет сайты R(5mC)GY в конкретных позициях генома человека (табл. 2), метилирование которых может быть общим признаком всех подтипов РМЖ.

Выводы, сделанные в перечисленных исследованиях, основывались на сравнении средних значений степени метилирования ДНК в выборках образцов тканей без определения частотных показателей метилирования или экспрессии генов для групп «РМЖ» и «морфологически неизмененная ткань». Такие данные описаны для генов BMP2 , RARB и ALX4 , также представленных в табл. 3.

M. Du et al. выявили значимое снижение уровня экспрессии мРНК BMP2 в 23 из 32 (71,88 %) исследованных образцов тканей РМЖ, соответствующее высокой частоте (68,75 %) аберрантного метилирования регуляторной области гена [13]. Выполненное нами исследование показало абсолютную диагностическую специфичность сайта RCGY в составе гена BMP2 – все образцы морфо-

Рис. 2. Результаты GLAD-ПЦР анализа выбранных R(5mC)GY сайтов в препаратах ДНК из образцов тканей больных РМЖ. По оси ординат приведены значения Cq с диапазонами стандартных отклонений. По оси абсцисс указаны номера исследованных образцов тканей (о – опухоль, н – неизмененная ткань на линии резекции)

Fig. 2. Results of GLAD-PCR analysis of selected R (5mC) GY sites in DNA preparations from tissue samples from breast cancer patients. The ordinate shows Cq values with standard deviation ranges. The abscissa shows the numbers of the tissue samples examined (o – tumor, н – unchanged tissue on the resection line)

Рис. 3. ROC-кривые, полученные для результатов GLAD-ПЦР-анализа сайтов R(5mC)GY в препаратах ДНК из опухолевых и морфологически неизмененных тканей больных РМЖ. По оси ординат приведены показатели чувствительности (%); по оси абсцисс – процент ложноположительных случаев (100-специфичность) для различных значений диагностических тестов

Fig. 3. ROC curves obtained for the results of GLAD-PCR analysis of R (5mC) GY sites in DNA preparations from tumor and morphologically unchanged tissues of breast cancer patients. The ordinate shows the sensitivity indicators (%), the abscissa shows the percentage of false-positive cases (100-specificity) for different values of diagnostic tests

логически неизмененных тканей определяются как отрицательные (табл. 3).

При исследовании 48 пар образцов тканей, полученных от больных РМЖ, K. Yari et al. показали, что метилированные формы гена RARB обнаруживаются исключительно в опухолевых образцах с частотой 10,4 % [26]. Анализ данных, полученных нами для эпигенетического маркера RARB , также выявил низкий уровень диагностической чувствительности (табл. 3).

J. Yang et al. наблюдали инактивацию гена ALX4 при метилировании промотора во всех трех исследованных клеточных линиях РМЖ и в 69,44 % (75

из 108 образцов) первичных опухолей, тогда как в неизмененных тканях молочной железы этот ген не был метилирован [12]. Однако в проведенном нами исследовании сайта R(5mC)GY в гене ALX4 около трети образцов неизмененных тканей были определены как положительные (табл. 3).

Подобные расхождения могут быть обусловлены, в частности, особенностями морфологических характеристик РМЖ в выборках, исследованных разными авторами. Известно, что гистологически РМЖ представляет собой весьма разнородную группу злокачественных новообразований, которые могут различаться по профилю метилирования

Таблица 3/table 3

Данные Roc-анализа результатов glad-ПЦР, полученных при исследовании сайтов R(5mc) gY в образцах ДНК из опухолевых и морфологически неизмененных тканей больных РМЖ (в порядке уменьшения значений ППК)

data of Roc analysis of glad-pcR results obtained in the study of R(5mc)gY sites in dNa samples from tumor and morphologically unchanged tissues of breast cancer patients (in order of decreasing auc values)

Ген/ Gene	о у ч £ S      У ей D D S ^ U S о и U S и =- ^ ° S я 8 н ® И ®   S g “ S й 9   ” и 2 К и « S й Л  Р  О (Й 45 СТО   О > g Ч   и У Ю G  wo о I  s »	ч	1 М о g S ч ® 5 1 1 « у & to seo ® й 2 Й „ * а 8 5 8 о 2 и	о   5   & м ®    к й 2 и S   ^ Ьр g р О О о м О 5 § Эд ti 0J ^ М О р ^ у о н "о У Р4 О tj х  у ру о 5 S » ° в 1 ° S    g Q 2 ел и Р У Он     S       ! Ю    Р D S О   ^ "^ о	и	О о Н о	1 S б PC
CCND2	26/30	86,7 %		21/22	95,5 %	0,926 (0,038)	0,818–0,980
BMP2	21/30	70,0 %		22/22	100 %	0,914 (0,039)	0,803–0,974
GALR1	25/30	83,3 %		22/22	100 %	0,913 (0,036)	0,801–0,973
SOX17	26/30	86,7 %		19/22	86,4 %	0,905 (0,048)	0,791–0,968
HMX2	25/30	83,3 %		20/22	90,9 %	0,894 (0,047)	0,777–0,962
HS3ST2	23/30	76,7 %		20/22	90,9 %	0,845 (0,059)	0,718–0,931
ZNF613	24/29	82,8 %		16/22	72,7 %	0,828 (0,058)	0,697–0,919
ALX4	24/29	82,8 %		16/22	72,7 %	0,762 (0,072)	0,622–0,870
RARB	9/29	31,0 %		21/22	95,5 %	0,599 (0,081)	0,452–0,734
Комбинация генов
CCND2, BMP2, GALR1, SOX17, HMX2, HS3ST2	27/30	90,0 %		22/22	100,0 %	0,988 (0,011)	0,909–1,000

ДНК. Помимо основных форм (неинвазивный/ инвазивный внутрипротоковый и дольковый рак) описан целый ряд особых вариантов РМЖ: папиллярный, тубулярный, аденокистозный, секреторный, апокриновый, метапластический, болезнь Педжета и др., на общую долю которых приходится до 20–25 % всех случаев заболевания [35]. Кроме того, нельзя исключить зависимости статуса метилирования генов от расово-этнической принадлежности пациенток [36].