Применение клеточной инженерии для создания константного исходного селекционного материала капусты белокочанной сорта Надзея и ЦМС-образцов

Внастоящее время в Республике Беларусь под капустой белокочанной занято около 17 тыс. га, из них 1,8-2,0 тыс. га ежегодно выращивается в сельскохозяйственных предприятиях и фермерских хозяйствах. Остальные посадки находятся на приусадебных и дачных участках граждан. В Государ- ственном реестре сортов и древеснокустарниковых пород Республики Беларусь доля отечественных сортов и гибридов капусты составляет примерно десятую часть сортимента, и большинство регистрируемых наименований представлено гибридами F1. Для ускорения селекционного процесса капусты в Беларуси необходимо привлекать дополнительные современные методы получения исходного материала. Одним из таких методов является создание удвоенных гаплоидов, позволяющий ускорить получение генетически стабильных линий, облегчающий поиск редких признаков, контролируемых рецессивными генами, и существенного повышающий эффективность селекционного процесса [1, 2].

Гаплоиды и удвоенные гаплоиды, полученные у видов рода Brassica в культуре пыльников или изолированных микроспор, служат материалом для получения константных гомозиготных линий для производства гибридных семян. Для многих видов рода Brassica разработаны различные методики для культуры пыльников и микроспор. В связи с этим в РУП «Институт овощеводства» НПЦ по картофелеводству, овощеводству и плодоводству НАН Беларуси в сотрудничестве с кафедрой генетики биологического факультета БГУ проводится работа по созданию удвоенных гаплоидов овощных культур: капусты белокочанной, томата, моркови столовой [3] и внедрение полученных результатов в селекционный процесс.

Объекты иметоды исследований

В эксперименте использовали растения капусты белокочанной среднепозднего сорта отечественной селекции Надзея и два образца капусты с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС). Сорт капусты Надзея получен методом гибридизации от свободного переопыления голландских образцов Краут-кайзер и Краутман с последующим индивидуально-семейственным отбором. Сорт урожайный (70-80 т/га). По сравнению с сортами Белорусская 85 и Русиновка более устойчив к слизистому и сосудистому бактериозам. Сорт предназначен для потребления в свежем виде, квашения и хранения в хранилищах с регулируемым температурно-влажностным режимом до февраля-марта. Оба образца капусты с ЦМС характеризуются дегенерацией пыльников на начальных этапах развития цветка.

Растения-донорны клеток для культивирования in vitro выращивали из штеклингов, полученных осенью 2011 года, в лабораторных условиях. В качестве экспланта использовали пыльники. Нераскрывшиеся бутоны стерилизовали в 1% растворе гипохлорита натрия в течение 10 мин, а затем промывали в дистиллированной воде. Из бутонов в асептических условиях выделяли пыльники. Экспланты переносили на питательную среду, содержащую БАП и НУК в концентрации 4 мг/л [4]. Появившиеся первичные побеги доращивали на питательной среде с добавлением цитокининов. Побеги высотой более 2 см разделяли на междоузлия. Ткани междоузлия надрезали, чтобы обеспечить доступ 0,05% раствора колхицина по 0,5 мл/междоузлие в течение 24 ч для индукции полиплои-дизации и получения удвоенных гаплоидов. Затем междоузлия пересаживали на среду для индукции кор-необразования. Пробирки с растительным материалом инкубировали при температуре 23…25°C, относи- тельной влажности воздуха 90% и 16-часовом фотопериоде. После корнеобразования растения-регенеранты адаптировали к почвенным условиям и высаживали в закрытый грунт для получения маточных растений. Выращенные маточные растения весеннего срока высадки достигали фазы полного формирования кочана в сроки, соответствующие группе спелости исходного образца, маточники июньского срока высадки формировали штеклинги – недоразвитые растения, которые убирали целиком с корнями. Маточные растения хранили в специальном хранилище, оборудованном активной вентиляцией, в контейнерах корнями внутрь. Температура хранения составляла +1…1,5 °C при относительной влажности воздуха 90-95%. В период хранения удаляли подгнившие листья. За полтора месяца до посадки температуру воздуха в хранилище повышали до +4…5 °C для ускорения яровизации и индукции цветоносных побегов. За 3-4 недели до высадки в грунт вырезали семенные кочерыги, сохраняя верхушечную почку, и высаживали их в пленочную необогре-ваемую теплицу для получения семян.

Цитологический анализ проводили подсчетом хромосом в митотических клетках корневого чехлика у пробирочных растений. Окрашивание хромосом проводили согласно методу Feulgen [5].

Результаты и их обсуждение

В ходе эксперимента в течение 11,5 мес. культивирования пыльников получены растения-регенеранты капусты белокочанной сорта Надзея и сортообразцов с ЦМС. Частота получения регенерантов составляла 1:10-20/эксперимент пыльников в зависимости от генотипа растения. В ходе культивирования in vitro первичных регенерантов определяли уровень их плоидности. В результате отобраны гаплоидные (n=9) андрогенные регенеранты сорта Надзея и об- разцов с ЦМС. При создании удвоенных гаплоидв обработкой пазушных меристем колхицином наблюдалось образование миксоплоидных химерных растений с различным или кратным 9 числом хромосом. В процессе культивирования, после черенкования побега и роста клонов наблюдали развитие различных генотипов пробирочных растений, 50-100% из которых отбраковывали. Таким образом происходило создание не химерных растений. Перед использованием для адаптации проводили дополнительный цитологический анализ и отбирали растения с диплоидным набором хромосом.

В результате экспериментов по адаптации высаженных растений установлено, что все предлагаемые в методической литературе способы [6, 7, 8] являются приемлемыми, однако в данном эксперименте обладают различной эффективностью. На первых этапах привыкания растений к новому воздушному режиму «открывание крышек в пробирках» было сходно по результатам при «пересадке растений в агроперлит». При переносе пробирочных растений в почву наблюдали гибель до 100 % растений от почвенных инфекций, несмотря на то, что после извлечения из пробирок растения обрабатывали раствором фунгицида (фунда-зол, 1 г/л). Растения, помещенные в агроперлит, практически не подвергались атакам инфекций, однако после 7-10 суток их необходимо было переместить в почвенный субстрат, где наблюдалось начало роста побега. Растения регулярно поливали, проводили профилактические обработки инсектицидом (актара, 1 г/л) и фунгицидом (квадрис, 100 мл/л) [9].

В 2012 году наблюдали рост и развитие кочанов у клонов андрогенных растений исследуемых генотипов. Внутри клона растения были практически идентичными. Каждый генотип сохранял основные хозяйственные свойства исходного сорта (образца).

Как показано на рисунке, сохранившиеся андрогенные растения капусты белокочанной в генеративной фазе развития различались по морфологическим параметрам: высоте, количеству генеративных побегов, размеру, форме, окраске цветка, количеству пыльцы, что позволяло отобрать исходные растения, селекционно-ценные для семеноводства культуры.

Аналогичные эксперименты проведены с использованием модельных андрогенных растений на основе исходных образцов с ЦМС, которые в генеративной фазе характеризовались стерильностью за счет дегенерации пыльников. Однако среди них выявлен образец, сформировавший частично развитые пыльники.

Выводы

В ходе научных экспериментов получены андрогенные растения капусты белокочанной на основе генотипов сорта Надзея и двух образцов с ЦМС. Морфологические отличия между растениями андрогенного клона можно установить на второй год вегетации при их переходе к генеративной фазе развития.

Применение технологии удвоенных гаплоидов для капусты белокочанной при соблюдении двухлетнего цикла развития растений позволяет получить h=153 см

h=150 см

a  bc

Рис. 1. Генеративная фаза роста развития андрогенных растений капусты белокочанной сорта Надзея, 2013 год.

Вверху – общий вид растения, внизу – цветок, a – образец BcH2-1, b – BcH2-2, c – BcH2-3.

семена андрогенных растений на третий год после начала эксперимента.